骨髓间充质干细胞与骨髓瘤细胞共培养时EphB4/ephrinB2表达异常

目的:研究正常骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)在与骨髓瘤细胞株U266?RPMI8226共培养过程中,骨髓瘤细胞对MSC EphB4/ephrinB2表达的影响?方法:应用Transwell培养体系,将正常骨髓MSC分别与骨髓瘤细胞株U266?RPMI8226细胞共培养7?12 d后分别应用实时定量RT-PCR和细胞免疫化学方法检测骨髓MSC的EphB4/ephrinB2 mRNA和蛋白表达水平?结果:骨髓MSC与U266?RPMI8226共培养后,与对照组MSC相比,生长和形态未见明显改变,应用实时定量RT-PCR方法检测骨髓MSC EphB4/ephrinB2的mRNA水平较对照组均降低,在共培养7 d的时间点上除EphB4在RPMI8226共培养组与对照组差异无统计学意义,其余组间差异均有统计学意义(P < 0.05),在12 d上差异无统计学意义(P > 0.05)?细胞免疫化学结果显示共培养组MSC 胞膜胞浆 EphB4/ephrinB2 表达下降?结论:骨髓瘤细胞株U266?RPMI8226在与正常骨髓MSC共培养后,诱导骨髓MSC EphB4/ephrinB2表达的下调,可能通过MSC成骨-破骨活动的脱耦合,参与骨髓瘤骨病的发生?     

不同来源基质细胞对骨髓瘤KM3细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察人脐血基质细胞及骨髓瘤患者骨髓基质细胞对骨髓瘤KM3细胞生物学特性的作用.方法 体外分离培养骨髓瘤骨髓基质细胞和人脐血源基质细胞,与骨髓瘤KM3细胞共培养.采用扫描电镜观察共培养后基质细胞和KM3细胞的位相关系;应用CCK-8、P I染色流式细胞仪和Annexin V/P I双标法检测不同培养条件下KM3细胞的增殖、细胞周期和凋亡率.结果 人脐血基质细胞比骨髓瘤患者骨髓基质细胞有更强的抑制KM细胞增殖的作用;共培养后骨髓瘤患者骨髓基质细胞使KM3细胞阻滞于G0/G1期[(59.70±1.28)%],人脐血基质细胞使S期的KM3细胞比例增高[(46.07±2.46)%];KM3/MM-BMSCs组KM3细胞凋亡率为(3.26±0.12)%明显低于KM3/hUCBDSCs组KM3细胞凋亡率(4.76±0.12)%(P<0.01);KM3/MM-BMSCs组KM3细胞Bax mRNA的表达较KM3/hUCBDSCs组明显下降(P<0.01);KM3/hUCBDSCs组KM3细胞Bcl-2 mRNA的表达较KM3细胞悬浮培养组下降(P<0.05),KM3/MM-BMSCs组KM3细胞Bcl-2 mRNA的表达则明显升高,为悬浮培养组的1.982倍(P<0.01).结论 骨髓瘤基质细胞微环境抑制骨髓瘤细胞凋亡和死亡;而人脐血源基质细胞有更强的抑制骨髓瘤细胞增殖的作用,并促进其凋亡.     

体外培养大鼠骨髓间充质干细胞成骨基因表达谱的检测

目的:探讨体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)成骨相关基因的表达谱,明确体外培养大鼠骨髓MSC的成骨潜能。方法:体外培养SD大鼠骨髓MSC,取第3代细胞提取总核糖核酸(RNA),制备杂交探针,并运用SuperArray公司提供的大鼠Oligo GEArray骨再生基因芯片(每张芯片可测113种基因)进行杂交,化学发光检测,通过X线胶片或台式扫描获得化学发光的芯片图像,使用网上提供的综合型GEArry表达分析配套软件(GEArryExpression Analysis Suite)进行完整的芯片数据分析。结果:检测体外培养大鼠骨髓MSC的113种成骨相关的基因,其中有31种基因表达强度较低,45种基因呈中等强度表达,37种基因表达强度较高。结论:体外培养大鼠骨髓MSC具有部分成骨细胞基因表型特征,但成熟成骨细胞的特征基因表达量较低,提示大鼠MSC是具有较强成骨细胞分化潜能的成纤维样细胞。     

炎症因子IL-1β和TNF-α可通过骨髓间充质干细胞降低多西环素对骨髓瘤细胞株H929的细胞毒性作用

目的：骨髓来源的间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）在骨髓微环境中参与骨髓瘤细胞的耐药性。本实验旨在通过体外实验,研究炎症因子处理的骨髓间充质干细胞在与骨髓瘤细胞株H929共培养条件下,是否影响多西环素（Doxycycline,DOX）对人骨髓瘤细胞株的细胞毒性作用,并初步探讨其可能的作用机制。方法：分别采用CCK8法和流式细胞术（FCM）,检测肿瘤坏死因子（TNF）-ɑ或白细胞介素（IL）-1β预处理的人骨髓MSC,与H929细胞共培养过程中,DOX对H929细胞增殖和凋亡的影响;采用FCM和实时聚合酶链反应（RT-PCR）法检测IL-1β或TNF-α处理后,骨髓MSC的血管细胞粘附因子VCAM-1表达;Western Blot方法用于检测在DOX存在时,不同处理的骨髓MSC作为共培养饲养层细胞的条件下,H929细胞经DOX药物处理后p-Erk1/2变化。结果：DOX可抑制骨髓瘤细胞株H929的增殖并诱导其凋亡。人骨髓MSC与H929共培养可以减少DOX对H929的细胞毒性作用,而经IL-1β或TNF-α预处理的人骨髓MSC再与H929共培养,则可以进一步降低DOX的细胞毒性作用。人骨髓MSC经IL-1β或TNF-α处理后,其VCAM-1的mRNA转录水平和细胞表面蛋白表达水平均升高。经炎症因子预处理的骨髓MSC与H929共培养后,可以降低DOX对骨髓瘤细胞株p-Erk1/2的下调作用。结论：DOX在体外对骨髓瘤细胞株表现出剂量和时间依赖性的细胞毒性作用;而炎症因子IL-1β和TNF-α可以通过骨髓MSC来间接拮抗DOX对H929的细胞毒性作用;IL-1β和TNF-α的这一作用的机制可能与上调骨髓MSC的VCAM-1表达与下调p-Erk1/2有关。     

骨髓基质细胞保护药物诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡的机制研究

目的研究原代正常骨髓基质细胞对多发性骨髓瘤细胞的保护作用及其内在机制。方法脂质体介导Notch1特异性小干扰RNA转染多发性骨髓瘤RPMI 8226细胞与骨髓基质细胞共培养,采用细胞形态学观察和流式细胞术检测细胞凋亡,Western印迹检测Notch1及NF-κB p65蛋白表达变化。结果多发性骨髓瘤细胞与基质细胞共培养增加了Notch1活化形式(N1-ICD)蛋白的表达;共培养组与悬浮培养组药物诱导的细胞凋亡率分别为(15.30±2.21)%、(32.88±3.27)%;小干扰RNA有效的下调Notch1蛋白的表达;干扰共培养组与控制共培养组细胞的凋亡率分别为(41.47±4.01)%和(24.89±3.68)%;下调Notch1后NF-κB p65蛋白表达没有改变。结论骨髓基质细胞保护药物诱导的多发性骨髓瘤细胞的凋亡,该保护作用通过激活Notch1通路实现。下调Notch1共培养恢复药物诱导的凋亡作用不是通过NF-κB通路,可能存在其他机制。     

肿瘤坏死因子预处理的骨髓间充质干细胞对骨髓瘤细胞株H929集落形成能力及miRNA-15a/16等相关基因表达的影响

目的 :多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)表现有骨破坏和骨髓微环境的异常。近来发现MM患者的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)有多种异常。既往研究发现经肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)-α预处理的骨髓MSC成骨分化潜能增强。本实验进一步研究TNF-α预处理的骨髓与骨髓瘤细胞株H929共培养后,对H929的影响。方法 :骨髓MSC经TNF-α单次(T+1组)或多次预处理(T+7组)后,与H929直接共培养3 d后,收集H929细胞分别检测其集落形成能力,定量RT-PCR检测POU5F1、SOX2和NANOG基因,以及微小RAN(miRNA)-15a/16的表达水平,并与对照组比较。结果:各组H929细胞均有POU5F1、SOX2、NANOG和miRNA-15a/16的检出。与对照组和T+1组相比较,T+7组的POU5F1和SOX2基因的表达水平下降且有统计学意义(P<0.05);miRNA-15a/16表达水平均上升且有统计学意义(P<0.05);CFU数减少且有统计学意义(P<0.05)。结论:经TNF-α多次预处理的骨髓MSC与MM细胞相互作用后,抑制MM细胞作用更加明显,具体机制有待进一步研究。     

H2O2对体外正常人黑素细胞和角质形成细胞共培养模型中黑素合成功能的影响

 目的 探讨不同浓度H2O2对黑素细胞(melanocyte,MC)和角质形成细胞(keratinocyte,KC)共培养体系的细胞增殖、黑素合成及酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)表达的影响。方法 培养原代人表皮MC和KC,建立共培养模型。采用MTT法测定细胞增殖,NaOH法测定细胞黑素含量,实时PCR方法观察TYR基因的表达。结果 KC和MC以3∶1浓度混合时,可形成稳定共培养模型。高浓度H2O2作用下,共培养细胞增殖受到明显抑制(P<0.05),TYR基因表达显著降低(P<0.05);低浓度H2O2(<0.1 mmol/L)作用下,细胞增殖受到轻度抑制,TYR基因表达增高(P<0.05)。结论 H2O2对MC与KC共培养体系的作用复杂,对黑素合成功能可呈现双向作用。     

Toll样受体激活对间充质干细胞免疫调节功能的影响

目的 探讨Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)激活对骨髓和脐带两种不同来源间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)免疫调节功能的影响,同时比较骨髓MSC与脐带MSC中TLR的表达情况。方法 从关节置换术患者废弃的关节中取得骨髓,分离培养骨髓MSC。从健康产妇废弃的脐带中分离培养脐带MSC。采用TLR4激动剂脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、TLR3激动剂聚肌胞苷酸[polyinosinic-polycytidylic acid, Poly(I:C)]分别预处理骨髓MSC或脐带MSC,然后与健康志愿者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)共培养,共培养结束后流式细胞术检测PBMC增殖情况。以实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)检测骨髓MSC和脐带MSC中TLR4、TLR3的基因表达水平。流式细胞术检测骨髓MSC和脐带MSC中TLR4、TLR3...     

分别应用基因芯片和solexa技术研究脐血干细胞体外诱导的巨核细胞基因表达谱

目的分别应用基因芯片和solexa技术研究人脐带血CD34+细胞来源的巨核细胞的基因表达谱。方法采用密度梯度离心法和免疫磁珠法分选人脐带血CD34+细胞。100 ng/ml TPO诱导培养12天后,应用免疫磁珠法分选巨核细胞(MKs)和非巨核细胞(非MKs)。分别应用基因芯片和solexa技术检测MKs和非MKs的差异表达基因。结果基因芯片技术在38000多个基因表达谱的筛选中,检测出呈现显著差异表达的基因有1834个,其中711个上调基因,1123个下调基因。应用solexa技术获取的MK和非MK细胞Tag初始数量分别为3773147和3533805个,整个清晰的Tag数量分别为3291132和2967947,明显独特的tag数量分别为197769和245318个。其中上调基因表达数量为1161个,下调为902个;上调Tag表达数量为2717个,下调为1519个。结论 MKs和非MKs mRNA表达存在显著差异,差异基因编码产物与细胞内信号转导、新陈代谢、细胞发育、运动、细胞凋亡、细胞黏连和免疫应答等功能相关,进一步深入研究将有助于探讨巨核细胞的表达机制、信号传导及调控机制。基因芯片和solexa技术的检测结果存在重叠,同时又相互补充,两种方法联合应用能得到更完整的巨核细胞的基因表达谱。     

结肠黑变病相关基因的cDNA芯片筛查分析

目的 应用基因芯片技术研究结肠黑变病(MC)和正常成人结肠组织基因的差异表达. 方法 分别用Cy5和Cy3两种不同的荧光染料通过逆转录反应将MC组和对照组结肠组织的mRNA分别标记成探针,并与载有一组靶基因的基因表达谱芯片进行杂交.通过扫描荧光强度,计算机软件分析,寻找两组差异表达基因. 结果 MC组和正常对照组之间共筛选出93条差异表达基因,其中表达增加的基因有53条(2.0倍以上),表达降低的基因有40条(0.5倍以下). 结论 基因表达谱芯片筛选MC与正常成人结肠组织差异表达基因具有样品用量少、高速度、高敏感、高通量等特性.通过筛选所得差异基因提示MC的发病可能涉及细胞增殖、酯类代谢、能量代谢、细胞毒等多种因素,为进一步阐明MC的发病机制提供了新线索.     

骨髓活检塑包法在多发性骨髓瘤诊断中的价值

目的了解骨髓活检在多发性骨髓瘤诊断与鉴别诊断中的价值。方法运用塑料包埋切片技术观察32例多发性骨髓瘤患者的骨髓象表现,同时与骨髓涂片进行比较。结果多发性骨髓瘤骨髓切片中浆细胞以结节状和片状浸润为主,这类浸润方式对多发性骨髓瘤诊断的敏感性(90.6%)明显高于涂片中浆细胞>15%的指标(65.6%)。切片中骨髓增生程度也明显高于涂片。结论骨髓活检塑包切片法更能正确反映骨髓组织的真实情况,对多发性骨髓瘤的诊断、疗效判断方面的价值优于涂片。     

骨髓活检在多发性骨髓瘤诊断及鉴别诊断中的价值

目的:探讨骨髓活检在多发性骨髓瘤(MM)诊断与鉴别诊断中的价值。方法:同步观察多发性骨髓瘤38例患者骨髓涂片和活检塑料包埋切片。并与反应性浆细胞增多症20例患者作比较,以正常人20例作对照。观察骨髓增生程度、浆细胞增殖模式及浸润程度、网硬蛋白积分。结果:MM组患者骨髓造血组织在切片中的增生度明显高于涂片,两者差异有统计学意义(P<0.05);与反应性浆细胞增多症及正常对照组比较差异亦有统计学意义(P<0.05)。MM组切片中浆细胞以簇片-间质型、结节-间质型、结节型及塞实型浸润为主,以结节出现为阳性诊断敏感性36例(94.7%)明显高于涂片中浆细胞>15%的指标(71.0%);MM组网硬蛋白纤维积分为1 以上为63.2%,与反应性浆细胞增多症组及正常对照组比较差异有统计学意义(均为P<0.05)。结论:骨髓活检能准确反映骨髓组织的增生程度、浆细胞浸润情况及增殖模式、纤维增生程度,对MM的诊断及鉴别诊断有较高价值。     

Mesenchymal stem cells inhibit proliferation of lymphoid origin haematopoietic tumour cells by inducing cell cycle arrest

We have previously shown that mesenchymal stem cells (MSC) inhibit tumour cell proliferation, thus promising a novel therapy for treating cancers. In this study, MSC were generated from human bone marrow samples and characterised based on standard immunophenotyping. When MSC were co-cultured with BV173 and Jurkat tumour cells, the proliferation of tumour cells were profoundly inhibited in a dose dependent manner mainly via cell to cell contact interaction. Further cell cycle analysis reveals that MSC arrest tumour cell proliferation in G0/G1 phase of cell cycle thus preventing the entry of tumour cells into S phase of cell cycle.     

多发性骨髓瘤的基因表达谱分析

目的 :研究MM患者与正常人骨髓基因的差异表达。方法 :应用cDNA芯片技术对 1 0例初诊多发性骨髓 (MM)患者和 1 0名正常骨髓的单个核细胞的mRNA进行检测。结果 :在 2 0 4 8条基因中共发现差异表达基因5 6 6条。在MM中 2 37条表达增加 ,32 9条表达降低。结论 :MM的发生发展涉及多基因的改变 ,cDNA芯片技术可高效研究多个基因的表达水平     

多发性骨髓瘤的基因表达谱分析

目的：研究MM患者与正常人骨髓基因的差异表达。方法：应用cDNA芯片技术对10例初诊多发性骨髓(MM)患者和10名正常骨髓的单个核细胞的mRNA进行检测。结果：在2048条基因中共发现差异表达基因566条。在MM中237条表达增加，329条表达降低。结论：MM的发生发展涉及多基因的改变，cDNA芯片技术可高效研究多个基因的表达水平。     

130例多发性骨髓瘤临床特点与细胞形态学分析

目的:探讨多发性骨髓瘤(MM)的主要临床特点以及骨髓细胞形态学在MM诊断中的作用。方法:回顾分析130例MM患者临床特点并分析其骨髓及外周血涂片,观察骨髓瘤细胞的比例和形态特征。结果:130例MM患者临床表现中主要有贫血99例(76.2%)、骨痛81例(62.3%)、骨质破坏83例(63.8%)、肾功能损害70例(53.8%)、出血6例(4.6%)等。骨髓涂片中骨髓瘤细胞比例≥10%的126例(96.9%),骨髓瘤细胞比例在6.0%～10.0%的3例(2.3%),骨髓瘤细胞比例不增高的1例(0.7%)。结论:MM的诊断中,骨髓细胞形态学是非常重要的方法,但同时需结合临床表现及影像学、生化等方法。     

多发性骨髓瘤中人类疱疹病毒8型的定量分析及其相关基因的表达

目的 确定多发性骨髓瘤（MM）骨髓活检标本中是否存在人类疱疹病毒8型（HHV8）感染,病毒负荷量的差异与临床表现之间的关系。方法 实时荧光定量PCR确定骨髓活检标本中的HHV8病毒的负荷量,采用筑巢式PCR扩增患者外周血、骨髓穿刺和骨髓活检标本中HHV8 KS330233Bam片段,用逆转录－PCR方法了解HHV8病毒的致病基因病毒源白细胞介素－6（vIL-6)和病毒源干扰素调节因子－1（vIRF-1)的表达情况。结果 多数MM患者的骨髓活检标本可检出HHV8,荧光定量PCR发现阳性率为69．6％（16／23）;筑巢式PCR时的阳性率为82．6％（19／23）,骨髓穿刺和外周血标本的阳性率分别为4％（1／25）和0。临床分析表明病毒的检出可能与化疗有关。vIRF-1在骨髓活检标本中表达率很高,为83．3％（10／12）, vIL-6的表达率为0。结论 多发性骨髓瘤和HHV8感染有关,高表达的vIRF－1在多发性骨髓瘤发病的过程中可能起一定的作用。     

间充质干细胞对异体B淋巴细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨骨髓间充质干细胞(MSC)在体外对异体外周血B淋巴细胞增殖和凋亡的影响.方法 从骨髓中分离、培养MSC.从外周血中分离单个核细胞,L-亮氨酸甲酯去除单核细胞,以2-氨乙基硫脲溴化物(AET)处理绵羊红细胞(SRBC)的花环形成法,去除T淋巴细胞获得纯化的B淋巴细胞.用羊抗人IgM单克隆抗体(Anti-IgM,终浓度10μg/ml)刺激与不同比例的MSC(B:MSC 50:1、10:1、1:1)及不同浓度的MSC培养上清(12.5%、25%、50%)共培养的B淋巴细胞,72 h后四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色分析测B淋巴细胞的增殖.B淋巴细胞与MSC等比例,加或不加Anti-IgM,共培养24、48 h后,流式细胞术检测B淋巴细胞的凋亡.结果 10:1、1:1组B淋巴细胞A值分别为0.418±0.103、0.365±0.114,显著低于对照组的0.679±0.049(P＜0.01),1:1组显著低于50:1组(P＜0.05);50%MSC上清组B淋巴细胞A值(0.504±0.099),同对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05),并且显著低于12.5%组(0.669±1.023,P＜0.05).MSC不诱导B淋巴细胞的凋亡;B淋巴细胞与Msc共培养24、48 h,加或不加Anti-IgM,各组细胞凋亡率为(1.90±0.75)%、(2.33±1.01)%、(2.33±0.75)%、(1.39±0.63)%,组间比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 MSC及其上清抑制B淋巴细胞增殖,作用机制与MSC细胞数量和MSC分泌的细胞因子有关,但是在体外MSC不诱导B淋巴细胞的凋亡.     

多发性骨髓瘤患者骨髓上清液和血清DKK1表达水平及其临床意义

目的 分析研究多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)患者骨髓上清液和血清Wnt通路抑制因子Dickkopf-1(DKK1)表达水平,探讨DKK1在多发性骨髓瘤中的临床意义。 方法 本研究对象为2014—2015年新疆医科大学第一附属医院门诊及住院的20例MM初治患者和10例缺铁性贫血初治患者。实验方法采用双抗体夹心酶标免疫分析法(ELISA)检测20例初治MM患者(MM组)及10例缺铁性贫血初治患者(对照组)的骨髓上清液及血清DKK1表达水平。 结果 MM患者骨髓上清液DKK1水平为(8.9±2.8) ng/ml,对照组患者骨髓上清液DKK1水平为(1.3±0.9) ng/ml;MM患者外周血血清DKK1水平为(8.7±2.2) ng/ml,对照组患者外周血血清DKK1水平为(1.0±0.5) ng/ml。MM组骨髓上清液及血清DKK1表达水平与对照组之间比较差异有统计学意义(P=0.001)。MM组骨髓上清液和MM组血清的DKK1表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。 结论 MM患者骨髓上清液DKK1表达水平明显高于对照组。MM患者外周血血清DKK1表达水平明显高于对照组。MM患者的骨髓上清液和外周血血清DKK1表达水平差异无统计学意义。本研究揭示了能造成成骨细胞功能改变,活性减弱,加速破骨细胞分化,抑制成骨前体细胞亢进分化的DKK1是骨髓瘤骨病发生的重要因素。DKK1的表达水平高低与溶骨性病变相关。