反义IGF—I基因转染抗小鼠B16黑色素瘤的研究

利用基因治疗方法中反义ＲＮＡ技术，通过脂质体包裹反义胰岛素生长因子－Ｉ（ＩＧＦ－Ｉ）基因导入小鼠Ｂ１６黑色素瘤，与对照组相比致瘤性降低，生长缓慢，荷瘤鼠的胸腺重量增大，脾脏的生发中心细胞增殖，白髓和红髓的淋巴细胞扩增的程度很明显，体内反义ＩＧＦ－Ｉ基因治疗与ＬＡＫ细胞治疗联合应用延长荷瘤小鼠的生存期的效果胜过两者单独应用的效果，结果表明：反义ＩＧＦ－Ｉ基因具有一定的抑制小鼠Ｂ１６黑色素生长的作用和     

反义周期蛋白B1基因抑制HT29细胞的增殖

用ＤＮＡ重组技术将人类ｃｙｃｌｉｎＢ１基因的全长ｃＤＮＡ，反向插入到真核表达载体ｐＸＪ４１－ｎｅｏ的ＢａｍＨ１位点，得到ｃｙｃｌｉｎＢ１基因的反义ＲＮＡ表达载体ｐＡＳ－Ｂ１。利用ＤＮＡ磷酸钙共沉淀方法，将ｐＡＳ－Ｂ１转染进ＨＴ２９细胞。在含有Ｇ４１８的培养基中，挑选出独立的细胞克隆。利用ｃｙｃｌｉｎＢ１ｃＤＮＡ作探针，Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交鉴定出一株内源性ｃｙｃｌｉｎＢ１ｍＲＮＡ受到抑制的细胞株ＨＴＢ１。比较ＨＴＢ１与对照细胞ＨＴ２９发现，ｃｙｃｌｉｎＢ１的反义ＲＮＡ明显抑制ＨＴ２９细胞的增殖，细胞内３Ｈ－ＴｄＲ参入量减少。流式细胞光度术分析，处于Ｇ１期细胞比率的升高与Ｓ期、Ｇ２＋Ｍ期细胞数量的下降都十分显著。     

小鼠白细胞介素12基因转染及其在黑色素瘤细胞B16F10中的表达

目的:探索小鼠白细胞介素12(mIL-12)基因在小鼠黑色素瘤B16F10细胞中的表达。方法:应用DNA重组技术将mIL-12基因插入pcDNA3.1真核表达载体中, 通过电穿孔转染B16F10细胞, 筛选出阳性细胞克隆后, 应用PCR、RT-PCR及Westernblot技术检测mIL-12基因在B16F10细胞中的整合及表达。结果:在DNA、mRNA及蛋白质3个水平均证实mIL-12基因已转染到B16F10细胞中并表达。结论:mIL-12基因可成功地转染体外培养的B16F10细胞并表达, 为进一步研究IL-12基因修饰的肿瘤细胞的基因瘤苗奠定了基础。     

人白细胞介素2基因转移对小鼠B16黑色素瘤细胞生长转移特性…

为开展人白细胞介素２基因转移瘤苗地抗肿瘤作用的研究。须首先获得能较稳定分泌ＩＬ的转基因肿瘤细胞，交了解其生长转移特性。应用ＸＭ６逆转录病毒载体将人ＩＬ２ｃＤＮＡ转入小鼠Ｂ１６黑色素瘤细胞。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证实获得ＩＬ２基因转移的Ｂ１６细胞。     

hTERT基因反义核酸对Jurkat细胞端粒酶活性影响

目的:检测hTERT基因反义核酸对Jurkat细胞端粒酶活性的影响及其机制。方法:TRAP法检测端粒酶活性,流式细胞仪检测hTERT蛋白表达,逆转录-多聚酶链式反应检测hTERTmRNA表达。结果:检测端粒酶活性,Jurkat细胞吸光度A值为0.492±0.051,hTERT反义核酸作用48hA值降为0.351±0.051,hTERT反义核酸作用72hA值降为0.238±0.024;检测hTERT蛋白表达,Jurkat细胞hTERT蛋白阳性率89.513%±3.389%,hTERT反义核酸作用48hhTERT蛋白阳性率低至77.237%±2.872%,hTERT反义核酸作用72hhTERT蛋白阳性率低至47.767%±1.326%。而hTERT正义核酸无上述作用。hTERT反义核酸作用Jurkat细胞48h、72h对hTERTmRNA表达无影响。结论:hTERT反义核酸降低Jurkat细胞端粒酶活性,机制可能是降低hTERT蛋白表达量,对hTERTmRNA无影响。     

K-ras反义核酸抑制肺腺癌细胞A549的生长

目的: 探讨K-ras反义核酸抑制肺癌生长的机制。方法: 应用Western blotting检测K-ras基因在6例肺腺癌标本和A549细胞中的表达;构建K-ras基因的反义表达载体(命名为antisense-K-ras-pcDNA3.1),转染后,MTT法测细胞的生长曲线,Annexin V检测细胞凋亡;Western blotting检测cyclin A、cyclinD1、cyclinE、CDK2、CDK4、P53、Rb和caspase-3的表达。结果: 在A549细胞和6例肺腺癌标本中,A549细胞和4例标本中K-ras基因高表达;MTT结果显示从第4 d开始,转染K-ras反义核酸的细胞生长明显受到抑制,而且细胞凋亡现象较明显;Western blotting显示转染反义K-ras基因的细胞中cyclin A、cyclin D1、cyclin E、CDK2和CDK4的表达降低,而caspase-3、P53和Rb的表达升高。结论: K-ras基因反义核酸能够抑制细胞生长,可能与cyclin A、cyclin D1、cyclin E、CDK2和CDK4的表达降低和caspase-3、P53、Rb的表达升高有关。     

bcl—2基因反义核酸对白血病细胞药物敏感性的影响

目的：探讨ｂｃｌ－２基因反义核酸对白血病细胞药物敏感性的影响。方法：应用细胞培养，免疫标记及流式细胞仪技术，检测了ｂｃ１－２基因反义寡脱氧核糖核苷酸（ＡＳＯＤＮ）和阿糖胞苷（Ａｒａ－Ｃ）对白血病Ｋ５６２和ＨＬ－６０细胞作用和ｂｃｌ－２基因表达。结果：Ａｒａ－Ｃ（１０μｍｏｌ／Ｌ）与ｂｃｌ－２ＡＳＯＤＮ同时作用比单独用Ａｒａ－Ｃ或Ａｒａ－Ｃ与正义寡脱氧核糖核苷酸（ＳＯＤＮ）细胞存活率显著减少（Ｐ＜０００１），并且流式细胞仪检测显示ｂｃｌ－２ＡＳＯＤＮ使ｂｃｌ－２蛋白阳性率降低。结论：ｂｃｌ－２基因反义寡核苷酸能抑制该基因表达，提高白血病细胞对Ａｒａ－Ｃ的敏感性     

可调控型反义基质金属蛋白酶9表达抑制人黑色素瘤细胞侵袭转移表型的研究

目的 探讨基质金属蛋白酶(MMP)-9与肿瘤转移的相关性。方法 利用基因重组技术构建反义MMP—9 cDNA四环素可调控型表达载体,用脂质体法转染反义MMP—9至转移性人黑色素瘤细胞株WM451(高表达MMP—9)。检测转染后细胞MMP—9表达水平的改变以及体外生长、侵袭、裸鼠体内成瘤及自发转移能力的变化。结果 转染反义基因后,WM451细胞MMP—9的表达及活性明显下降,同时MMP—2的表达也受到一定抑制,细胞生长速度、体外侵袭能力及棵鼠体内成瘤性及自发转移能力均受到一定程度抑制;运用四环素可以抑制四环素负调控逆转录病毒载体上的外源基因的表达。结论 反义MMP—9基因下调MMP—9的表达,可使人黑色素细胞转移能力受到一定程度的抑制,说明MMP—9在人黑色素瘤细胞转移过程中起重要作用。同时,四环素负调控逆转录病毒载体可以调控外源基因的表达。     

肽核酸作为反基因和反义治疗药物的研究进展

肽核酸是一类由２氨乙基甘氨酸组成的肽（聚酰胺）键的骨架替代普通核酸中核糖磷酸二酯键骨架构成的核酸类似物。ＰＮＡ与ＤＮＡ,ＲＮＡ核酸链以ｗａｓｔｏｎｃｒｉｃｋ碱基配对形成双螺旋ＰＮＡ／ＤＮＡ．ＲＮＡ,一定条件下第二分子ＰＮＡ键反平行与ＰＮＡ／ＤＮＡ（ＲＮＡ）以Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ硷基配对形成ＰＮＡ／ＤＮＡ（ＲＮＡ）ＰＮＡ三螺旋结构来抑制基因转录,由于ＰＮＡ的理化特性,除它的ＤＮＡ（ＲＮＡ）结合特性外在生物稳定性,细胞摄取,结构修饰的进展显示出作为反义反基因药物具有良好前景。     

hTERT基因反义核酸对Raji细胞端粒酶活性的影响

目的:观察人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的全硫代修饰反义寡核苷酸(ASODN)对Raji细胞端粒酶活性的影响。方法: 端粒酶聚合酶链反应-酶联免疫测定法检测Raji细胞的端粒酶活性；采用逆转录-聚合酶链反应方法检测hTERT基因mRNA的表达水平；以间接免疫荧光标记法通过流式细胞仪检测hTERT蛋白表达含量的变化。结果:hTERTASODN作用于Raji细胞后，hTERTmRNA表达水平明显降低，ASODN与Raji细胞共同孵育48h，hTERT蛋白表达阳性率降为50.15%±3.49%，72hhTERT蛋白表达阳性率降为33.35%±2.75%。而hTERT正义核酸作用24、48、72h对hTERT蛋白表达阳性率(65%)无显著影响(P＞0.05)。hTERT基因ASODN作用于Raji细胞48h，其端粒酶活性明显降低，作用72h，端粒酶活性明显受到抑制，分别与正义寡核苷酸组、空白对照组相比有显著差异(P＜0.05)。结论:hTERT基因反义寡核苷酸特异性地抑制Raji细胞的端粒酶活性。     

反义RNA体外抑制丙型肝炎病毒基因表达的研究

目的 研究丙型肝炎病毒(HCV)基因调控方式及反义RNA对HCV基因表达的体外抑制作用。方法 采用业已建立的HCV基因调控细胞模型，以重组质粒共转染策略，将反义RNA重组质粒与HCV5′非翻译区(5′UTR)调控的报道基因——虫荧光素酶(luc)重组质粒共同转染人肝癌细胞系(HepG2)，并以不表达反义RNA的原核重组质粒和不含有HCV5′UTR的luc重组质粒做为对照。转染细胞经短期培养后制备细胞提取液，荧光检测法检测luc基因的表达。结果 针对HCV5′uTR的反义RNA可以在体外有效抑制由HCV5′UTR调控的luc基因的表达，并具有剂量依赖效应。对照重组质粒转染实验证明，上述抑制作用呈序列特异性。结论 HCV5′UTR具有调控下游目的基因表达的重要功能，反义RNA可以在体外有效抑制由HCV5′UTR介导的病毒基因的表达。     

Enhanced metastasis of B16 melanoma cells by unexpected elevated expression of the metastasis-associatedTI-241 (LRF-1-, Jun-Fos-related) gene treated with antisense oligonucleotide

B16-F10 is a B16 mouse melanoma subline that preferentially metastasizes to the lung following intravenous injection. Previously we isolated TI-241 (LRF-1 homologue related to Jun-Fos) gene that was expressed higher in the high metastatic clone B16-F10 than the low metastatic clone F1. Transfection of TI-241 into F1 converted it into a high-metastatic cell. We studied the effect of antisense oligonucleotide designed to reduce the expression of TI-241 in B16-F10 cells, and observed an unexpected increase in the TI-241 level. The increase in the expression was maximal at 30 h, then it decreased during further culture with or without TI-241 antisense oligonucleotide. This increased TI-241 expression by antisense oligonucleotide was also observed in B16-F1cells whereas sense oligonucleotide did not affect the expression. B16-F10 cells cultured with TI-241 antisense oligonucleotide showed enhanced experimental metastatic potential to the mouse lungs compared with untreated B16-F10 and B16-F10 cultured with TI-241 sense oligonucleotide. © Rapid Science 1998     

反义封闭PKARⅠβ基因表达对双龙接骨丸含药血清体外促成骨细胞增殖作用的影响

目的:进一步明确cAMP依赖的磷酸激酶Ⅰ型调节亚基β(PKARⅠβ)在双龙接骨丸含药血清促进体外培养成骨细胞增殖过程中的作用。方法:构建表达 PKARⅠβ基因反义序列的重组子pcDNA-antiPKARⅠβ,脂质体法转导成骨细胞HFOB1.19,MTT法检测其增殖状况。结果:高剂量含药血清处理的反义基因封闭组中,HFOB1.19的增殖能力与空白血清对照组无显著差异(P>0.05)。结论:双龙接骨丸含药血清的体外促成骨细胞增殖作用与PKARⅠβ基因的表达密切相关。     

脂质体介导的cripto反义寡核苷酸抑制结肠癌细胞端粒酶活性

目的：探讨cripto反义寡核苷酸（ASODN）对结肠癌细胞端粒酶活性的影响。 方法: 应用脂质体瞬时转染法介导cripto 反义寡核苷酸，处理人结肠癌细胞系后，分别采用实时定量PCR检测cripto mRNA表达，用TRAP检测端粒酶活性，采用软琼脂集落培养试验检测结肠癌细胞的生长。 结果: Cripto ASODN可有效抑制结肠癌细胞集落生长，且与浓度相关。结肠癌细胞经Cripto ASODN转染后，端粒酶活性明显受到抑制，呈作用浓度和时间依赖性。并与ASODN的浓度和处理时间有关。 结论: cripto基因可能参与对结肠癌细胞端粒酶活性的调控。     

瘤源性IDO2对黑色素瘤形成及生长的影响

目的研究B16-BL6细胞内IDO2基因表达对小鼠黑色素瘤生长、发展及抗肿瘤免疫的影响。方法通过G418药物筛选建立稳定细胞系B16-BL6/IDO2^+及B16-BL6/IDO2^+,q PCR法检测IDO2的表达,MTT实验检测IDO2表达对细胞增殖的影响;然后以构建的稳定细胞在小鼠体内建立肿瘤模型,观察IDO2表达对黑色素瘤形成、生长的影响;最后在处死小鼠后通过流式细胞术检测引流淋巴结内Treg、CD4^+/CD8^+T细胞百分比及T淋巴细胞凋亡率,LDH法检测肿瘤特异性细胞毒反应来观察肿瘤组织内IDO2表达对引流淋巴结内肿瘤免疫的影响。结果成功建立B16-BL6/IDO2^+及B16-BL6/IDO2^-稳定细胞系:B16-BL6/IDO2^-细胞持续稳定低表达IDO2且不受LPS及IFN-γ的诱导;与B16-BL6/IDO2^+细胞相比,B16-BL6/IDO2^-细胞在体外增殖速度减慢,体内实验显示其肿瘤生长速度减慢、肿瘤质量减轻;进一步流式细胞术结果发现:引流淋巴结内Treg百分比下降、CD8^+T细胞数量增加、T淋巴细胞的凋亡率减少;LDH法检测CD8^+细胞特异性特异性杀伤肿瘤细胞反应增强。结论黑色素瘤细胞内IDO2的表达参与体内肿瘤的生长过程,且能影响其引流淋巴结内肿瘤免疫反应。     

反义寡核苷酸抑制缺氧/再给氧时内皮细胞细胞间粘附分子-1的表达

目的:探讨反义寡核苷酸(AS-ODN)对缺氧/再给氧(H/R)时内皮细胞细胞间粘附分子-1(ICAM-1)表达的影响。方法:流式细胞仪测定肾小球血管内皮细胞在缺氧、再给氧及加入AS-ODN后ICAM-1表达的阳性百分率。结果:缺氧10h,肾小球血管内皮细胞ICAM-1的表达与对照组无显著性差异,再给氧6hICAM-1的表达明显高于正常,加入AS-ODN后,ICAM-1阳性细胞的百分率下降40.6%。结论:AS-ODN可以降低H/R时内皮细胞ICAM-1的表达。     

修饰的反义寡脱氧核苷酸对胰腺癌细胞生长和靶基因表达的抑制作用

目的观察修饰过的反义寡脱氧核苷酸（ＡＳＯＮＤ）对人胰腺癌细胞生长和靶基因表达的抑制作用。方法用人工合成与ｃ－ｍｙｃ和Ｋｉ－ｒａｓ帽区互补的修饰的反义寡脱氧核苷酸，即反义硫代正磷酸寡脱氧核苷酸（ａｎｔｉｓｅｎｓｅｐｈｏｓｏｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＡＳＰＯＤＮ）处理人胰腺癌细胞系ＰＣ－２和ＰＣ－３。多次小剂量（１０μｇ）或一次性剂量（１５μｇ）ＡＳＰＯＤＮ处理细胞后计数细胞生长率和３Ｈ掺入率，并用逆转录聚合酶链反应检测靶基因表达。结果多次小剂量ＡＳＰＯＤＮ处理后，细胞生长、３Ｈ掺入和靶基因表达的抑制可长达２周以上，到第１４天时实验组的细胞生长率仅为对照组的３８％～４３％，３Ｈ掺入率为对照组的１８％～３３％；靶基因表达明显受抑或下调，经一次性１５μｇＡＳＰＯＤＮ处理后，细胞生长、３Ｈ掺入和靶基因表达的抑制可达４天。结论与以往的研究比较，表明ＡＳＰＯＤＮ较ＡＳＯＤＮ有更强的抑制细胞生长、３Ｈ掺入、靶基因表达的作用。     

hTERT基因反义核酸对化疗药物诱导CEM细胞凋亡的影响

目的：利用人类端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的反义寡核苷酸(ASODN)抑制人T淋巴细胞白血病细胞株(CEM)端粒酶活性后，探讨化疗药物(顺铂、柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙)对CEM细胞凋亡的影响。方法： 采用台盼蓝拒染法观察hTERT ASODN与化疗药物(顺铂、柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙)联合作用对CEM细胞系生长的影响；姬姆萨染色法观察凋亡细胞的形态变化；通过流式细胞仪对细胞凋亡峰进行定量分析。结果： hTERT ASODN作用于CEM细胞24 h再加入柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙，对细胞生长的抑制分别与单用柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙及hTERT正义寡核苷酸(SODN)联合柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙组相比，统计学上无显著差异(P＞0.05)。hTERT反义核酸作用于CEM细胞24 h加入顺铂，再共同作用48 h，CEM活细胞均数为2.318×108 cells/L，与单用顺铂组(3.250×108 cells/L)及hTERT正义核酸联用顺铂组(3.175×108 cells/L)相比，对细胞抑制明显增强(P＜0.05)。hTERT ASODN作用于CEM细胞24 h再加入顺铂作用48 h，细胞出现典型的凋亡形态学改变。hTERT ASODN与2.5 μmol/L顺铂联合作用于CEM细胞48 h的凋亡细胞百分率(19.47%)分别同SODN与顺铂联合作用组(6.97%)、单用顺铂作用组(6.02%)进行比较有显著差异(P＜0.01)。结论： hTERT基因反义寡核苷酸能促进顺铂诱导CEM细胞凋亡。