肠杆菌科细菌质粒介导喹诺酮类耐药基因的检测

目的调查肠杆菌科细菌中质粒介导喹诺酮类耐药基因（PMQR基因）的现状、基因型以及PMQR基因阳性菌株携带Ⅰ类整合子的情况及其相关性。方法PCR法对125株肠杆菌科细菌（80株大肠埃希菌、18株肺炎克雷伯菌和27株阴沟肠杆菌）进行PMQR基因和Ⅰ类整合子检测。对阳性扩增产物进行测序分析并对阳性菌株做接合试验,采用琼脂倍比稀释法测定供体菌、受体菌和接合子对喹诺酮类和其他抗菌药物的MIC。结果125株肠杆菌科细菌检出16株（12．8％）qnr基因阳性,其中8株携带qnrS1基因,8株携带qnrB6基因;另检出15株（12．0％）携带aac（6’）-Ib-cr基因。20株PMQR基因阳性菌株携带I类整合子。26株PMQR基因阳性的菌株中有12株接合成功,典型Ⅰ类整合子阳性的菌株中有7株接合成功。与受体菌相比,喹诺酮类等抗菌药物对接合子的MIC值均有不同程度的提高。结论肠杆菌科细菌中存在PMQR基因的流行,PMQR阳性菌株可同时携带整合子基因,这些耐药基因均具有水平转移的特性,故应引起高度重视。     

细菌耐喹诺酮的分子机制研究

目前氟喹诺酮广泛使用于尿路复合感染、胃肠道感染、呼吸系统感染、性传播疾病以及慢性骨髓炎。自从氟喹诺酮类显示出其良好的临床疗效后,它在人类医药和食用动物中的需求都飞速增长。氟喹诺酮的耐药是染色体介导的突变,有涉及靶基因包括DNA解旋酶(gyrA和gyrB)和拓朴酶IV(parC和parE),或药物的蓄积量降低或被泵出。本文主要就耐喹诺酮的分子机制作一综述。     

细菌对喹诺酮类药物的耐药机制

细菌获得喹诺酮类药物耐药的机制有:①药物作用靶位的结构基因突变致DNA旋转酶和拓扑异构酶IV突变;②控制细菌通透性或主动外排机能的调控基因突变致菌体内药物浓度下降而达不到抑制靶酶所需的浓度.这两种机制皆由染色体介导,迄今为止,只有一例报道金黄色葡萄球菌中发现质粒介导的主动外排喹诺酮类药物,但未得到证实,事实上不少喹诺酮类能消除质粒,阻止质粒的转移.目前还未发现有针对喹诺酮类药物的水解酶或钝化酶等[1-3].     

肠杆菌科细菌质粒介导喹诺酮耐药基因qnr的研究

目的 调查武汉大学人民医院分离的肠杆菌科细菌中质粒介导喹诺酮类耐药基因qnrA、qnrB、qnrS基因的现状、基因型以及qnr基因阳性菌株所携带的广谱B内酰胺酶基因型.方法 PCR法对179株肠杆菌科细菌(129株大肠埃希菌、37株肺炎克雷伯菌和13株阴沟肠杆菌)进行qnrA、qnrB、qneS基因检测.KB纸片法检测对15种抗菌药的体外抗菌活性.琼脂平皿二倍稀释法检测阳性菌株对环丙沙星的MIC值.质粒接合试验分析qnrA、qnrB、qnrS基因的水平转移能力.对qnr阳性株,检测Ⅰ类整合酶基因及SHV-1、TEM-1、CTX-M、OXA-Ⅰ、OXA-Ⅱ、OXA-Ⅲ、DHA、EBC型β内酰胺酶基因.结果 179株肠杆菌科细菌中,共检测出含qnr基因阳性菌株25株(13.97%),包括6株(3.35%)含有qnrA基因,9株(5.02%)含有qnrB基因,10株(5.59%)含有qnrS基因.阳性株菌均对亚胺培南敏感且对多种抗生素耐药,其中2株qnrA阳性菌株和4株qnrB阳性菌株对喹诺酮类药物敏感.2株qnrA阳性菌株和4株qnrB及qnrS阳性菌株质粒接合成功.23株qnr阳性株Ⅰ类整合酶基因阳性,1株qnrB及qnrS阳性菌株Ⅰ类整合酶基因阴性,14株菌携带TEM-1型广谱β内酰胺酶基因、6株菌携带OXA-Ⅲ型广谱β内酰胺酶基因、7株菌携带EBC型AmpC酶.结论 湖北地区肠杆菌科细菌中存在qnrA、qnrB、qnrS基因的流行,qnr阳性菌株呈多重耐药,且喹诺酮类敏感菌株中有qnr基因的存在.qnr阳性菌株可携带多种广谱p内酰胺酶基因.     

临床分离黏质沙雷菌染色体及质粒介导的喹诺酮类耐药机制研究

目的 了解安徽地区临床分离株黏质沙雷菌质粒介导喹诺酮类耐药基因的流行情况以及gyrA、parC基因变异对抗菌药物的耐药性产生的影响.方法 采用琼脂稀释法测定2005至2010年34家医院收集的104株黏质沙雷菌的MIC;采用PCR检测其中31株耐环丙沙星的黏质沙雷菌的qnr、aac(6’) -Ib、qepA基因以及gyrA和parC基因,对阳性扩增产物进行测序分析;对qnr、aac(6’) -Ib-cr阳性菌株做转移接合试验,PCR扩增并测序确定接合子的基因型,测定供体菌、受体菌和接合子对喹诺酮类及其他类型抗菌药物的MIC.结果 共检出31株环丙沙星耐药的黏质沙雷菌,共6株携带qnr基因和(或)aac(6’)-Ib-cr基因,其中2株携带qnrB6亚型,1株携带qnrS2亚型,4株携带aac(6’)-Ib-cr基因(其中1株同时携带qnr基因).9株检测出gyrA基因突变,7株检测出parC基因突变.6株携带qnr基因和(或)aac(6’)-Ib-cr基因的菌株中有5株转移接合成功.接合子与受体菌相比,对喹诺酮类的MIC值均有不同程度的提高.结论 染色体及质粒介导的耐药基因在临床分离的黏质沙雷菌对喹诺酮类药物耐药中起重要的作用,且可以水平传播,故应引起高度重视.     

武汉地区门诊患者喹诺酮耐药鼠伤寒沙门菌耐药机制分析

目的 研究分析腹泻门诊患者中分离的喹诺酮耐药鼠伤寒沙门菌的耐药机制和遗传关系.方法 对2002-2005年问武汉同济医院腹泻门诊患者中分离的36株喹诺酮耐药鼠伤寒沙门菌进行了耐药谱测定,并通过PCR方法和序列测定对整合子、β内酰胺酶基因、喹诺酮耐药决定区的突变、qnr基因和aac(6')-Ib-cr基因进行了分析,运用脉冲场电泳方法(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)对所收集的菌株进行了分子分型,分析喹诺酮耐药鼠伤寒沙门菌的耐药机制和遗传关系.结果 喹诺酮耐药鼠伤寒沙门菌均为多重耐药株,普遍携带有Ⅰ类整合子,环丙沙星耐药菌株与敏感菌株在PFGE谱型上存在显著性差异,31株环丙沙星耐药菌株在喹诺酮耐药决定区中至少携带GyrA和ParC上的3个点突变,且在这些菌株中均检出了OXA-30基因,这些菌株对头孢吡肟的敏感性出现了不同程度的下降.结论 对环丙沙星耐药的鼠伤寒沙门菌在武汉地区已普遍存在,且这些菌株具有独特的遗传背景,建议在今后的细菌耐药性监测工作中应对这类细菌的耐药谱变化进行重点监测,尤其应加强对氟喹诺酮-三代头孢类抗菌药物均耐药菌株的针对性预警监测.     

肺炎克雷伯菌质粒介导喹诺酮类耐药基因qnrA、qnrB和qnrS的研究

目的调查我院临床分离的产超广谱β-内酰胺酶的肺炎克雷伯菌中,质粒介导的喹诺酮类耐药基因qnrA、qnrB和qnrS的存在情况,为临床预防感染及合理使用抗菌药物提供依据。方法收集2007年7月至2008年12月间临床分离的产超广谱β-内酰胺酶的肺炎克雷伯菌57株,用PCR法检测qnrA、qnrB和qnrS基因,并对部分阳性菌株进行测序。采用E-test方法测定阳性菌株的药敏情况。结果 57株肺炎克雷伯菌中,25株(43.9%)检出qnr基因,其中3株(5.3%)含qnrA基因,21株(36.8%)含qnrB基因,20株(35.1%)含qnrS基因;3株(5.3%)qnrA、qnrB和qnrS同时阳性,13株(22.8%)qnrB和qnrS同时阳性。结论我院产超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌质粒介导的喹诺酮类耐药基因qnr携带率很高,临床上应加强喹诺酮类耐药基因的检测,以避免产qnr基因菌株的感染爆发流行。     

人型支原体对喹诺酮类药物耐药的分子机制研究

人型支原体(mycoplasma hominis,Mh)是人类泌尿生殖系统感染的常见病原菌,其单独感染不常见,只有0.8%常与解脲脲原体混合感染[1-2]。其不仅可感染泌尿生殖系统引起子宫内膜炎、盆腔炎、不孕、自然流产、早产、胎膜早破、产后感染等,还可引起非泌尿生殖系统感染,特别是免疫力低下的人群[3-5]。     

新质粒介导喹诺酮耐药基因qnrB24的基因分析

目的对新的质粒介导喹诺酮耐药基因(qnrB24)进行相关研究和分析。方法对新发现的qnrB24基因阳性菌株进行转移接合实验,了解qnrB24对喹诺酮类药物的耐药性,碱裂解法提取接合子质粒,Southern blot明确质粒大小。采用热不对称交错聚合酶链反应(PCR)技术研究基因5′端以及3′端未知侧翼碱基序列。结果这个突变基因命名为qnrB24(Genbank登录号HM192542)。药敏试验结果显示携带qnrB24基因接合子对环丙沙星的最小抑菌浓度(MIC)值为0.125μg/mL,左氧氟沙星MIC值为0.190μg/mL。接合子对常见氟喹诺酮类抗菌药物的敏感性较大肠杆菌J53受体菌下降约8~11倍,接合子耐药水平低于临床分离菌株。Southern杂交显示该基因位于约60.0Kb质粒上。热不对称交错PCR结果显示,qnrB24基因5′端为假定的转座酶。结论 qnrB24通过质粒介导引起细菌对喹诺酮类药物的耐药性上升,容易发展成高水平耐药,因此需要监测其在细菌中的流行性。     

一个新qnr基因亚型的克隆表达及其多重耐药机制的研究

目的研究1株临床分离产酸克雷伯菌中qnr基因新亚型的生物学特性及其多重耐药机制。方法克隆表达qnr新亚型基因，并用聚合酶链反应（PCR）检测β内酰胺酶基因和Ⅰ类整合酶基因的存在情况。结果qnr基因转化子对常见氟喹诺酮类抗菌药物的敏感性较受体菌下降3—25倍，但耐药水平低于临床分离菌株4—256倍。在产酸克雷伯菌中同时检出KLUC-1型超广谱β内酰胺酶（ESBLs）、TEM-1型和OXA-30型广谱β内酰胺酶基因。结论qnr基因可以轻度增加氟喹诺酮类药物的耐药性。携带qnr基因的临床菌株同时携带多种耐药基因。     

中国九家教学医院肠杆菌科细菌质粒介导的喹诺酮耐药机制研究

目的 研究质粒介导的喹喏酮类的耐药基因qnr和aac(6')-Ib-cr在我国肠杆菌科临床株中的分布状况.方法 从全国9家教学医院收集的421株非重复的4种肠杆菌科细菌[大肠埃希菌(eco)、肺炎克雷伯菌(kpm)、阴沟肠杆菌(ecl)、弗劳地柠檬酸杆菌(cfr)]中,按环丙沙星(CW)≥0.25μg/ml、头孢噻肟(CTX)≥2.0μg/ml、头孢曲松(cno)≥2.0μg/ml的条件筛选出197株,其中cfr30株,ecl 35株,eco 77株,kpm 55株.采用PCR检测筛选菌株的qnrA、qnrB、qnrS和aac(6')-IB质粒介导耐药基因;并以内切酶BtsCI酶切消化aac(6')-Ib PCR阳性产物以确定aac(6')-Ib-cr.接合试验确定喹诺酮耐药的可转移性;用琼脂稀释法测定接合子及其供体菌和受体菌对环丙沙星及其他抗菌药的MIC值.结果 在197株筛选出的肠杆菌科细菌中,qnr共检出83株,总阳性率为42%(83/197),其中qnrA有17株(9%),qnrB有46株(23%),qnrS有24株(12%);qnrA和qnrB同时阳性有2株,qnrB和qnrs同时阳性有2株.aac(6')-Ib共检出90株(46%),aac(6')-Ib-cr共检出36株(18%).qnr和aac(6')-Ib-cr同时阳性的有18株.在ecl、kpn、cfr、eco中,qnr的阳性率分别为66%、66%、63%、6%,aac(6')-Ib-cr阳性检出率分别为9%、22%、27%、17%.qnr和aac(6')-Ib-cr在所有的4种肠杆菌科细菌中的阳性率分别为20%(83/421)和9%(36/421).质粒接合试验获得了13株接合子,环丙沙星对接合子的MIC范围为0.125～1μg/ml,相差8倍;接合子与受体菌相比,CIP的耐药性提高了16～125倍,左氧氟沙星的耐药性提高了16～31倍.结论 在中国,qnr和aac(6')-Ib-cr相关的质粒介导喹诺酮类耐药性在肠杆菌科临床分离株中分布广泛;qnr和aac(6')-Ib-cr能介导喹诺酮低水平耐药,这可能是我国细菌对喹诺酮类耐药性上升迅速的重要原因.     

针对gyrA基因突变的反向斑点杂交技术快速检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药性的研究

目的 建立快速检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药性的反向斑点杂交(reverse dot blot hybridization,RDBH)技术,并观察其效果。方法 针对结核分枝杆菌gyrA基因序列及常见的突变位点,分别设计1条野生型和7条突变型探针,建立RDBH技术,对临床分离结核分枝杆菌菌株进行喹诺酮耐药性检测,以比例法药敏试验和DNA测序做对照。结果 应用比例法药敏试验、DNA测序、RDBH三种方法分别检测59株喹诺酮耐药株和51株喹诺酮敏感株,与比例法相比,RDBH试验灵敏度和特异度分别为69.49%(41/59)、100%(51/51),符合度为83.63%;而RDBH与DNA测序结果比较,敏感度和特异度分别为97.56%(40/41),98.55%(68/69),符合度达98.18%。结论 RDBH技术检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药具有良好的灵敏度、特异度和符合度。     

鲍曼不动杆菌对喹诺酮类药物的耐药机制分析

目的 探讨鲍曼不动杆菌（Acinetobacterbaumanii,Ab）对喹诺酮类药物的耐药机制。方法收集2007年11月至2008年10月全国多省市21家医院院内下呼吸道感染住院患者痰标本2698份进行培养鉴定,对Ab分离株进行药敏检测,采用聚合酶链反应对Ab的不同耐药基因进行扩增,并进行序列分析。结果2698份痰标本共计培养出39株Ab。对环丙沙星耐药率为61．54％,对左氧氟沙星耐药率为53．85％。39株Ah中有30株（76．92％）发生parC基因突变,19株（48．72％）发生gyrA基因突变,15株同时发生parC基因和gyrA基因突变。结论Ab对喹诺酮类药物耐药机制主要与gyrA、parC基因突变有关。     

Molecular cloning and sequence analysis of the cDNA encoding human apolipoprotein H (β2-Glycoprotein I)*

Summary Apolipoprotein H, also known as β-₂-glycoprotein I, was purified from human serum, and antiserum produced to denatured apolipoprotein H detected a cDNA clone from a γ gt11 library derived from human liver. This cDNA coded for the complete sequence of the mature protein. The cDNA insert, along with a polymerase chain reaction product which extended the 5′ end of the message, were subcloned and both strands were sequenced. The apolipoprotein H precursor was found to code for 345 amino acids, 326 of which appear in the mature protein. The deduced amino acid sequence of human apolipoprotein H differs from its rat homologue by the presence of a 48-amino acid stretch which is absent from the rat protein. The remainder of the proteins share a greater than 80% similarity. The amino acid sequence of apolipoprotein H consists largely of repeated units approximately 60 amino acids in length. These repeats are comparable to “sushi structures” found in a large number of diverse proteins, including complement components, receptors and regulators of complement activation, serum proteins, membrane-associated adhesion proteins, and other structural and catalytic proteins. Apolipoprotein H was shown to be transcribed by human hepatoma cell lines Hep 3B and Hep G2, and rat liver by detection of mRNA using northern blot analysis. The nucleotide sequence data were deposited in the GenBank Nucleotide Sequence Database, accession number M62839 (April 4, 1991)     

鲍曼不动杆菌对喹诺酮类药物的耐药机制研究

目的探讨鲍曼不动杆菌对喹诺酮类药物的耐药机制。方法收集我院2006年5月—2007年2月不同患者痰培养标本中分离的鲍曼不动杆菌80株,剔除重复菌株用肉汤稀释法测定菌株在环丙沙星、含有不同浓度羟基氰氯苯胺(CCCP)的环丙沙星、亚胺培南-西司他丁的MIC。PCR扩增gyrA基因和parC基因并进行酶切分析,选取部分PCR扩增产物进行测序鉴定。荧光定量PCR方法检测环丙沙星敏感株与耐药株的adeBmRNA表达的相对定量。结果鲍曼不动杆菌对环丙沙星的敏感率为15%,随加入CCCP的浓度增高而增加,并接近亚胺培南的敏感率。PCR限制性片段长度多态性(RFLP)分析显示,58株耐药菌中39株gyrA基因不能被Hinf I酶切,23株praC基因不能被Hinf I酶切,敏感株均能被Hinf I酶切,耐药株中的gyrA和parC基因存在突变。环丙沙星耐药菌株的adeBmRNA表达量明显高于敏感菌株。结论鲍曼不动杆菌对喹诺酮类药物耐药除了与gyrA、praC基因突变有关外,还与主动外排泵基因adeBmRNA过表达有关。     

嗜麦芽窄食单胞菌新型突变喹诺酮耐药基因Smqnr及其分布

目的 描述新型突变喹诺酮耐药基因Smqnr及其在嗜麦芽窄食单胞菌的分布,初步探讨Smqnr基因与喹诺酮抗生素耐药之间的关系。方法 嗜麦芽窄食单胞菌的鉴定采用VITEK全自动细菌鉴定和药敏系统,采用标准琼脂稀释法测定替加环素、氯霉素、头孢他啶、复方磺胺甲(恶)唑、替卡西林/克拉维酸、左氧氟沙星、莫西沙星7种抗生素对442株嗜麦芽窄食单胞菌的最低抑菌浓度(MIC)。聚合酶链反应(PCR)扩增全长Smqnr基因,测序后采用DNAMAN软件比对序列之间的差异,并构建系谱树分析不同Smqnr基因之间亲缘性关系。结果 嗜麦芽窄食单胞菌对7种抗菌药物有不同程度的耐药,且在5％ ～50％之间变动,左氧氟沙星的抗菌活性较好,耐药率仅为6.11％ (27/442),抗菌活性最好的药物为莫西沙星,耐药率为5.88％( 25/442),442株嗜麦芽窄食单胞菌中114株检测到Smqnr基因,检出率为25.79％ (114/442),包括11种已发现的Smqnr和20种新型突变的Smqnr基因（Smqnr 28 ～ 47）,新型突变的Smqnr基因是由于部分碱基发生突变导致相应的219位翻译氨基酸位点发生改变。耐药株Smqnr基因检出率为42.30％ (11/26),中介株Smqnr基因检出率为34.37％( 11/32),敏感株检出率23.95％ (92/384),敏感株中MIC为0.125 μg/ml的嗜麦芽窄食单胞菌Smqnr基因检出率最高,为37.78％。结论Smqnr基因编码区高度多态,新型突变的Smqnr基因是由于部分碱基发生突变导致相应的219位翻译氨基酸位点发生改变所致。Smqnr基因在嗜麦芽窄食假单胞菌中的检出率较高,分布也存在较大差异。     

解脲脲原体拓扑异构酶基因突变与耐喹诺酮类药物关系的研究

目的：探讨Ⅱ型拓扑异构酶基因突变与解脲脲原体（Uu）耐喹诺酮类药物的关系。方法：通过肉汤稀释法从184株临床株中筛选出13株对6种喹诺酮类药物呈不同程度耐药Uu株,应用聚合酶链反应扩增gyrA,gyrB,parC,parE基因,产物测序后与标准敏感株核苷酸序列进行比较。结果Uu耐药株的最低抑菌浓度均高于相应的标准敏感株4－32倍,序列比较发现gryAQRDR第87位碱基C到A的变导致第95位天冬氨酸被谷被氨酸替代,parC QRDR第50位碱基C到T的突变导致第80位丝氨酸被亮氨酸替代,gyrB和parE编码的氨基酸序列没有改变。结论：gyrA QRDR第87位碱基C到A的突变和parC第50位碱基C到T的突变与Uu耐喹诺酮类药物密切相关。