瘦素对乳腺癌生长细胞动力学和形态学影响的研究

目的：研究瘦素对乳腺癌细胞株MCF-7细胞生长的作用。方法：分别使用0、25、50、100和200nmol／L瘦素作用于细胞株MCF-7细胞，同时在上述作用后24、48和72h采用光学显微镜观察细胞形态学改变，采用MTT比色方法，观察不同浓度瘦素对MCF-7细胞生长刺激的剂量、时间效应，比较在相对应剂量胰岛素情况下，二者对细胞增殖刺激作用的强弱。结果：加用瘦素各组细胞比未加瘦素细胞密度增加，形态变异。与正常对照组相比，各浓度瘦素（25、50、100和200nmol／L）均可明显促进MCF-7细胞增殖，其中50、100和200nmol／L瘦素作用24、48和72h后差异均有统计学意义，P〈0．05。瘦素对MCF-7细胞的增殖作用呈现一定的时间和剂量依赖效应。胰岛素各相对应组之间与瘦素比较，细胞增殖刺激作用差异无统计学意义，P〉0．05。结论：瘦素对乳腺癌细胞株MCF-7细胞增殖有刺激作用，且这种作用呈现一定的剂量、时间依赖效应，结果提示瘦素是促进乳腺癌细胞增殖的因素之一。     

瘦素对人类乳腺癌细胞MCF-7增殖及凋亡的影响

 目的 观察不同浓度瘦素对人类乳腺癌细胞MCF-7增殖及凋亡的影响,探讨瘦素在乳腺癌发生及发展中的作用。方法 采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测不同浓度瘦素对体外培养的MCF-7细胞生长的增殖作用,流式细胞术分析细胞周期的分布, Annexin V-FITC／PI染色法检测细胞凋亡。结果 MTT比色法结果显示：不同浓度瘦素作用24、48、72 h能够促进MCF-7细胞增殖,浓度与时间不存在交互作用（F＝0.919,P＝0.523）,浓度及时间各自的主效应均差异有统计学意义（F＝12.699,P＝0.000; F＝647.881,P＝0.000）。多重比较结果显示：200　ng／ml及400　ng／ml瘦素组与对照组相比差异有统计学意义（P＝0.007;P＝0.000）,不同时间段之间均差异有统计学意义（P＝0.000）。流式细胞术分析显示100、400 ng／ml瘦素作用48 h后,G0／G1期细胞比例下降14.42 %（F＝10.464,P＝0.044）,S期比例分别上升7.57 %、22.19 %（F＝47.361,P＝0.005）,G2／M期变化差异无统计学意义（F＝1.77,P＝0.311）。未发现瘦素对MCF-7细胞早期凋亡的抑制作用。结论 瘦素能够促进乳腺癌细胞MCF-7的增殖并改变生长周期,但不会抑制凋亡,提示瘦素可能在乳腺癌的发展中发挥促进作用。     

瘦素对乳腺癌细胞Survivin表达影响的观察

目的:观察瘦素对乳腺癌细胞(T47D) Survivin表达的影响.方法:取对数生长期人乳腺癌细胞T47D,以5×104个/孔种植于48孔板,分别进行以下处理,C组:为对照组,饥饿后不做任何处理;L组:以10 nmol/L瘦素处理细胞.蛋白质印迹法测定Survivin蛋白表达的水平.RT-PCR测定SurvivinmRNA的表达.结果:蛋白质印迹法检测结果示,T47D细胞经10 nmol/L瘦素作用2h后,Survivin蛋白的表达增强.采用瘦素(10 nmol/L)分别作用T47D细胞30 min和60 min后,瘦素能促进T47D细胞Survivin mRNA的表达,与对照组相比Survivin mRNA的表达量是对照组的(2.15±0.19)和(4.55±0.23)倍.结论:瘦素可以上调乳腺癌T47D细胞Survivin的表达.     

蛋白质精氨酸甲基转移酶2在乳腺癌细胞中的表达及其对SKBR-3细胞生长特性的影响

目的:探讨蛋白质精氨酸甲基转移酶2(protein arginine methyltransferase 2,PRMT2)基因在多种乳腺癌细胞株中的表达情况,以及外源性PRMT2基因过表达对乳腺癌SKBR-3细胞生长特性的影响.方法:采用real-time RT-PCR法检测PRMT2基因在不同乳腺癌细胞株中的表达,并建立稳定表达pcDNA3.1/NT-GFP-PRMT2的SKBR-3细胞株;激光共聚焦显微镜下观察外源性PRMT2蛋白在细胞中的定位,检测在雌激素和雌激素受体(estrogen receptor,ER)拮抗剂4-OHT作用下过表达PRMT2基因对SKBR-3细胞增殖的影响.结果:PRMT2基因在ERα阳性乳腺癌细胞株中表达水平明显高于ERα阴性乳腺癌细胞株;在转染PRMT2基因的SKBR-3细胞株中,雌激素反应元件-荧光素酶报告基因(estrogen response elements-luciferase reporter,ERE-luc)的转录活性明显升高.在无处理因子情况下,外源基因PRMT2在SKBR-3细胞中的表达对细胞的形态及生长速度无明显影响.与未转染及转染GFP空载体的SKBR-3细胞相比,稳定转染PRMT2基因的SKBR-3细胞对雌激素的敏感性明显下降,但其对4-OHT处理的敏感性降低无明显差异.结论:PRMT2基因表达的多少及部位与乳腺癌细胞中ERα的表达密切相关.外源性PRMT2基因在乳腺癌SKBR-3细胞中稳定表达使细胞对雌激素的敏感性降低,但不增加细胞对ER拮抗剂4-OHT的耐药性.     

Livin反义寡核苷酸对人乳腺癌细胞株MCF-7增殖和凋亡影响的研究

目的：探讨Livin mRNA反义寡核苷酸（ASODN）对人乳腺癌MCF-7细胞抑制增殖及诱导凋亡的影响。方法：设计合成特异性的Livin硫代磷酸ASODN及其对照错义寡核苷酸（MSODN）,脂质体转染至培养的MCF-7细胞。采用MTT法检测Livin ASODN对MCF-7细胞的增殖抑制作用,RT-PCR检测Livin mRNA的表达水平,电镜、流式细胞仪与吖啶橙／溴化乙锭（AO／EB）细胞染色法检测细胞凋亡水平和形态学改变。结果：Livin ASODN在终浓度为600nmol／L作用MCF-7细胞48h时,能明显地抑制其增殖（IC50=604.4）,降低Livin mRNA的表达;电镜、流式细胞仪与A0／EB细胞染色法则表明MCF-7细胞在形态学上出现明显的凋亡改变,细胞凋亡率显著增加,而对照组寡核苷酸未见抑制效应。结论：Livin ASODN能够特异性下调MCF-7细胞中Livin基因表达,在诱导肿瘤细胞凋亡、抑制增殖中发挥重要作用。     

乳腺癌组织瘦素和瘦素受体表达及其临床意义的研究

目的:检测Leptin和Ob-R在乳腺癌中的表达,并探讨其临床意义.方法:用免疫组化的方法检测60例乳腺癌、30例乳腺良性病变及30例癌旁正常乳腺组织中Leptin和0b-R的表达.结果:乳腺癌Leptin和Ob-R表达与癌旁乳腺组织相比差异有统计学意义(P1=0.000;P2=0.000),乳腺癌Leptin和Ob-R表达与乳腺良性病变相比差异亦有统计学意义(P1=0.000;P2=0.000),而乳腺良性病变和癌旁乳腺组织相比差异均无统计学意义(P1=0.169;P2=0.545);乳腺癌中有淋巴结转移组Leptin和Ob-R表达与无淋巴结转移组相比,差异均有统计学意义(P=0.036);乳腺癌不同TNM分期与Leptin和Ob-R表达均呈正相关(P J=0.021,γ1=0.297;P2=0.007,γ2=0.342).结论:瘦素可以作为诊断乳腺癌、判断乳腺癌分期和预后的辅助手段,能够为乳腺癌治疗提供新的思路.     

肿瘤坏死因子-α对乳腺癌细胞CD44表达调控及其影响细胞迁徙机制的探讨

目的:检测肿瘤坏死因子(TNF-α)对乳腺癌细胞株MDA-MB-231中CD44s、CD44V3和CD44V6表达的调控及其对细胞迁徒力的影响,并探讨TNF-α调节CD44可能存在的信号途径.方法:用RT-PCR和蛋白质印迹法检测TNF-α(0、2、20和200 ng/mL)作用乳腺癌细胞后其CD44 mRNA和蛋白的表达情况,Transwell方法检测TNF-α作用后细胞迁徒能力的改变;以浓度为20 ng/mL的TNF-α处理MCF-7和MDA-MB-231后,用蛋白质印迹法检测MAPK(JNK、p38和ERK)信号通路中蛋白磷酸化水平变化,对磷酸化水平增加的蛋白用特异性抑制剂预处理后检测CD44的表达及细胞迁徙能力的改变.结果:TNF-α作用后MDA-MB-231细胞CD44s、CD44V3、CD44V6mRNA和蛋白表达水平均上调;迁徙力增加了22%～90%;TNF-α作用MDA-MB-231细胞后p38磷酸化水平升高;用p38的特异性抑制剂预处理后可以逆转CD44表达和细胞迁徒力的改变.结论:TNF-α通过p38途径对MDA-MB-231细胞CD44表达进行调控,CD44的表达可以增强肿瘤细胞的迁徙力.     

5-aza-2''''deoxycytidine联合trichostatin A抑制乳腺癌细胞增殖能力的研究

背景与目的：晚近报道应用DNA甲基转移酶抑制剂5-aza-2’deoxycytidine（AZA）联合组蛋白去乙酰化酶抑制剂trichostatin A（TSA）作用于多种肿瘤，可以达到治疗肿瘤的目的。本文在此探讨通过AZA联合TSA作用，抑制乳腺癌细胞株增殖能力。方法：联合应用两种药物作用于肿瘤细胞，应用RT—PCR的方法检测MDA—MB-435细胞株p21和p27的mRNA转录水平的改变。通过WST方法来检测乳腺癌细胞的增殖能力变化，将MDA—MB-435细胞根据药物处理共分四组：①对照组；②AZA＋TSA组；③AZA＋TSA＋4-OH TAM组；④4-OH TAM组。并且采用流式细胞仪来分析肿瘤细胞周期分布的改变，将MDA—MB-435分成另外四组：①对照组；②AZA＋TSA组；③AZA＋TSA＋E2组；④AZA＋TSA＋E2＋4-OH TAM组。结果：TSA以及AZA联合应用能使肿瘤细胞MDA—MB-435的p27的mRNA水平增加，而p21mRNA水平略减弱。增殖分析的四个组中：AZA＋TSA组细胞增殖能力减弱（P〈0．01），同时出现细胞阻滞于S期，加入雌激素后细胞阻滞稍减弱。AZA＋TSA＋4-OH TAM组增殖能力进一步减弱（P〈0．01）。4-OH TAM组增殖能力没有改变。细胞周期分析的四个组中：AZA＋TSA组出现细胞阻滞于S期，AZA＋TSA＋E2组细胞阻滞稍减弱。AZA＋TSA＋E2＋4-OH TAM组细胞阻滞再次提高。结论：两种药物联合应用能使得乳腺癌肿瘤细胞增殖能力下降，对于肿瘤细胞有一定抑制作用。     

瘦素对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响及调控机制的研究

目的：研究瘦素对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响及对雌、孕激素受体和VEGF的mRNA表达水平的影响，进而揭示瘦素对乳腺癌MCF-7细胞系作用的分子生物学机制。方法：体外培养人乳腺癌MCF-7细胞系，分为对照组、瘦素组和雌激素组。给药后用MTT法测570nm分光光度值。实时荧光定量PCR法观察各组雌、孕激素受体及VEGF的mRNA表达水平。结果：与对照组相比，瘦素可以呈时间和剂量依赖的方式促进MCF-7细胞增殖，并上调细胞中雌、孕激素受体及VEGF的mRNA表达水平，P〈0．05。结论：瘦素有促进乳腺癌细胞增殖的作用，该作用的发挥可能与其上调雌、孕激素受体与VEGF的表达有关。为乳腺癌的内分泌治疗提供了新的理论依据。     

丹皮酚对乳腺癌细胞的生长抑制作用

[目的]研究丹皮酚（Pae）对人乳腺癌细胞的作用及机制。[方法]采用MTT法检测Pae对乳腺癌Bcap37、MDA-MB．453细胞的增殖抑制作用,流式细胞仪检测Pae对Bcap37和MDA-MB-453细胞凋亡和周期分布的影响,WesternBlot检测相关蛋白表达。[结果]Pae对乳腺癌Bcap37及MDA-MB-453细胞均具有增殖抑制作用,并呈时间和剂量依赖性;流式细胞仪分析细胞凋亡率呈浓度依赖性,细胞周期分析显示Pae阻滞Bcap37及MDA-MB-453细胞在G1期;WestemBlot检测凋亡相关蛋白Caspase7、Caspase3和PARP表达减少,而P-FEN蛋白表达增加。[结论]Pae对乳腺癌细胞系具有增殖抑制作用,其机制可能与促进细胞凋亡及引起细胞周期阻滞。PrEN表达上调有关。     

经典激活巨噬细胞促进乳腺癌细胞贴壁和非贴壁克隆形成

目的 探讨经典激活巨噬细胞(M1)对乳腺癌细胞贴壁和非贴壁克隆形成的影响,进一步阐明M1促乳腺癌进展的作用.方法 用密度梯度离心法,从健康成人外周血中分离单个核细胞,体外诱导M1.在乳腺癌细胞与巨噬细胞的无血清共培养体系中,做平板克隆实验;在M1-乳腺癌细胞软琼脂培养体系中,做非贴壁克隆形成实验,检测M1对乳腺癌贴壁克隆和非贴壁克隆形成的影响.结果 在M1的作用下,乳腺癌SK-3rd细胞贴壁克隆和非贴壁克隆形成的能力均增强(P＜0.001).结论 M1促进乳腺癌细胞贴壁克隆和非贴壁克隆的形成.     

乳腺癌患者血清瘦素及胰岛素样生长因子-1检测的临床意义

目的:探讨乳腺癌患者血清瘦素(leptinLEP)、胰岛素样生长因子-1(insulin-likegrowthfactor-1,IGF-1)检测的临床意义。方法:采用酶标记免疫吸附法测定女性乳腺癌、乳腺良性病变患者血清中LEP、IGF-1的浓度,并与其他临床资料进行对比分析。结果:LEP、IGF-1浓度在乳腺癌组与乳腺良性病变组、乳腺癌腋窝淋巴结转移组阳性与阴性组比较差异有统计学意义,P<0·05。乳腺癌组与乳腺良性疾病组LEP、IGF-1浓度与月经状态有关,P<0·05。结论:血清LEP、IGF-1水平与女性乳腺癌患者的预后及月经状态有关。     

盖诺与顺铂联合化疗加同期放射对乳腺癌MCF-7细胞作用的研究

目的：探讨盖诺（NVB）联合顺铂（DDP）的放化同期治疗乳腺癌的有效性、时机选择和作用机制。方法：NVB和DDP（NP方案）对乳腺癌MCF-7细胞联合化疗同期放射。比较照射加联合化疗组和单纯照射组、不同间隔时间联合化放疗的细胞存活率（SF）、凋亡和细胞周期阻滞差异。结果：联合化疗加同期放射后SF较单独放疗更低。化疗处理后间隔4、12和36h照射的SF值最低,0h居中,而阃隔48和72h后,SF值明显上升,放化疗协同杀灭效应减弱,SF最低与最高值相差约15倍。联合化疗加照射组细胞凋亡指数（AI）明显高于单独放射和联舍化疗组。6、8Gy放射后36h时,放化疗联合组与单独放射组比较A1分别高达30．7％、38．35％和2．22％、3．27％,差异有统计学意义,P〈0．05。化疗处理MCF-7细胞1h后在间隔4、12、36和72h处,G2／M周期细胞比例较高,0.48h处较低。结论：联合化放疗对乳腺癌MCF-7细胞具有较强的协同杀灭作用,化放联合治疗的时机选择在肿瘤细胞杀灭过程中具有重要的意义,这种协同杀灭作用与增加细胞凋亡率和化疗造成的细胞G2／M周期阻滞有关。     

递呈乳腺癌细胞MCF-7肿瘤抗原的树突状细胞对T细胞的激活

目的：在体外利用细胞因子的诱导获取树突状细胞（DC）,并观察递呈肿瘤抗原后的成熟DC对T细胞的激活作用。方法：健康人外周血单个核细胞（PBMC）在体外用细胞因子诱导获取DC,并经乳腺癌细胞MCF-7肿瘤细胞裂解物体外冲击,再以1：5的比例将致敏DC与T细胞共同孵育5d并共同作为效应细胞,通过FACS分析T细胞激活前后的表型变化以及MTT试验观察体外特异性肿瘤杀伤效果。结果：DC在细胞因子的诱导下7d后,形态学表现为伸出许多伪足样突起,在摄取抗原后可见内吞样小泡。FACS检测呈现成熟DC的标志,CD40、CD83、CD80、CD86和HL-DR等高表达。另外,未经成熟DC激活的T淋巴细胞以辅助性T细胞（Th）为主,CD4^＋ 52．1％,CD8^＋ 仅22．1％;而经成熟DC激活的T淋巴细胞以杀伤性T细胞（Tc）为主,CD4^＋ 32．6％,CD8^＋ 64．2％。同时,MTT试验证实经递呈MCF-7肿瘤抗原的DC激活了细胞毒性T淋巴细胞（CTL）,并对MCF-7具有特异性肿瘤杀伤作用。结论：体外递呈肿瘤抗原MCF-7的成熟DC对T细胞具有激活作用,并产生肿瘤特异性CTL。     

人端粒酶逆转录酶(hTERT)特异性siRNA对乳腺癌细胞hTERT水平及细胞生长影响的研究

背景与目的:在肿瘤细胞中端粒酶高水平的表达是肿瘤细胞永生化的重要因素。本研究利用人端粒酶逆转录酶(hTERT)的小干扰RNA(siRNA)特异性地抑制乳腺癌细胞的hTERT,通过研究该效应对细胞生长、凋亡和永生化相关基因的影响,来进一步阐述端粒酶在肿瘤细胞永生化可能的作用。方法:通过实时定量RT-PCR(Real-TimeRT-PCR)测定各乳腺癌细胞系中内源性hTERT的表达水平及测定RNA干扰对与细胞永生化相关基因的调节;通过脂质体转染法将hTERTsiRNA导入MCF7细胞;通过细胞生长曲线和流式细胞仪(FACS)评价该特异性的siRNA所诱导的hTERT水平下调对细胞生长和凋亡的影响。结果:所检测的乳腺癌细胞系中,hTERT均相对高表达。hTERTsiRNA可抑制MCF7中hTERT的水平,并在抑制后的第4天开始表现出显著的细胞生长抑制,并出现凋亡,以及多个细胞永生化相关的基因,如RAC1、PCYT2、FDFT1和ATP5G2,表达水平均下调50%以上。结论:hTERTsiRNA可特异性地抑制hTERTmRNA水平,从而抑制细胞生长,导致细胞凋亡,并下调多个细胞永生化基因。     

NONO基因沉默对乳腺癌细胞生物学特性影响研究

目的 无POU域八聚体结合蛋白(non-POU domain containing octamer-binding protein,NONO)是一种参与多种核内事件的多功能核蛋白,NONO与某些肿瘤的发生密切相关.本研究旨在探讨NONO基因沉默对乳腺癌细胞(SKBR3)增殖、迁移和侵袭生物学特性的影响.方法 用含有靶向人NONO基因shRNA的慢病毒感染SKBR3细胞,并用嘌呤霉素进行筛选,通过蛋白质印迹法检测SKBR3细胞中NONO蛋白表达,建立稳定的NONO基因沉默的SKBR3细胞系;采用CCK-8法和平板克隆实验检测NONO基因沉默对SKBR3细胞增殖的影响;通过体外Transwell迁移和侵袭实验检测NONO基因沉默对SKBR3细胞迁移和侵袭能力的影响.结果 蛋白质印迹法实验结果显示,SKBR3、NONO基因沉默的SKBR3(SKBR3-NONO-si)和阴性对照SKBR3(SKBR3-NC)组细胞NONO蛋白表达相对灰度值分别为0.716 7±0.225、0.103±0.045和0.727±0.127,差异有统计学意义,F=16.699,P=0.004,表明成功地建立了稳定的NONO基因沉默的SKBR3细胞系.CCK-8实验结果显示,细胞接种后7d,SKBR3、SKBR3-NONO-si和SKBR3-NC细胞CCK-8吸光度值分别为1.717±0.233、0.566±0.158和1.110±0.187,差异有统计学意义,F=78.469,P＜0.001;平板克隆形成实验结果显示,细胞培养14 d后,SKBR3、SKBR3-NONO-si和SKBR3-NC组形成的克隆数分别为64.667±14.84、21.167±7.414和53.667±11.587,差异有统计学意义,F=16.333,P＜0.001;以上结果均说明,NONO基因沉默抑制SKBR3细胞增殖能力.Transwell迁移实验结果显示,细胞接种后20 h,SKBR3、SKBR3NONO-si和SKBR3-NC组迁移细胞数分别为62.333±7.767、44.667±7.637和85.333±11.930,差异有统计学意义,F=14.338,P=0.005;侵袭实验结果显示,细胞接种后40 h,SKBR3、SKBR3-NONO-si和SKBR3-NC组侵袭细胞数分别为27.667±7.024、24.666±3.512和81.000±5.568,差异有统计学意义,F=97.558,P＜0.001;与SKBR3-NC细胞相比,NONO基因沉默的SKBR3-NONO-si细胞迁移和侵袭能力均明显降低.结论 NONO基因沉默抑制SKBR3细胞增殖、迁移和侵袭,提示NONO可能是促进乳腺癌细胞增殖、转移和侵袭一个新的重要调控蛋白.     

5-Aza-CdR诱导抑癌基因PTEN重新表达对乳腺癌细胞的影响及机制

目的观察5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对人乳腺癌细胞系MCF-7增殖、凋亡及体外侵袭能力的影响并初步探讨其机制。方法体外培养MCF-7细胞,采用不同浓度的5-Aza-CdR(1×10-6、2×10-6、5×10-6和1×10-5mol/L)分别作用24h、48h和72h,分别采用MTT法检测细胞增殖抑制率、流式细胞仪检测细胞凋亡、Transwell法检测细胞侵袭能力、Western-blot检测PTEN和VEGF-C蛋白表达的变化。结果经不同浓度的5-Aza-CdR作用后,MCF-7细胞的增殖受到不同程度的抑制并发生凋亡,细胞侵袭能力也发生不同程度的降低,且其作用随浓度增加和时间延长而增强(P<0.05)。在5-Aza-CdR作用后,MCF-7细胞PTEN的表达逐渐增强,而VEGF-C的表达逐渐减弱。结论 5-Aza-CdR可抑制乳腺癌细胞增殖、诱导其发生凋亡、降低其体外侵袭能力,其可能是通过去甲基化作用使抑癌基因PTEN重新表达并下调VEGF-C的表达而发挥作用的。