K562多药耐药细胞系中肿瘤干细胞样细胞对伊马替尼耐药机制的初步研究

Objective： To characterize a novel chronic myeloid leukemia （CML） cell line and to further elucidate the mechanisms of resistance to STI571. Methods： A novel K562 cell line （K562NP16） was achieved after exposure of the K562 cells to VP16. A small subpopulation （K562NP16 SP） that was capable of excluding Hoechst 33342 in the K562NP16 cell line was isolated by fiow cytometry sorting. The rest of the K562NP16 cells were classified as non-SP K562NP16. The mechanisms involved in K562NP16 SP cells which became resistant to STI571 were studied. Results： The levels of Bcr-Abl and Abl proteins were similar in the K562 cell line and in non-SP K562NP16 and K562NP16 SP cells. The multidrug-resistant gene 1 （MDR1） expression of the 170 kDa P-glycoprotein （P-gp） was detected in K562NP16 non-SP and K562NP16 SP cells but not in K562 cells. The expression levels of P-gp in the two K562NP16 cell lines were similar. Compared with non-SP K562/ VP16, the K562NP16 SP cells were more resistant to STI571. This resistance could hardly be reversed by many multidrug resistance inhibitors. In addition, in vivo study showed that the K562NP16 SP cells induced tumorigenesis in mice, while the K562NP16 non-SP cells failed to do so. Conclusion： A novel K562 cell line, K562NP16, was generated. A small side population K562NP16 SP cells, had high resistance to STI571 treatment and more tumorigenic than the K562 cells. It may represent the cancer stem cells of the K562NP16 cell line.     

低剂量地西他滨联合伊马替尼对K562细胞的增殖抑制作用

 目的　研究低剂量地西他滨（DAC）联合伊马替尼（IM）对K562细胞株的增殖抑制作用及对bcr-abl表达的影响。方法　单药及两药联合后,通过四甲基偶氮唑蓝（MTT）法观察药物对K562细胞株的增殖抑制作用,流式细胞术检测药物对K562细胞株早期凋亡率及细胞周期,巢式反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）半定量检测药物对K562细胞株bcr-abl mRNA表达。结果　DAC与IM单药对K562细胞的抑制作用呈浓度时间依赖性。两药联合用药抑制作用较单药组明显（F＝43.947、165.580、321.193、296.101,均P＜0.05）,24、 48、72 h各浓度组与对照组比较差异均有统计学意义（F＝202.759、168.457、417.538,均P＜0.05）。DAC及IM单药作用药物对K562细胞株均使G1期细胞明显增多,IM 0.2 μmol／L作用于K562细胞株48 h可见6.7 %早期凋亡细胞,IM 0.2 μmol／L联合DAC 4 μmol／L早期凋亡细胞增加至8.4 %。bcr-abl mRNA表达水平降低,DAC 4 μmol／L作用48 h后可降低K562细胞中bcr-abl mRNA表达（约14 %）,IM 0.2 μmol／L降低约40 %,联合用药表达量明显降低（约60 %）。联合用药组与单药组比较差异有统计学意义（F＝71.981,P＜0.05）。结论　DAC 对K562细胞的增殖抑制作用与细胞周期阻滞、诱导凋亡及降低bcr-abl mRNA表达有关,两药联合可显著抑制K562细胞增殖。     

NF-H基因参与K562/A02细胞多药耐药机制形成的研究

目的 分析K562／A02细胞多药耐药性(MDR)分子机制,寻找可能参与K562／A02细胞耐药机制的新基因。方法 通过长期逐步增加K562细胞培养液中阿霉素(ADM)的浓度,诱导出多药耐药细胞株K562／A02,利用cDNA microarray比较K562和K562／A02基因表达的筹别,从中选择NF-H基因进行RT-PCR和免疫细胞化学验证,并利用反义核酸技术和细胞内ADM浓度的测定,进一步验证该基因与K562／A02细胞多药耐药的关系。结果 通过比较发现,有12个基因可能参与了K562／A02细胞的耐药机制,其中7个基因在K562／A02中被下调,5个基因被上调。本研究结果显示,NF-H基因在K562／A02细胞中高表达,并且,将NF-H和mdrl反义核酸同时转入K562／A02细胞后,可明显提高细胞内ADM浓度,而单独转入NF-H反义核酸效果不明显。结论 K562／A02细胞耐药表型的形成是多因素的．除了P-糖蛋白(P-gp)等常见因素外,可能还有NF-H基因的参与。     

蛋白激酶C与K562/A02细胞多药耐药相关性的研究

目的 探讨蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)在K562／A02细胞多药耐药的产生及其逆转中的作用。方法 用放射免疫法检测了耐药细胞株K562／A02及其敏感株K562的静息PKC活性水平，并观察了柔红霉素(daunomycin，DNR)以及耐药调节剂粉防己碱(tetrandrine．Tet)、屈洛昔芬(droloxifene，Drol)单独或联合应用后细胞PKC活性的变化。结果 静息状态下耐药细胞株K562／A02的PKC活性显著高于敏感株K362，有效调节浓度的Tet、Drol单独作用于K562、K562／A02细胞均可显著下调其PKC活性，联合应用有显著协同性。1μg／mLDNR可显著下调K562细胞的PKC活性，部分下调K562／A02细胞的PKC活性，有效调节浓度的Tet、Drol单独或联合应用均可加强其作用。结论 PKC参与K562／A02细胞多药耐药(multidrug resistance,MDR)的形成，Tet、Drol逆转K562／A02细胞的MDR可能与下调其PKC活性有关。     

硼替佐米对伊马替尼耐药细胞株K562/G01增殖抑制和诱导凋亡作用的研究

Objective To explore the effect of proteasome inhibitor bortezomib (BOR) on proliferation inhibition and apoptosis in imatinib-resistant chronic myeloid leukemia cell line K562/G01. Methods MTT assay was used to observe the effect of growth inhibitory of cells; flow cytometry was used to detect cell cycle and apoptosis. Results K562/G01 cells was not sensitive to imatinib,1C50 values of imatinib to K562 and K562/G01 cells was (20.09±1.38) and (0.54±0.13) μmol/L,respectively; BOR could inhibit proliferation in K562/G01 cell,peaked at 48 h,and IC50 value of BOR to K562/G01 was (23.10±2.71) nmol/L. G2/M phase cell cycle arrest and significant apoptosis peak could be seen by flow cytometry with increased in the concentration and action time of BOR. Conclusion BOR can inhibit proliferation and induce apoptosis in imatinib-resistant K562/G01 cell,the mechanism may be related to cell cycle G2/M phase arrest.     

硼替佐米对伊马替尼耐药细胞株K562/G01增殖抑制和诱导凋亡作用的研究

Objective To explore the effect of proteasome inhibitor bortezomib (BOR) on proliferation inhibition and apoptosis in imatinib-resistant chronic myeloid leukemia cell line K562/G01. Methods MTT assay was used to observe the effect of growth inhibitory of cells; flow cytometry was used to detect cell cycle and apoptosis. Results K562/G01 cells was not sensitive to imatinib,1C50 values of imatinib to K562 and K562/G01 cells was (20.09±1.38) and (0.54±0.13) μmol/L,respectively; BOR could inhibit proliferation in K562/G01 cell,peaked at 48 h,and IC50 value of BOR to K562/G01 was (23.10±2.71) nmol/L. G2/M phase cell cycle arrest and significant apoptosis peak could be seen by flow cytometry with increased in the concentration and action time of BOR. Conclusion BOR can inhibit proliferation and induce apoptosis in imatinib-resistant K562/G01 cell,the mechanism may be related to cell cycle G2/M phase arrest.     

苦参碱对K562及其多药耐药细胞K562／vin,K562／dox的诱导调？…

目的：明确中药苦参碱对化疗敏感和耐药细胞的诱导调亡作用。方法：采用ＭＴＴ法测定苦参碱对各细胞的ＩＣ５０值。Ｋ５６２、Ｋ５６２／ｋｉｎ、Ｋ５６２／ｄｏｘ细胞与浓度苦参碱共同孵育于１６４０培养液中,一定时间后对细胞行Ｗｒｉｇｈｔ’ｓ－Ｇｉｅｍｓａ染色,做形态学观察,同时行ＤＮＡ凝胶电泳、流式细胞仪ＤＮＡ含量分析以检测调亡。结果：细胞形态学观察可见０．２５￣１．００ｍｇ／ｍｌ浓度苦参碱作用后的细胞体积缩     

敲除CIAPIN1基因提高白血病K562细胞对伊马替尼的敏感性

目的： 探讨靶向干扰细胞因子诱导凋亡抑制因子1 （cytokine induced apoptosis inhibitor 1,CIAPIN1）基因表达后慢性 粒细胞性白血病K562细胞对伊马替尼的敏感性。 方法 ：构建靶向CIAPIN1基因的shRNA干扰载体;使用实时定量PCR、West- ern blotting以及免疫荧光评价CIAPIN1-shRNA组（CIAPIN1-shRNA转染）和scramble-shRNA组（scramble-shRNA转染K562细 胞）干扰效率;伊马替尼（imatinib）处理两组K562细胞后,MTT法检测其增殖能力,集落形成实验检测细胞克隆形成能力,流式细 胞术和Western blotting检测细胞周期、凋亡及凋亡相关蛋白的变化。 结果： shRNA干扰可有效抑制CIAPIN1表达,CIAPIN1- shRNA组的CIAPIN1 mRNA表达量为scramble-shRNA组的(29.74±4.03)%、CIAPIN1蛋白表达量前者为后者的(21.57±2.18)%。 CIAPIN1表达下调能显著抑制伊马替尼对K562细胞的增殖和克隆形成,CIAPIN1-shRNA+imatinib组的细胞克隆形成数为 （15.60±1.03）个/视野,克隆半径为（2.63±0.55）μm,均小于scramble-shRNA+imatinib组（P<0.05或P<0.01）。CIAPIN1-shRNA+ imatinib组的细胞G1期细胞比例比scramble-shRNA+imatinib组明显增多,S期细胞比例较scramble-shRNA+imatinib组明显减少 （均P<0.01）。CIAPIN1-shRNA+imatinib组K562细胞凋亡率明显增加（P<0.01）。敲除CIAPIN1能抑制细胞周期相关蛋白Cyclin D1、Bcl-xl、Bcl-2、Mcl-1表达,诱导细胞内细胞凋亡相关蛋白p21、Bid、Bim表达,且与伊马替尼具有协同作用。 结论： CIAPIN1表 达下调可明显提高K562细胞对伊马替尼的敏感性,该作用主要通过阻滞K562细胞周期及诱导凋亡相关蛋白表达实现。     

K562／Adm多药耐药细胞株生长学特性的进一步研究

采用流式细胞仪及逆转录－多聚酶链式反应技术对所建立的Ｋ５６２／Ａｄｍ细胞株生物学特性进一步研究。结果表明该药细胞对化疗药物的摄取能力明显降低，细胞跨膜糖蛋白Ｐ１７０及编码该蛋白的ｍｄｒ－ｌｍＲＮＡ具有过度表达。     

RNA干扰和伊马替尼杀伤K562细胞效果的比较

目的比较RNA干扰（RNAi）和伊马替尼（imatinib）杀伤K562细胞的效果。方法设计有效的bcr—abl干扰shRNA序列，利用基因工程技术插入到干扰载体构建RNAi质粒。测序鉴定正确的RNAi质粒转染K562细胞，48h后荧光显微镜观察转染效率。RT—PCR技术检测K562细胞中bcr—abl表达水平。同时，伊马替尼作用K562细胞。利用凋亡分析、MTT增生实验和磷酸化的酪氨酸蛋白含量检测来评估RNAi和伊马替尼作用效果。结果与伊马替尼一样，RNAi使K562细胞凋亡增强，增生减少，磷酸化的酪氨酸蛋白含量减少。结论RNAi达到伊马替尼杀伤K562细胞的效果，有望在临床用于治疗慢性髓细胞白血病（CML）患者，尤其是那些对伊马替尼等化疗药物不敏感的CML患者。     

2-甲氧基雌二醇对白血病K562细胞凋亡相关基因表达的影响及其机制

 目的　探讨2-甲氧基雌二醇（2-ME）对白血病K562细胞凋亡的影响及其作用机制。方法　实验分为3组,对照组：培养基中不含2-ME;实验组：分别用1、2、4、8、16μmol／L的2-ME处理K562细胞36 h后观察各项指标的变化;阴性对照组：培养液中以无RNase蒸馏水代替K562细胞。应用原位细胞凋亡法（TUNEL）、流式细胞术（FCM）、半定量RT-PCR及黄嘌呤氧化酶法分别检测K562细胞凋亡率、Caspase-3、性连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）及其基因表达、超氧化物歧化酶（SOD）与活性氧（ROS）水平。结果　不同浓度的2-ME与K562细胞作用36 h后,2-ME在一定的浓度范围内以剂量依赖形式诱导K562细胞凋亡;2-ME通过上调促凋亡因子Caspase-3和（或）下调抗凋亡因子XIAP的表达,降低SOD及增加ROS水平等途径促进K562细胞凋亡,这可能是2-ME诱导K562细胞凋亡的机制之一。结论　2-ME能够以剂量依赖形式诱导K562细胞凋亡,显示了其在慢性粒细胞白血病（CML）治疗中的潜在价值。     

A23187诱导K562细胞分化为树突细胞的实验研究

目的 体外探讨A23187快速将人慢性白血病K562细胞定向诱导分化为树突细胞(DC)的实验方法.方法 K562细胞在含有A23187或细胞因子的条件下诱导分化为DC,倒置显微镜下观察细胞形态的变化,流式细胞术检测DC表面标志的改变,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测各表面标志mRNA水平的变化,四甲基偶氮唑蓝(...     

香加皮水提物抑制诱导红白血病细胞K562分化的初步研究

背景与目的： 研究中药香加皮水提取物(cortex periplocae extract,CPE) 诱导体外培养人红白血病细胞株K562分化的作用。 材料与方法： 观察人红白血病细胞株K562与CPE体外共培养时的形态学变化;同时采用比色法检测不同浓度CPE诱导人红白血病细胞株K562产生Hb含量的变化。 结果： 与阴性对照相比,CPE可以诱导K562细胞发生坏死的形态学变化。与CPE共培养后K562细胞株Hb的产生明显减少。 结论： CPE 对K562肿瘤细胞只具有杀伤作用而不能诱导K562肿瘤细胞的分化。     

他莫昔芬诱导K562细胞凋亡的实验研究

 目的 观察他莫昔芬对体外培养的人白血病细胞系K562细胞增生抑制及诱导凋亡作用。方法 在体外设定的浓度梯度和作用时间下用他莫昔芬处理K562细胞,采用锥虫蓝拒染法计数活细胞数,并计算细胞生长率,Wright-Giemsa染色光镜观察细胞形态、琼脂糖凝胶电泳测定DNA梯带（DNA,ladder）、流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡率。结果 他莫昔芬能够抑制K562细胞增生;1 ~ 5μmol／L他莫昔芬可诱导K562他莫昔芬对体外培养的人白血病细胞系K562细胞。结论 他莫昔芬可抑制K562细胞生长,诱导其凋亡。     

胡椒碱诱导人红白血病细胞株K562的分化

背景与目的:白血病是一种血液系统的恶性肿瘤,诱导分化是治疗白血病非常有效的方法之一。胡椒碱(piperine)是一种从胡椒属植物中提取的生物碱,具有镇静、抗炎、抗肿瘤等多种药理活性。本研究旨在探讨胡椒碱对K562细胞的增殖抑制和诱导分化作用。方法:采用台盼蓝染色计数法绘制生长曲线和流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡,观察胡椒碱对K562细胞增殖的影响;通过观察细胞形态学变化、检测硝基蓝四氮唑(nitroblue tetrazolium,NBT)还原能力、流式细胞术检测细胞表面标志CD33和CD14的变化,探讨胡椒碱对K562细胞的诱导分化作用。结果:20μmol/L和40μmol/L胡椒碱可诱导K562细胞向巨噬细胞和单核系细胞分化。40μmol/L胡椒碱作用3d,K562细胞的NBT还原阳性率由(8.5±1.9)%上升到(76.7±5.3)%;20μmol/L胡椒碱作用3d,流式细胞术结果显示细胞表面分化抗原CD33的平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)下降42.05%(P<0.01),而CD14的MFI则升高了1倍(P<0.01);20μmol/L以上浓度的胡椒碱对K562细胞的增殖具有抑制作用,其抑制作用随时间的延长或剂量的增加有增强的趋势。结论:胡椒碱可诱导K562细胞向巨噬和单核系细胞分化。     

hTERT基因反义核酸对K562细胞端粒酶活性的影响

探讨人类端粒酶逆转录酶（ｈｕｍａｎ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ,ｈＴＥＲＴ）基因的反义寡核苷酸（ａｎｔｉｓｅｎｓ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ,ＡＳＯＮＤ）对Ｋ５６２细胞端粒酶活性的影响。方法：采用多聚酶链反应－酶联免疫测定（ＰＣＲ－ＥＬＩＳＡ）方法检测人工合成的反义脱氧寡核苷酸处理Ｋ５６２细胞前后端粒酶活性的改变,以逆转录ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）分     

K562细胞和树突状细胞在细胞因子表达方面的相互作用

目的:探讨共培养条件下血液肿瘤K562细胞和树突状细胞（dendritic cells,DCs）在表达细胞因子方面的相互作用情况,探索血液肿瘤发生发展过程中的免疫逃逸机制。方法:利用免疫磁珠试剂盒从人健康外周血中分离纯化出高纯度的CD14+单核细胞,一定浓度的巨噬细胞集落刺激因子（granlocyte-macrophage colomy stimulating factor,GM-CSF）和白介素4（interlenkins-4,IL-4）将单核细胞诱导分化为未成熟DCs（immature DCs,imDCs）,再用一定浓度的肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α,TNF-α）将imDCs诱导为成熟DCs（mature DCs,mDCs）,分别将imDCs 和mDCs与K562细胞在Transwell系统中共培养48h,对照组为正常培养48h的DCs和撤细胞因子培养48h的DCs,ELISA方法分别检测各组细胞上清液中IL-10、IL-12、转化生长因子β1（transformed growth factor-β1,TGFβ1）和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达情况。结果:共培养后,DCs表达细胞因子IL-12减少,DCs和K562细胞表达TGFβ1增加,K562细胞表达VEGF增加。结论:共培养后,两种细胞在某些机制的相互作用下,DCs表达IL-12能力降低,DCs和K562细胞表达TGFβ1的能力增高,K562细胞表达VEGF的能力提高,这可能是共培养后DCs免疫功能下降和血液肿瘤细胞逃脱机体免疫监视的细胞因子方面的原因。     

Livin反义寡核苷酸对K562细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨Livin反义寡核苷酸（ASODN）对白血病细胞K562增殖及凋亡的影响。方法设计合成特异性的Livin硫代磷酸ASODN及其对照错义寡核苷酸（MSODN）,脂质体介导转染K562细胞后,采用四甲基偶氮唑盐光吸收法（MTT）检测细胞增殖,AnnexinV—FITC法检测细胞的凋亡,反转录-聚合酶链反应（RT—PCR）法检测LivinmRNA的表达。结果LivinASODN在终浓度为600nmol／L作用K562细胞48h时,能明显抑制其增殖细胞增殖咖制率（IR）为（52．99±2．67）％],降低LivinmRNA的表达[ODR为（59．75±3．24）％],K562细胞凋亡率显著增加f（36．89±1．08）％]（P〈0．01）,而Lip—MSODN组、Lip对照组与细胞对照组之间差异无统计学意义（P〉0．05）。结论LivinASODN可下调Livin基因表达,有效抑制K562细胞的增殖,并促进K562细胞凋亡。