NF-κB亚单位p50/p65激活促进肺腺癌H1650细胞吉非替尼耐药

目的探究NF-κB经典通路激活与人肺腺癌H1650细胞吉非替尼耐药的内在联系。方法选择肺腺癌HCC827和H1650 亲代细胞株,吉非替尼连续处理60 d,检测细胞株生长情况和各细胞株595nm吸光度,确定各细胞株细胞存活率和H1650亲代 细胞被诱导成H1650耐药细胞株。Western blot检测各细胞株P-IκBα、NF-κB P-p50和P-p65表达量,Image J灰度仪计算出胞浆 和胞核P-p50和P-p65与内参蛋白灰度比值,比较吉非替尼和吉非替尼加吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（PDTC）联合用药状态下,各 细胞株细胞存活率和P-IκB、P-p50和P-p65的表达。结果在无吉非替尼和吉非替尼加PDTC药物干预下,H1650耐药细胞PIκBα 表达增加,胞浆和胞核P-p50和P-p65表达,H1650耐药细胞株>H1650亲本细胞株>吉非替尼敏感HCC827细胞株（P<0.05, P<0.01）;单独使用吉非替尼干预,H1650 耐药细胞株细胞抑制率较H1650 亲本细胞株和HCC827 细胞株降低（P<0.05,P< 0.01）,H1650耐药细胞株P-p50和P-p65表达较其他两类细胞株升高（P<0.05）;与无吉非替尼干预比较,H1650亲代和耐药细胞 P-p50和P-p65均有显著降低（P<0.05,P<0.01）;吉非替尼联合PDTC干预,显示H1650亲代和耐药细胞存活率、胞浆和胞核Pp50 和P-p65表达均较吉非替尼组降低（P<0.01,P<0.01）。结论NF-κB经典传导通路激活是H1650亲代细胞残存和转化为吉 非替尼耐药细胞的主要因素之一,吉非替尼联合PDTC用药可抑制P-IκBα生成和P-p50、P-p65的激活,从而降低H1650残存细 胞生存率和耐药细胞的产生。     

厄洛替尼对非小细胞肺癌增殖和自噬的影响

目的:探讨厄洛替尼对人非小细胞肺癌细胞HCC827?A549?H1299增殖及自噬的影响?方法:将体外培养的人肺癌HCC827?A549?H1299细胞株分为对照组(CON组)?溶剂对照组(DMSO组)和厄洛替尼处理组,采用CCK-8法检测厄洛替尼对细胞增殖的抑制作用,采用Western blot及细胞免疫荧光法检测自噬相关蛋白LC3?Beclin-1表达?结果:厄洛替尼以剂量依赖的方式抑制HCC827?A549?H1299细胞增殖,增殖抑制率由高到低分别为HCC827?A549?H1299,3株细胞的半数抑制浓度分别为8.72?32.09?87.46 μmol/L;与对照组相比,厄洛替尼显著上调LC3-Ⅱ及Beclin-1表达 (P < 0.05);厄洛替尼诱导HCC827?A549?H1299细胞株自噬,且其诱导作用呈剂量依赖性(P < 0.05)?结论:厄洛替尼选择性抑制非小细胞肺癌增殖,并诱导非小细胞肺癌细胞自噬?     

BIM在EGFR突变非小细胞肺癌中的表达及其意义

目的 检测非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株的凋亡以及促凋亡蛋白(BIM)的表达,探讨吉非替尼对其的影响.方法 采用Annexin PI单染法检测吉非替尼作用下各细胞株的凋亡,免疫印迹法检测BIM的表达.结果 吉非替尼诱导NSCLC细胞株凋亡,其中对H1650、H1975突变株的诱导凋亡率高于A549细胞株(P＜0.01),H1650的BIM表达随吉非替尼浓度的增加而增强,H1975的BIM表达较高,但受吉非替尼浓度变化的影响不明显,而A549的BIM表达需要更高浓度的吉非替尼作用.结论 吉非替尼可以使NSCLC细胞表皮生长因子受体(EGFR)突变株细胞内的BIM表达增高,并且可能通过上调BIM的表达来诱导肿瘤细胞凋亡.     

粒状头样蛋白2下调诱导上皮间质转化促进肿瘤细胞对吉非替尼耐药

目的 探讨粒状头样蛋白2（GRHL2）在肿瘤靶向治疗药物表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）吉非替尼获得性耐药中的作用和可能机制。方法 利用吉非替尼浓度逐步递增的体外诱导方法培养人结直肠癌细胞DiFi和人肺腺癌细胞HCC4006,获得吉非替尼耐药细胞株。通过RNA测序方法筛选在耐药细胞株与其亲代细胞中差异表达的基因并进行实时荧光定量PCR验证。使用pcDNA3.1-GRHL2质粒转染耐药细胞株使GRHL2过表达,用CCK-8法检测细胞对吉非替尼的敏感性。采用蛋白质印迹法检测耐药细胞株中上皮标志物E-cadherin和间质标志物Vimentin的表达变化,并通过CellMiner^TM数据库分析60株人肿瘤细胞系中GRHL2表达与E-cadherin和Vimentin表达的关系。结果 成功获得DiFi和HCC4006的耐药细胞株。通过RNA测序和实时荧光定量PCR验证发现GRHL2在耐药细胞株中表达下调,而在耐药细胞株中过表达GRHL2后细胞恢复了对吉非替尼的敏感性。蛋白质印迹分析表明耐药细胞株中上皮标志物E-cadherin表达下调,而间质标志物Vimentin表达上调;CellMiner^TM数据库分析表明GRHL2的表达与E-cadherin/Vimentin比值高度一致。结论 GRHL2表达下调通过诱导上皮间质转化介导肿瘤细胞对吉非替尼的耐药。     

肺金生方抗非小细胞肺癌EGFR-TKIs耐药性的分子机制研究

目的探讨肺金生方抗非小细胞肺癌(NSCLC)酪氨酸磷酸酶抑制剂(TKIs)靶向药物耐药的作用及分子机制。方法选用NSCLC细胞系HCC827,按0.01、0.05、0.10、0.50和1.0μM浓度梯度诱导构建吉非替尼耐药细胞株,采用CCK8法检测耐药株是否构建成功,采用荧光定量PCR(q-PCR)检测耐药株c-MET扩增水平。20只BALB/c裸鼠按随机数字表法分成空白对照组、吉非替尼组、肺金生方组和肺金生方+吉非替尼组,每组5只。按每只4×10~7/200μL将吉非替尼耐药细胞株注射于裸鼠后肢皮下,构建皮下移植瘤模型。四组均腹腔注射生理盐水,吉非替尼组给予吉非替尼50mg/kg灌胃;肺金生方组给予肺金生方剂量53.6g/kg灌胃;肺金生方+吉非替尼组给予吉非替尼50mg/kg+肺金生方剂量53.6g/kg联合灌胃给药。给药频次每2天1次,连续给药4周。CCK8法检测耐药HCC827 GR细胞增殖率,流式细胞技术检测耐药HCC827 GR细胞凋亡率,Western blot检测耐药HCC827 GR细胞p-EGFR、p-MET、p-AKT、p-ERK1/2表达水平。结果与空白对照组比较,吉非替尼组裸鼠皮下移植瘤瘤重无差异[(1.34±0.16)g比(1.41±0.13)g,P>0.05],肺金生方组裸鼠皮下移植瘤瘤重明显减轻[(0.77±0.28)g比(1.41±0.13)g,P<0.01],吉非替尼+肺金生方组裸鼠皮下移植瘤明显小于肺金生方组和吉非替尼组[(0.34±0.16)g比(0.77±0.28)g、(1.34±0.16)g,P均<0.01];肺金生方单用或与吉非替尼联用能够明显抑制耐药HCC827 GR细胞的增殖能力[(43.45±4.47)%、(24.25±5.21)%比(100.00±2.14)%,P均<0.01];肺金生方组、吉非替尼+肺金生方组细胞凋亡率显著高于空白对照组[(7.40±0.56)%、(12.80±0.72)%比(3.05±0.54)%,P均<0.01];肺金生方组、吉非替尼+肺金生方组c-MET和p-c-MET表达水平明显降低,并明显抑制下游AKT/ERK1/2磷酸化水平。结论肺金生方或和吉非替尼联用能有效抑制吉非替尼耐药皮下移植瘤的生长,抑制耐药细胞的增殖并促进凋亡,其作用机制可能与下调c-MET蛋白表达以及下游AKT/ERK1/2磷酸化水平有关。     

非小细胞肺癌奥希替尼耐药细胞株的建立与鉴定及耐药后对化疗的敏感性

目的：建立非小细胞肺癌奥希替尼耐药细胞株H1975AR,对亲本和耐药细胞株进行鉴定,探讨耐药机制。方法：在体外采用浓度递增的方法予奥希替尼处理诱导H1975细胞建立奥希替尼耐药细胞株H1975AR;光镜及Giemsa染色比较2种细胞形态学差异;第二代测序（next generation sequencing,NGS）检测表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）基因突变;磺酰罗丹明B（sulforthodamine B,SRB）法检测细胞增殖,评估细胞对EGFR?酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor,TKI）和化疗药的敏感性;分别予0、10、100、1 000 nmol/L奥希替尼处理6 h,Western blot法检测EGFR及下游增殖信号的变化。结果：①SRB法测得H1975AR的耐药指数为3 634.75,显示H1975AR是奥希替尼耐药细胞株;②耐药细胞株形态发生改变且核浆比增大;③与H1975相比,给予奥希替尼处理对H1975AR的p?EGFR和p?ERK抑制作用不明显,且相同的给药浓度对H1975AR的p?AKT抑制作用较弱,同时下调c?Met的表达;④H1975和H1975AR对第一代EGFR?TKI耐药,对顺铂和紫杉醇敏感。结论：H1975AR细胞EGFR C797S顺式突变的产生是奥希替尼主要耐药机制,并对顺铂和紫杉醇敏感。     

整合素β1信号通路参与非小细胞肺癌吉非替尼获得性耐药

目的 探讨整合素β1及其下游信号转导通路在非小细胞肺癌表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR) 酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor, TKI)吉非替尼获得性耐药中的作用。方法 以人肺腺癌细胞株PC-9和吉非替尼耐药株PC-9/G作为研究对象,用MTT法检测吉非替尼和/或磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）抑制剂LY294002、细胞外调节蛋白激酶（ERK）抑制剂PD98059对细胞增殖抑制率的影响;用Annexin Ⅴ/PI试剂盒和TUNEL试剂盒检测细胞凋亡。免疫印迹分析检测整合素β1、Akt、磷酸化Akt蛋白的表达。结果 吉非替尼耐药株PC-9/G高表达整合素β1,RNAi抑制整合素β1表达能够抑制PC-9/G细胞的生长、促进调亡。ERK抑制剂PD98059不能恢复PC-9/G细胞对吉非替尼的敏感性。PC-9/G细胞中吉非替尼对Akt的磷酸化的抑制作用弱于PC-9细胞。PI3K抑制剂LY294002能恢复PC-9/G细胞对吉非替尼的敏感性,RNAi抑制整合素表达后Akt的磷酸化水平降低。结论 表达升高的整合素β1通过PI3K途径激活下游信号分子可能是一种重要的EGFR-TKI耐药机制。     

联合应用三苯氧胺和吉非替尼对ＮＳＣＬＣ细胞的抗增殖效应

目的:探讨雌激素受体拮抗剂三苯氧胺联合表皮生长因子受体抑制剂吉非替尼对人小细胞肺癌(NSCLC)细胞株增殖和凋亡的影响及相关的分子机制,为联合分子靶向和激素治疗NSCLC提供理论依据.方法:以吉非替尼及三苯氧胺单独或联合处理NSCLC细胞株,MTF法比较细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡.应用荧光定量PCR及Western blot检测三种肺癌细胞株中表皮生长因子受体(EGFR)及雌激素受体β(Erβ)的表达情况,并分别检测雌二醇.三苯氧胺(TAM)对细胞中EGFR,以及表皮生长因子(EGF)和吉非替尼对Erβ表达的影响,同时还检测了雌二醇对EGFR的磷酸化作用.结果:联合吉非替尼和三苯氧胺增强对EGFR,Erβ阳性的A549,H1650细胞的抑制作用,促进凋亡,但对EGFR,Erβ阴性的H520细胞无明显改变.雌二醇可促进细胞EGFR磷酸化,却也抑制其表达,而三苯氧胺则上调EGFR的表达.同时,EGF及吉非替尼对Erβ的表达也有类似的相反的调控作用.结论:联合吉非替尼和三苯氧胺能够增强对EGFR,Erβ均阳性的肺癌细胞的抗增殖作用,这可能与细胞内EGFR信号转导途径和雌激素信号通路的交叉有关.因此,结合针对EGFR的分子靶向治疗与激素治疗可能为肺癌的治疗提供新的途径.     

鼻咽癌细胞株中EGFR的表达及吉非替尼联合放射照射的生物效应评估

目的本研究旨在探讨表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)的表达对鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma,NPC)综合治疗的影响。方法免疫荧光检测鼻咽癌CNE1和HONEl中表皮生长因子受体(EGFR)表达水平。取对数生长期细胞接种于96孔板中并随机分组,对照组不行特殊处理,吉非替尼组,单纯照射组及药物照射组给予不同浓度的吉非替尼及剂量的放射线照射。以CCk-8测量细胞活性;细胞集落实验检测吉非替尼对鼻咽癌细胞株放射敏感性的影响按单击多靶模型和线性二次模型拟合细胞存活曲线。结果免疫荧光检测显示CNE1细胞和HONE1细胞内均有较高EGFR表达,药物照射组较单纯照射组在低放射量组时既有显著差异,吉非替尼能增强鼻咽癌细胞株的放射敏感性。结论吉非替尼联合放射照射较单纯照射能提高鼻咽癌的治疗效果。     

基于分子对接方法的肺癌分子靶标耐药机制研究

目的探讨吉非替尼为代表的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor tyrosine kinases inhibitor,EGFR-TKI）在治疗非小细胞肺癌中起到的作用。方法虽然部分患者治疗后产生获得性耐药,其耐药机制尚未完全阐明。但本文将研究第790位密码子突变导致吉非替尼耐药的原理。利用Arguslab软件,模拟并分析吉非替尼与EGFR野生型和变异型蛋白的结合情况,试图对EGFR-TKI的耐药机制作出解释。结果野生基因2GS6与吉非替尼结合所需能量为-8.07 kcal/mol,低于2GS6与ATP结合所需能量-7.78 kcal/mol,2GS6基因突变为3IKA后,受体蛋白与吉非替尼的结合能力降低至-6.96 kcal/mol,与ATP的结合能力提升至-8.41 kcal/mol。结论 2GS6更易与吉非替尼结合,患者对吉非替尼药物敏感,具有临床意义。     

人肺癌组织细胞中HIN-1基因甲基化分析

目的:HIN-1(High in normal-1)是新近鉴定的一个抑癌基因,在乳腺癌细胞中,HIN-1启动子区的高甲基化导致其表达沉默。本研究拟探讨肺癌组织和6种肺癌细胞株中抑癌基因HIN-1启动子区内的甲基化修饰水平。方法:甲基化特异性PCR(MSP)和Biosulfite(亚硫酸氢钠)测序法鉴定样品中HIN-1启动子内CpG甲基化状态,RT-PCR法检测5-aza-dc处理前后HIN-1在细胞内的表达水平。结果:在60例肺癌样本中,HIN-1启动子甲基化阳性样本为35例(阳性率58.3%),而5例正常肺组织样品均为阴性反应。采用RT-PCR法分析了肺癌细胞株H157,H358,H1299,A549,H727,DMS53内HIN-1基因的表达水平,发现前4种细胞株内HIN-1表达水平极低,也是在这4种肺癌细胞中,HIN-1基因启动子呈高甲基化状态。用去甲基化试剂5-aza-dc处理上述4种细胞96h后,所有这4种细胞内均出现HIN-1基因的重新活化。结论:抑癌基因HIN-1启动子高甲基化导致的HIN-1表达抑制可能是肺癌发生发展的重要因素。     

miR-132调节非小细胞肺癌hedgehog信号通路受体基因PTCH1及细胞增殖、迁移和侵袭

 目的  研究miR-132在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞系H1299中的作用及相应的靶基因。方法  real-time PCR检测7种细胞系中miR-132的表达量。用CCK-8检测稳定株细胞H1299-pEGP-miR-132与H1299-pEGP-miR-null 的生长速率的变化。使用稳定株细胞H1299检测miR 132对于细胞克隆形成、细胞迁移和细胞侵袭的影响。用Transwell结合matrigel的方法检测H1299-pEGP-miR-132细胞与H1299-pEGP-miR-null细胞在72 h时细胞迁移和侵袭的变化,同时在H1299-pEGP-miR-132细胞中使用anti-miR-132进行了相关的实验验证。运用生物信息学方法预测miR-132的靶基因,并运用双荧光实验、real-time PCR和Western blot验证。在H1299-pEGP-miR-132细胞中共同转染anti-miR-132和PTCH1 siRNA检测其对细胞的增殖、迁移和侵袭的影响。结果   miR-132在肺癌细胞系中呈现高表达,在NSCLC细胞H1299中miR-132通过靶向调节PTCH1基因的表达发挥作用。H1299-pEGP-miR-132细胞的增殖(P<0.01)、迁移(P<0.05)、侵袭(P<0.05)能力明显高于对照组。在H1299-pEGP-miR-132细胞中转入PTCH1 siRNA后细胞增殖能力升高(P<0.05),迁移和侵袭能力降低(P<0.001)。H1299-pEGP-miR-132细胞15天形成的克隆数目是对照组细胞的1.41倍(P<0.05)。Western blot法检测显示miR-132使H1299中PTCH1蛋白表达量显著降低(0.68倍),anti-miR-132使PTCH1表达量显著升高(1.97倍)。结论  miR-132可能参与NSCLC的细胞增殖、迁移和侵袭。它的致癌性部分归因于对Hh信号通路关键的负调控蛋白PTCH1的调节。     

miR-124 modulates gefitinib resistance through SNAI2 and STAT3 in non-small cell lung cancer

Gefitinib is used as a first-line treatment for advanced non-small cell lung cancer (NSCLC). Unfortunately, most NSCLC patients inevitably develop gefitinib resistance during treatment. In addition to EGFR mutation status, the mechanisms involved are largely unknown. In this study, we showed that miR-124, a tumor suppressor, was significantly down-regulated in gefitinib-resistant NSCLC patients and cell lines compared with gefitinib-sensitive patients and cell lines. In addition, the miR-124 depletion induced gefitinib resistance, and miR-124 overexpression sensitized gefitinib-resistant cells to gefitinib. Mechanistic analysis revealed that miR-124 decreased SNAI2 and STAT3 expression by directly targeting their 3'UTRs and that knocking down SNAI2 or STAT3 partly reversed the gefitinib resistance induced by miR-124 depletion. Our data demonstrate that the miR-124 plays a new critical role in acquired resistance to gefitinib and that the manipulation of miR-124 might provide a therapeutic strategy for reversing acquired gefitinib resistance.     

miR-30b and miR-30c expression predicted response to tyrosine kinase inhibitors as first line treatment in non-small cell lung cancer

Background Aberrantly expressed microRNAs are a hallmark of cancer,and microRNA expression profiling is associated with tumor progression and response to chemotherapy,suggesting their potential application as prognostic and predictive biomarkers.The role of microRNAs in lung cancer remains elusive.It has been recently reported that epidermal growth factor receptor （EGFR） and hepatocyte growth factor receptor （MET） tyrosine kinase can regulate expression of specific microRNAs including miR-30b,miR-30c,miR-221,miR-222,miR-103 and miR-203,and induce tumorigenesis and gefitinib resistance in lung cancers.We intend to study the role of miR-30b and miR-30c expression in predicting response to tyrosine kinase inhibitors （TKIs） in non-small cell lung cancer （NSCLC）.Methods We have therefore retrospectively examined expression of miR-30b miR-30c in 41 formalin fixed paraffin embedded tissue samples from NSCLC patients when TKIs were used as first line therapy.Results We found a significant correlation between expression of miR-30b and miR-30c.Furthermore,miR-30b and miR-30c expression correlated with short-term response.Kaplan-Meier analysis further revealed that the expression of miR-30b and miR-30c predicted progression free survival and the overall survival rate in the examined cohort.Conclusion Our study identified miR-30b and miR-30c as useful prognostic predictors in NSCLC patients who underwent first line treatment with TKIs.     

Gefitinib获得性耐药产生时非小细胞肺癌上皮性标志EGFR及E-cadherin表达的变化

[目的]了解gefitinib获得性耐药产生时非小细胞肺癌上皮性标志EGFR及E-cadherin表达的变化。[方法]采用逐步递增药物浓度、间歇作用体外诱导法诱导人肺腺癌NCI-H1975细胞株gefitinib获得性耐药;倒置显微镜下观察亲本细胞株和耐药细胞株在gefitinib作用前后的细胞形态学变化差异;细胞计数法描绘耐药细胞株和亲本细胞株的生长曲线并计算群体倍增时间;免疫细胞化学法检测耐药细胞株及亲本细胞株的EGFR及E-cadherin蛋白表达状态,并比较二株细胞间两种蛋白表达的差异。[结果]历时6个月诱导建成人肺腺癌gefitinib耐药细胞株NCI-H1975/GR。Gefitinib作用后耐药细胞株NCI-H1975/GR的细胞形态变化与亲本株NCI-H1975有所不同;在gefitinib的作用下,NCI-H1975/GR细胞体积变小,部分细胞变为纺锤形;NCI-H1975/GR细胞株群体倍增时间延长7.14 h(P<0.05);免疫细胞化学结果显示:与亲本株比较,虽然耐药细胞株NCI-H1975/GR细胞细胞膜EGFR蛋白的表达无明显变化,但在细胞浆的表达明显增高;E-cadherin在细胞膜的表达明显降低。[结论]非小细胞肺癌产生gefitinib获得性耐药后EGFR蛋白在细胞浆积聚;而以E-cadherin为代表的上皮分化标记表达减弱。