外膜蛋白SDS—PAGE对空肠弯曲菌的分型研究

用SDS—PAGE技术检测分析不同来源的41株空肠弯曲菌外膜蛋白特征。根据外膜蛋白SDS—PAGE凝胶上六条蛋白带多少的组合和外膜蛋白主带分子量的大小可将其各分为七个和九个型；根据外膜蛋白SDS—PAGE定量聚类分析可将其分为七个型(以95%相似性为水准)．结合此三种方法可更细致地鉴别不同来源的菌株，表明外膜蛋白SDS—PAGE技术是鉴别分型细菌的有效方法．     

青藏铁路沿线鼠疫菌外膜蛋白种类的研究

目的研究并分析青藏铁路沿线鼠疫菌外膜蛋白种类及相对分子质量。方法鼠疫菌经破碎后采取超高速离心法提取外膜蛋白，利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）系统分离鼠疫菌外膜蛋白。结果在10％的SDS-PAGE上，37℃条件下的培养物可表达26条外膜蛋白带，28℃培养物可表达36条外膜蛋白。结论试验用鼠疫菌株可分泌标准的外膜蛋白，属YOP1型。     

鼠疫耶尔森菌外膜蛋白的克隆与表达

目的克隆并表达鼠疫耶尔森菌的多种外膜蛋白或外膜蛋白的定位、表达调控蛋白。方法通过PCR技术对目的基因进行扩增，其PCR产物经纯化、酶切处理后，再分别导入原核表达载体pET32a中，然后转化大肠埃希菌BL21(DE3)，IPTG诱导后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析和蛋白质芯片分析。结果获得了23个表达鼠疫耶尔森菌外膜蛋白或外膜蛋白的定位、表达调控蛋白的克隆子。全部重组蛋白质的纯度均在85％以上。结论构建了一系列重组表达质粒，为进一步研究鼠疫耶尔森菌外膜蛋白的结构与功能奠定了基础。     

外膜蛋白电泳：院内感染乙酸钙不动杆菌的克隆识别

乙酸钙不动杆菌引起的院内感染和流行病学调查问题日益严重，但对其克隆识别无有效手段。本文应用外膜蛋白电泳技术对从三家医院分得的院内感染相关株进行了同源性分析，分别得到三种类型分别一致的电泳图谱；而对不同来源的无关菌株分析结果，得到各不相同的电泳谱型。说明外膜蛋白电泳谱型技术是一种适用于院内感染相关病原体中乙酸钙不动杆菌的克隆识别技术，尤其适用于无法进行生物分型的菌株     

脉冲场凝胶电泳技术对成都市两起细菌性痢疾暴发的分型研究

目的 运用脉冲场凝胶电泳技术(PFGE)和聚合酶链反应(PCR)技术对成都市两起细菌性痢疾暴发分离株进行分析.方法 利用PCR检测志贺菌分离株ipaH基因和ial基因.用PFGE对菌株进行分型,所得结果用BioNumeries V 4.0软件UPGMA方法进行聚类分析.结果 所试54株分离菌ipaH基因均为阳性,48株为ial阳性.以Xba Ⅰ酶切后PFGE分型,崇州可分为4个带型,有26株型别一致,占实验菌株(36株)的72%,为优势菌株.自凉拌白肉中分离的菌株带型与优势菌株相同.大邑县可分为8个带型,有10株型别一致,占实验菌株(18株)的56%.崇州和大邑县的优势菌株带型差异较大.结论 利用PFGE能够有效地鉴别细菌性痢疾的暴发和传播来源.     

外膜孔道蛋白ompC、ompF的表达与大肠埃希菌耐药的相关性研究

目的 研究外膜孔道蛋白ompC、ompF引起细胞膜通透性改变与大肠埃希菌(ECO)对抗菌药物形成耐药的相关性.方法 设计复合引物对ompC全基因序列和ompF、ompA、fepA、cirA、chuA等基因序列进行扩增,回收PCR产物、钝化后测序;菌体外膜蛋白进行SDS-PAGE电泳,回收的目标膜蛋白条带经胰蛋白酶消化,采用质谱仪分析蛋白成分并进行蛋白序列的测定.结果 SDS-PAGE电泳图谱和质谱分析显示,7株大肠埃希菌均有相应的外膜孔道蛋白ompC和ompA表达,无外膜孔道蛋白ompF表达;第6、7菌株的孔道蛋白ompC和ompA表达量明显减少,但有铁运输蛋白chuA、cirA、fepA的表达;基因扩增显示7株大肠埃希菌均有ompF产物,耐药性较强的第6、7菌株还有fhuA和cirA扩增产物,但产物fhuA的相对分子质量小于ECO-klz(少54 bp).结论 持续使用抗菌药物将导致细菌外膜孔蛋白ompF低表达或不表达,外膜孔蛋白ompC氨基酸序列的改变影响相应蛋白的表达,使细胞膜通透性降低,从而增加细菌对抗菌药物的耐药性;高度耐药的大肠埃希菌伴随代偿性铁运输蛋白chuA、cirA、fepA的表达,维持细菌的新陈代谢,保持其高水平耐药性.     

十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳法定量分析镉接触工人尿蛋白

本实验测定了33例镉接触工人,45例正常人和5例慢性肾炎患者的夜间卧床期间尿样。以双缩脲法测定尿蛋白浓度;以分光光度扫描仪扫描固定于SDS-PAGE凝胶上的各区带染料,测定尿样中不同分子量蛋白的经例。尿蛋白SDS-PAGE图型分为正常型(生理型)、低分子量型、中分子量型及中高分子量型。镉接触工人组的尿蛋白排泄量、尿低分子量(MW≤4万)蛋白的比例和排泄量的均值均高于正常人组(P<0.01,P<0.001,P<0.01)。     

阪崎肠杆菌外膜蛋白基因的克隆与序列分析

目的:扩增并分析阪崎肠杆菌外膜蛋白基因。方法:根据肠杆菌外膜蛋白A基因的序列特点,设计引物,扩增阪崎肠杆菌外膜蛋白A(ompA)序列,并通过T载体克隆后测序。结果:序列分析表明其1044 bp的序列全长编码347个氨基酸,具有肠杆菌科细菌外膜蛋白序列的典型特征。同源性分析表明,该序列与其它肠杆菌属细菌的序列进行比较,其核酸序列同源性为86%到99%。结论:结果表明该序列为阪崎肠杆菌外膜蛋白基因。     

鼠疫耶尔森菌外膜蛋白抗原性研究

目的建立分析鼠疫耶尔森菌外膜蛋白抗原性的简便方法。方法采用DNAstarProtean和EMBOSS网络分析平台综合预测鼠疫耶尔森菌外膜蛋白YopE、YopH、YopT、YopJ、YopM的免疫原性,并通过蛋白质芯片技术对上述外膜蛋白的免疫原性进行验证。结果计算机综合预测分析显示外膜蛋白YopE抗原性最好,蛋白质芯片技术进一步证实YopE具有良好的免疫原性。结论软件预测结合蛋白质芯片检测的方法可用于筛选病原微生物抗原性蛋白。     

产金属酶合并外膜蛋白缺失的铜绿假单胞菌的检测

目的研究铜绿假单胞菌对亚胺培南(IMP)耐药机制,为临床合理选择抗生素提供确切的依据. 方法对20株亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌,以EDTA、CuCl2、 FeCl2、2-MPA、IMP为酶抑制剂,头孢他啶(CAZ)、亚胺培南为底物,在M-H平板上用纸片扩散法进行抗生素协同敏感性检测,并用聚合酶链反应(PCR) 检测金属酶基因;对3株耐亚胺培南(IMP)的菌株和3株敏感株,提取其菌株外膜蛋白,进行SDS-PAGE电泳分析,比较两组菌株外膜蛋白的差异. 结果协同法检测20株铜绿假单胞菌金属β-内酰胺酶有1例阳性,结果与PCR法检测结果一致,PCR产物经测序证实为VIM-2型金属β-内酰胺酶;金属β-内酰胺酶阳性的菌株在2 种底物纸片中均与EDTA、2-MPA和IMP 纸片有协同作用,其中2-MPA效果最好,与CuCl2、 FeCl2纸片无协同作用;在外膜蛋白SDS-PAGE电泳图谱上发现敏感株存在OprD2、OprE带,但耐药株缺乏OprD2,OprE带缺乏或者染色较淡;定量分析发现耐药株OprD2、OprE含量明显低于敏感株. 结论铜绿假单胞菌对IMP耐药的主要原因是外膜蛋白OprD2、OprE缺失或含量减少以及VIM-2型金属β-内酰胺酶的产生所致,或由两者共同作用所致.     

马鞍山市金黄色葡萄球菌分子特征与耐药性分析

目的了解马鞍山市金黄色葡萄球菌的分子特征和耐药性,为追踪传染源和临床用药提供依据。方法收集马鞍山市食物中毒来源、食品和腹泻患者等样本分离的金黄色葡萄球菌,用mini-VIDAS全自动荧光免疫分析仪检测菌株肠毒素,采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术对菌株做分子分型,采用琼脂稀释法对菌株做药敏试验。结果本研究共收集到59株金黄色葡萄球菌中,肠毒素阳性有40株(67.8%);PFGE分型结果,除4株不能分型外,55株菌株分为33个型别,两起食物中毒的11株菌分别属于同一型别;44散发菌株产生33个带型,表现为多样性。但某些分离自不同时间的菌株可有相同的带型;或者在同一时间、同一地点分离的菌株,其带型可表现不同。12种抗生素药敏试验结果表明,菌株对去甲万古霉素100%敏感,对其余11种则不同程度的耐药,其中对青霉素、氨苄西林的耐药性较高。结论应加强对食品和腹泻患者中金黄色葡萄球菌的监测分析,以预防食物中毒的发生和追踪传染来源。     

幽门螺杆菌外膜36kDa蛋白重组表纯化及初步鉴定

[目的]构建幽门螺杆菌(H. pylori) NCTC11637菌株36kDa (OMP36)外膜蛋白基因原核表达系统,探索研制H. pylori疫苗的新途径.[方法]培养和收集H. pylori NCTC11637菌株,提取基因组DNA, PCR扩增目的基因片断.将其克隆到T载体并测序,再将目的基因克隆入PET32a( ),构建重组表达载体PET32a-OMP36.转化E.coliBL21后IPTG诱导表达,经SDS-PAGE鉴定、镍亲和层析纯化、Western blot检测表达蛋白.(结果)测序分析表明,插入的基因片断为987bp,表达的蛋白的相对分子质量(Mr)约为36kDa,并显示具有良好的抗原性.SDS-PAGE检测表明,表达量占细菌总蛋白的37%,镍亲和层析纯化率约92%.Western blot检测表达蛋白具有良好的抗原活性.[结论]成功克隆了外膜蛋白OMP 36kDa的编码基因,其表达产物OMP 36有望成为新的Hp疫苗候选分子,为H. pylori疫苗的研制和试剂盒的开发奠定了良好的基础.     

福建省74株霍乱弧菌PFGE分子分型研究

目的采用脉冲场凝胶电泳技术(PFGE)对福建省霍乱监测点采集的霍乱弧菌进行分型,探讨其分布特征。方法福建省2008年采集到不同地区、不同来源的霍乱弧菌74株,用PFGE技术分析电泳酶切指纹图谱,用BioNumerics软件进行聚类分析。结果按照100%的相似度,可将21株小川型菌株分为20个PFGE型、44株稻叶型菌株分为39个PFGE型;按照90%的相似度,稻叶型菌株出现2个优势PFGE型别簇。结论福建省霍乱弧菌PFGE型别存在多态性。加强对外环境霍乱菌株的监测,可为霍乱防控提供有用的本底资料和早期预警;PFGE分型结合流行病学调查,是发现霍乱菌株污染传播链的有效手段。     

钩端螺旋体主要属特异性蛋白抗原分布及其免疫性研究

目的 确定致病性问号钩端螺旋体（钩体）属特异性外膜蛋白的抗原性和交叉免疫反应性，为研制通用性钩体基因工程疫苗及检测试剂盒提供依据。方法采用Ni—NTA亲和层析法，提取了4种钩体外膜蛋白主要基因型重组表达产物rLipL21、rLipL32／1和rLipL32／2、rLipL41／1和rLipL41／2、rOmpL1／1和rOmpL1／2，并用SDS-PAGE检测表达及提纯效果。上述重组蛋白常规皮下免疫家兔获得抗血清，显微镜凝集试验（MAT）检测各抗血清交叉凝集效价。采用盐变法提取了我国15群问号钩体参考标准株及非致病的双曲钩体Patoc Ⅰ株的外膜蛋白。以免抗血清为一抗，采用Westernblot检测上述4种外膜蛋白自然表达情况及其免疫反应性。结果 rLipL21、rLipL32／1和rLipL32／2、rLipL41／1和rLipL41／2、rOmpL1／1和rOmpL1／2表达量分别约占细菌总蛋白的10％、40％和35％、15％和10％、30％和15％，各重组蛋白SDS-PAGE提纯后均仅见单一的蛋白条带。重组蛋白兔抗血清在同一基因不同基因型表达产物之间有广泛的交叉免疫反应性．与不同钩体血清群的MAT效价为1：2～1：128。各血清群钩体外膜中均可检出上述4种外膜蛋白，但LipL21仅存在于问号钩体中。结论 LipL21、LipL32、LipL41、OmpL1均为钩体属特异性表面抗原，可作为通用性钩体疫苗及检测试剂盒的候选抗原。     

2007-2012年乐山地区HIV-1抗体阳性标本 蛋白免疫印迹带型分析

摘要:目的　了解乐山地区2007-2012年HIV-1抗体阳性标本蛋白免疫印迹带型分布情况,为临床诊断和治疗提供科学依据。方法　采用WESTERN BLOT免疫印迹技术进行检测并严格按照《全国艾滋病检测技术规范》2009年修订版和试剂说明书要求进行实验操作和结果判断,使用SPSS 11.5进行统计处理。结果　1163例确证阳性标本中除gag蛋白带型p55和p17阳性率较低外,其余带型阳性率均在94.00%以上;同时全带型组合出现率最高（57.70%）;不同性别与蛋白印迹带型比较发现单条带型p55（χ2＝7.427,P＝0.006）和p17（χ2＝6.370,P＝0.012）在男女性别中的出现率差异有统计学意义;不同年龄组间单条带型gp41（χ2＝8.827,P＝0.032）、p51（χ2＝11.418,P＝0.010）、p55（χ2＝16.622,P＝0.001）出现率差异有统计学意义;在不同样品来源间的带型p31（χ2＝14.662,P＝0.023）、p55（χ2＝18.594,P＝0.005）出现率差异有统计学意义。结论　乐山市HIV感染处于快速增长期,通过HIV-1抗体WESTERN BLOT带型分布在不同性别、不同年龄、不同人群中的带型分析,可对乐山市今后HIV感染者病原检测、诊断、传播源的追踪以及治疗提供有力的依据。     

留置导尿患者医院感染铜绿假单胞菌的分子流行病学研究

目的探索留置导尿患者医院感染铜绿假单胞菌（Ｐａ）的感染途径和传播机制。方法从患者小便、脓液、痰液和患者相关环境公用拖帕和洗涤池中共分离出Ｐａ５１株，应用血清学、细菌素、质粒图谱、质粒限制性内切酶图谱、外膜蛋白图谱等方法进行了研究。结果５１株Ｐａ的血清学分型率为８０．４％，细菌素分型率为７７．１％，质粒携带率为６８．６％，呈４种流行模式；来源不同的Ａ、Ｂ、Ｃ三型质粒代表株经用ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ酶切，呈现相同限制性内切酶图谱。９株不同质粒图谱模式菌株，得到两种不同类型外膜蛋白图谱。结论患者与患者之间通过床头柜、床单、导尿管等为媒介，相互交叉感染是导致Ｐａ医院感染的重要因素；一种血清型的细菌可能被分成几种菌素型，同种菌素型也不一定对应于一种血清型；同种血清型的菌株可用质粒图谱分成几种亚型；Ｐａ的外膜蛋白图谱呈高度相似性，图谱模式同血清型无明显联系     

HIV多抗原位点串联基因的表达及活性鉴定

目的在原核表达载体系统中对HIV—1／2型外壳蛋白多个抗原位点串联基因进行表达、纯化并鉴定其活性。方法人工合成含HIVgp41的2个抗原位点、gp120的3个群的各3个抗原位点及gp36的2个抗原位点的串联基因，克隆到原核表达载体pRSETB中，构建重组表达质粒pRSETB-env，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导其在大肠埃希菌BL21(DE3)中高效表达，利用固化金属离子配体亲和层析技术纯化表达蛋白．利用逐渐降低尿素浓度透析法使目的蛋白复性。用免疫印迹和ELISA法分别对表达产物进行鉴定。结果目的基因在BL21中有较高表达率，纯化后表达蛋白经十二烷基硫酸钠．聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)可见一条约32KD的蛋白带．与设计分子量相符。免疫印迹、ELISA试验显示该表达蛋白可与HIV患者血清较好结合．而与其它患者血清无交叉反应。结论成功构建了由HIV外膜蛋白多个抗原位点串联基因片段的表达载体pRSETB-env，并在原核细胞中高效表达，表达蛋白经一步纯化后纯度较高．并具有良好特异性和活性。     

中国98株布鲁杆菌OMP25基因高度保守

目的 分析布鲁杆菌毒力相关基因OMP25(编码外膜蛋白OMP25)在中国布鲁杆菌中的多态性分布,为研究致病机制,预防和控制大规模暴发布鲁菌病的流行病学研究提供理论基础.方法 利用聚合酶链反应单链构象多态(single-strand conformation polymorphism,PCR-SSCP)方法检测116株布鲁杆菌(18株标准菌株和中国98株野生菌株)OMP25基因,取不同带型菌株的OMP25基因进行测序.结果 116株布鲁杆菌呈现8种不同图谱(1～8型),其中2型和7型是个别中国野生株所特有.8种带型仅有10个不同碱基在对应类型中发生变异,对编码蛋白氨基酸的改变不多.中国98株布鲁杆菌的OMP25基因高度保守,具有比较稳定的抗原特征.结论 高度保守性有助于布鲁杆菌的流行病学检测,为研制更安全有效的疫苗提供了理论依据.     

3种金黄色葡萄球菌基因分型技术的评估

目的应用3种金葡菌基因分型方法分析食物中毒来源金葡菌,综合评价3种方法在金葡菌监测或暴发调查的可行性。方法应用多位点熔解曲线体系(MLMC)、葡萄球菌蛋白A序列分析(Spa typing)及脉冲场凝胶电泳(PFGE)三种基因分型技术对59株金葡菌进行分子分型。结果多位点熔解曲线分型体系将59株金葡菌分为19个型别,PFGE将其分为15个型别,Spa typing分为10个型别。Simposn差异指数分别是0.92、0.87和0.85。结论 3种分型方法应用于12起食物中毒调查,均能在同一起疫情中分析到型别一致的菌株,证实了菌株之间的亲缘关系。MLMC简单、快速,分辨率高于PFGE和Spa typing分型技术,适用于同一批暴发菌株的初筛。合理使用熔解曲线、Spa typing及PFGE分型方法对致病性金葡菌的防治具有重要意义。     

肺炎杆菌OMP图谱分析

本文用差速离心方法提取了３６株肺炎杆菌外膜蛋白（ＯＭＰ）。通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及薄层色谱扫描对主要外膜蛋白（ＯＭＰ）分子量及含量进行了测定，并根据５种主要外膜蛋白在各菌株间的分布差异进行了肺炎杆菌外膜蛋白初步分型