丙型肝炎病毒不同编码区His融合抗原的表达与纯化

目的:表达和纯化丙型肝炎病毒(HCV)-Core、NS3和NS4的His融合抗原H-C、H-NS3和H-NS4,并初步探讨其在抗体检测中的应用。方法:用重组基因工程技术,构建3种重组质粒C-pET-28a-c( )、NS3-pET-28a-c( )和NS4-pET-28a-c( )以及相应的工程菌;质粒经双酶切、PCR和测序鉴定正确后,IPTG诱导抗原表达,从IPTG使用浓度、诱导温度与时间3个方面优化抗原表达条件;用NTA柱纯化抗原后,分别用单片段重组抗原和混合抗原以酶联免疫吸附试验(ELISA)检测100份HCV抗体阳性血清和40份健康人血清。结果:用单片段重组抗原和混合抗原检测的100份HCV抗体阳性血清中,H-C、H-NS3和H-NS4的抗体阳性率分别为91%、75%和52%,而H-C、H-NS3和H-NS4混合抗原的抗体检出率为100%;检测40份健康人血清,结果全部为阴性。结论:HCV不同编码区单片段His融合抗原具有不同的抗体检出率,但均低于混合抗原的阳性率;在开发HCV抗体诊断试剂时,应采用HCV混合抗原。     

丙型肝炎病毒NS5区部分基因的克隆和表达及其抗体动态研究

分析丙型肝炎病毒ＮＳ５蛋白的抗原性,研究抗－ＮＳ５抗体的性质,动态变化规律及临床诊断意义。方法 用Ｇｏｌｄｋｅｙ程序对ＮＳ５蛋白的抗原决定簇进行预测分析,以ＲＴ－Ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ方法扩增ＮＳ５基因片段,并进行核酸序列分析。通过基因体外重组技术克隆表达目的的基因。     

丙氨酸氨基转移酶不合格献血者中不同区段丙型肝炎病毒抗体的筛查

目的探讨丙氨酸氨基转移酶（ALT）不合格献血者丙型肝炎病毒不同功能区抗体的检出情况。方法收集献血前乙型肝炎表面抗原（HBsAg）和ALT筛查中ALT不合格的血清样本,采用融合F4HVR1抗原检测样本中的第1高变区（HVR1）抗体,并与现有的C、NS3、NS4、NS5区抗体进行比较。结果在2035份ALT不合格样本中,共检测出34份阳性样本,其中HVR1区单独阳性2份,C区3份,NS3区4份,NS5区1份。结论丙型肝炎病毒各区段抗体筛查对提高输血安全性具有积极的作用。     

丙型肝炎患者抗-NS5抗体与α-干扰素疗效关系的研究

目的探讨丙型肝炎患者IgG抗-NS5抗体与α-干扰素疗效的关系.方法以重组HCV抗原及NS3、NS5区段多肽作为抗原,以EHSA法检测丙型肝炎患者α-干扰素治疗前血清IgG抗-NS3、抗-NS5、抗-HCV抗体及其滴度.结果α-干扰素治疗有效组的抗-NS5抗体的阳性率为80%(8/10),无效组为20%(2/10),两组比较有显著差异(P＜0.05);有效组抗-NS5抗体滴度显著性高于无效组(P＜0.05);有效组和无效组抗-NS3、抗-HCV抗体阳性率及抗体的滴度无明显差异(P＞0.05).结论治疗前血清IgG抗-NS5抗体可以作为α-干扰素疗效的一个预测指标.     

抗HCV NS3抗原单克隆抗体的研制与初步鉴

目的：为研制抗丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＮＳ３抗原单克隆抗体,用于检测丙肝患者血清中的ＨＣＶＮＳ３抗原。方法：用基因工程表达的ＨＣＶ非结构区ＮＳ３蛋白与鼠血清白蛋白交联后,免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,用杂交瘤技术获得能分泌单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的细胞株。结果：获得有实用价值的两株ＭｃＡｂ。两株ＭｃＡｂ与免疫抗原有较强的抗原－抗体反应,与ＨＣＶＮＳ４、ＮＳ５及核心区Ｃ３３肽、ＣＰ９、ＣＰ１０抗原无反应性,在竞争ＥＬＩＳＡ中,对ＨＣＶ－ＩｇＧ阳性血清有较好的抑制作用。结论：用基因工程表达的ＨＣＶ非结构区ＮＳ３蛋白,能够制备出有实用价值的单克隆抗体。     

Chronic HCV histology is predictable from HCV RNA and IgM anti HCV results

The aim of this study was to determine if knowledge of both the serum HCV RNA and serum anti core IgM antibody status enabled one to predict the histological severity in chronic hepatitis C. We studied 45 female patients with chronic hepatitis C infection. The presence or absence of IgM antibodies to HCV and HCV RNA by PCR in each patient's serum was determined. Liver biopsies performed were scored according to a modified Desmet's histological activity index. Negative HCV RNA patients had least histological change. HCV RNA positive patients who were also IgM antibody positive had lower scores than their IgM negative counterparts. The grade of histological severity is more accurately predictable from knowledge of both the HCV RNA and IgM anti HCV status of the patient.     

HCV核心抗原检测技术的临床应用

目的:探讨丙型肝炎病毒核心抗原酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法的临床应用价值。方法:采用丙型肝炎病毒核心抗原ELISA试剂盒对临床丙肝感染者血清进行检测,同时用HCV抗体ELISA检测试剂盒和HCV RNA基因扩增试验作为对照进行比较。结果:以HCV RNA PCR检测为对照,HCV抗原检测试剂盒的灵敏度为95.65%,特异性为100%,23例HCV RNA PCR检测阳性血清,用HCV抗体检测法进行检测,其中有3例阴性,将这3例阴性标本用HCV核心抗原检测法进行检测,其中2例为阳性。结论:丙型肝炎核心抗原ELISA检测方法能缩短窗口期,敏感性高,特异性好,费用低廉,在临床上具有很好的推广前景。     

丙型肝炎患者血清中丙型肝炎病毒交叉中和抗体的检测

[摘要]目的分析HCV感染者血清中是否存在交叉反应性中和抗体。 方法以分泌表达HCV包膜E2蛋白真核表达质粒转染的293T 细胞培养上清液中的HCV E2蛋白作为检测抗原,建立检测HCV E2抗体的ELISA方法,检测32份HCV抗体阳性的慢性丙肝患者血清,然后用免疫荧光分析血清与HCV全长包膜蛋白表达质粒转染的293T细胞的结合反应,再用5株HCV假病毒(HCVpp)及两株细胞培养产生的HCV(HCVcc)为模型分析血清的病毒中和活性。 结果32份HCV抗体阳性血清中,26份血清可检测出E2抗体,阳性率81.3%。其中HCV RNA阳性的12份血清均为E2抗体阳性,E2抗体水平与HCV RNA水平负相关。HCV E2抗体阳性血清对5株HCVpp以及两株HCVcc的感染性均有不同程度的中和作用,中和活性与E2抗体水平相平行。结论HCV感染可诱导保护性体液免疫应答,丙肝患者血清中存在交叉中和抗体,提示开发能诱导广泛交叉中和抗体的丙肝疫苗具有可行性。     

丙型肝炎病毒抗体单片段检测与总抗体检测的比较研究

目的 通过对国产HCV抗体分片段酶联免疫检测试剂与进口第三代抗-HCV检测试剂检测丙型肝炎病毒抗体的研究来了解丙肝病毒抗体单片段检测的意义。方法 采用国产基因重组表达的丙型肝炎病毒不同区(C、NS3、NS4、NS5)特异性抗原分别包被酶标板，以间接EIA法检测75例丙肝患血清中不同区特异性抗体。并以Ab—bott公司第三代抗-HCV试剂进行总抗体检测，同时做HCV—RNA检测。结果 75例血清中HCV不同区抗原片段NS3、HCV～C、NS4、NS5的抗体检出率分别为93．3％(70／75)、92．0％(69／75)、70．7％(53／75)、64．0％(48／75)。含2个片段以上的抗体检出率为94．7％(71／75)；抗-HCV总抗体的检出率为98．7％(74／75)；HCV—RNA检出率为77．4％(58／75)。结论 HCV不同区抗原片段的抗体检出率有差别，NS3、HCV—C检出率较高，其次为NS4、NSS。两种试剂有较好的相关性，HCV抗体单片段试剂可作为检测丙型肝炎病毒抗体的补充试剂，单独片段抗体阳性具有一定意义，动态观察NS3、NS4抗体水平可预测IFN的治疗效果。     

几种合成寡肽联合检测HCV感染

利用3个合成寡肽和抗-C100试剂盒,检测了165例慢性肝病中的HCV感染率,结果发现 68％(58/85)的慢性肝炎、68％(33/48)的肝硬化和59％(19/32)的肝癌均与 HCV感染有关。     

HCV体外感染正常成人肝细胞的研究

目的 为进一步研究丙型肝炎免疫发病机制，临床治疗和疫苗研制提供最接近自然感染状态的理想细胞模型。方法 体外二步灌流法分离正常成人肝细胞并维持培养1月以上，丙型肝炎患者血清感染上述肝细胞并用免疫组化和逆转录-聚合酶链反应法（RT-PCR法）检测被感染肝细胞HCV抗原表达及HCVRNA。结果 正常成人肝细胞可在体外存活1月以上，加丙肝患者血清4-36d后免疫组化法可检测到肝细胞内HCVNS3、NS5抗原表达，感染后2-36d，RT-PCR法可在感染肝细胞培养上清和细胞悬液中间断检测出HCVRNA。结论 正常成人肝细胞可在体外存活1月余并被HCV感染者血清感染。     

PCR检测丙型肝炎病毒感染各高危人群

用ＰＣＲ方法克隆了中国丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）感染者的５’端非编码区（５’－ｎｏｎｃｏｄｉｎｇｒｅｇｉｏｎ，５’－ＮＣＲ）序列，并根据此序列合成引物检测我国ＨＣＶ各高危感染人群的病毒复制情况，结果显示ＨＣＶＲＮＡ在慢性丙型肝炎患者的血清标中的阳性率为８１．８％（９／１１），在ＨＣＶ抗体阳性的血液透析患者血清标本中的阳性率为６３．６％（７／１１），在ＨＣＶ抗体阳性的献血员血清标中的阳性率为２０％（４／     

丙肝蛋白芯片用于病毒性肝炎血清流行病学调查

目的 用蛋白芯片技术确证ELISA法初筛抗-HCV阳性结果,观察HCV不同功能区抗体在不同地区低危人群中的检出率差异.方法 将HCV混合抗原,核心区抗原,NS3,NS4,NS5区抗原分别固定于同一玻片载体上制作蛋白芯片,选取48例2001年浙江省病毒性肝炎血清流行病学调查丙肝抗体ELISA法初筛阳性血清,用芯片检测不同功能区抗体.结果 48例初筛阳性血清用蛋白芯片检测有15例不同功能区抗体均为阴性,33例均有1～4种抗体阳性,抗C、抗NS3、抗NS4、抗NS5总检出率分别为51.5%、51.5%、48.5%和57.6%.其中舟山、衢州、温州、绍兴地区抗C检出率分别为53.3%、33.3%、44.4%、66.7%,抗NS3检出率分别为33.3%、100%、55.6%、66.7%,抗NS4检出率分别为60.O%、0%、33.3%、66.7%,抗NS5检出率分别为66.7%、0%、44.4%、83.3%.结论 HCV不同功能区抗体在不同地区低危人群中的分布存在差异,使用蛋白芯片检测低危人群中的HCV抗体,具有较高的特异性.     

丙型肝炎病毒5’非编码区PCR产物单链构象多态性分析及序列测定

目的：研究慢性肝炎病人血清、肝细胞肝癌组织中丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）５＇非编码区变异情况．方法：收集１０例慢性肝炎病人及４例肝细胞肝癌病人血清和肝细胞肝癌组织，检测抗ＨＣＶ抗体阳性，进行ＨＣＶ５＇非编码区ＲＮＡ的逆转录ＰＣＲ扩增，ＰＣＲ产物进行单链构象多态性分析，并对部分病例序列进行测定．结果：６例慢性肝炎病人血清及３例肝细胞肝癌组织中检测到ＨＣＶＲＮＡ，单链构象多态性分析显示各例条带之间无明显差异，对１例肝细胞肝癌组织中ＨＣＶ５＇非编码区ｃＤＮＡＰＣＲ产物的序列测定表明它与ＨＣＶ－１的同源性为９７．３％，与ＨＣＶ－ＢＫ的同源性为９７．７％．结论：我们的结果提示在西安地区ＨＣＶ５＇非编码区几乎是一样的，并进一步证实不同地区ＨＣＶ５＇非编码区的高度保守性．     

肝病患者中丙型肝炎病毒感染的免疫组化检测

以ＨＣＶＮＳ３区单克隆抗体、ＬＳＡＢ法检测了１１６例各类肝病肝组织（其中肝细胞癌５２例，肝炎后肝硬化１６例，慢性肝炎４０例，体质性黄疸８例）及６份正常肝组织（作为对照）中ＨＣＶ抗原的表达状况，结果表明，ＨＣＶ抗原在肝细胞癌、肝炎后肝硬化及慢性肝炎中检出率分别为１３．５％（７／５２）、１２．５％（２／１６）、１０％（４／４０），而在体质性黄疸及正常肝组织中未检出ＨＣＶ抗原。ＨＣＶ抗原可见于癌细胞或癌周肝细胞的胞浆或胞核中，实验结果支持ＨＣＶ与肝细胞癌的关联，ＨＣＶ感染对促使肝病的加重也具有一定影响。肝细胞癌中，胞核型ＨＣＶ抗原表达较多见。癌周组织中ＨＣＶ抗原检出率高于癌组织，提示ＨＣＶ可能主要作用于癌前病变，在肝细胞癌发生的初始阶段起作用，促使正常细胞恶性化。     

HCV感染的不同临床型HCV核心非结构区抗体检测结果和稳定性研究

目的:研究HCV感染的不同临床型HCV核心区、非结构区抗体检测结果及其稳定性。方法:采用酶联免疫试验(EIA)检测不同功能区抗体，聚合酶链反应(PCR)测定其逆转录病毒。结果C区C11与C22抗体检测结果各临床型均具良好的一致性；NS3区C7区与C33抗体检测结果差异较大。单片段C区C11抗体与Ns3区抗体C7抗体具有早期检测的价值，各临床型反应性较强(S／CO值较高)；且二者互补性较强，尤其HCV相关肝癌。HCV抗体检测不能见出所有HCV感染者，抗HCV阳性者可部分或大部分RT—PCR阳性；RT—PCR能检出HCV阴性标本，且均为急性感染和无症状ALT正常者。HCV相关肝癌HCV抗体和RT—PCR反应性较低。单片段C11抗体极易缺失或(和)变异，阳性者均出现病毒血症中；NS3抗体单独阳性多见，却少与病毒血症共存；NS4．5抗体亦可单独阳性。结论:C、NS3抗体出现较早，反应性强，检出率高，具有早期诊断价值。NS4、Ns5抗体出现较晚，在慢性感染时检出率较高，HCV抗体检测加入NS4、NS5抗体可提高其检测水平。RT—PCR对确诊HCV感染具有重要意义。     

Selection and application of serotypical synthetic peptides derived from hepatitis C virus NS5A region

Background   Numerous studies have reported a relationship between hepatitis C virus (HCV) genotype and the response to interferon therapy. Despite high sensitivity and specificity, genotyping methods can be performed only on HCV RNA positive samples. Serotyping might be a rapid and cost effective method for determining HCV genotypes, especially in patients with previously undetectable HCV RNA. In this study, an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) method for HCV serotyping with the genotype specific, synthetic peptides derived from HCV nonstructural 5a (NS5A) region was developed.
Methods  Based on 45 sequences, representing HCV genotypes 1-6 from Genebank, we synthesised 305 overlapping 30-mer peptides within NS5A region at positions 2182-2343 of HCV. All peptides for antigenic reactivity were tested by enzyme immunoassay with 69 human sera with antiHCV positive representing genotype 1-6. Forty hepatitis C patient sera were serotyped using serotype specific, synthetic peptides and genotyped by sequencing analysis.
Results  The correspondence of amino acids in HCV NS5A region with amino acids in positions 2182-2343 was very low among different genotype peptides. The highly conserved sequences were residues 2182-2211(R1), 2272-2301 (R7) and 2302-2331 (R9): the highly variable 2212-2241 (R3) and 2257-2286 (R6). Using 305 peptides, antigenic regions were located in R3, R7 and R9. Eighteen peptides from highly conserved region representing genotypes 1 to 6 showed broad immunoreactivity with sera containing antibody to all HCV genotypes. Immunoreactivity of the peptides from highly variable region was stronger with similar genotype sera.  Twelve unique peptides showed highly, genotype specific, reactivity with types 1 and 3 sera. Type 2 genotype specific peptides had cross reaction with type 3 serum. No type 4, 5 or 6 specific peptides were selected. The serotyping results showed high agreement with sequencing analysis.   
Conclusions  The major antigenic regions in HCV NS5A region were at 2212-2241(R3), 2272-2301(R7) and 2302-2331(R9).  Eighteen peptides from highly conserved region show genotype independent, immunoreactivity, useful for antiHCV antibody test. Twelve peptides from highly variable region show genotype 1 and 3 dependent immunoreactivity, useful for determining HCV serotype, especially for patients with previously undetectable HCV RNA.

     

HCV RNA含量与肝脏组织病理学损伤之间的关系

目的:探讨丙型肝炎病毒感染者血清HCV RNA含量和ALT浓度与肝脏组织病理学损伤之间的关系.方法:应用TaqMan实时荧光定量PCR技术检测681例HCV感染患者血清HCV RNA,电化学发光分析技术检测HBsAg,ELISA检测抗HAV IgM、抗HCV IgG和抗HEV IgM,Bayer全自动生化分析仪检测ALT浓度.H-E染色,光学显微镜观察组织病理损伤程度.结果:681例血清标本中,HCV RNA和抗HCV抗体均阳性和均阴性者分别是150例和420例,HCV抗体阴性而HCV RNA阳性40例,HCV RNA阴性而HCV抗体阳性71例.在排除了甲型、乙型和戊型肝炎病毒感染后,190例HCVRNA阳性患者中,36例患者在HCV RNA检测前后7 d内,曾进行过肝脏组织病理学检测,轻度、中度和重度肝脏病理学损伤患者血清中,HCV RNA浓度及ALT浓度相差均不显著.结论:血清学标志物和病毒核酸都是监测HCV感染的重要指标.HCV RNA浓度、血清ALT浓度与肝脏病理损伤相关性不显著,HCV RNA水平不能反映肝脏病理损伤程度.     

慢性丙型肝炎患者HCV不同基因片段抗体应答与脂代谢关系

目的:探讨慢性丙肝患者HCV感染与脂质代谢的关系及特点。方法:用酶联免疫法检测实验组慢性丙肝患者HCV不同基因片段抗体,并以羊抗人Apo-B血清分离其Apo-B,用PCR法检测Apo-B中HCV-RNA,同时作血脂监测。另设健康人和乙肝病例对照。结果:实验组病例HCV不同基因片段抗体呈现6种分布模式,其血清中均检出HCV-RNA较高载量,相应的Apo-B中(除1例阴性外)均有HCV-RNA表达,血清LDL、Apo-B等水平值显著低于对照组。两对照组血清及Apo-B中无HCV-RNA表达,且不同基因片段抗体阴性。结论:慢性丙肝患者HCV不同基因片段抗体应答与HCV复制密切相关,与Apo-B携带密切相关;其HCV-C和HCV-NS4、HCV-NS5与不同组分载脂蛋白相互作用,可能共同干扰脂质代谢。     

GBV-C和HCV共同感染的研究

目的：了解GBV-C和HCV的共同感染率,及不同引物和自制DIG标记探针检测GBV-C的效果。方法：定量RT-PCR检测肝炎患者血清标本中的HCV,RT-nested PCR检测HCV RNA阳性标本中的GBV-C,分析部分标本扩增产物的棱苷酸和氨基酸序列,Southern杂交鉴定GBV-C扩增产物的特异性．结果：211例丙型肝炎病人血清标本中,GBV-C 5’-NCR和GBV-CNS3区检出率分别为31．8%和22．8%,总阳性率为35．1％．部分标本扩增产物的核苷酸序列分析证实,RT-nested PCR获得的检测结果可靠,但序列中存在较高频率的随机突变．自制的GBV-C 5‘-NCR和NS3 DIG标记探针有较高的特异性,可用于检测相应的扩增产物。结论：GBV-C 5‘-NCR引物的检测效果优于GBV-C NS3,GBV-C与HCV有较高的共同感染率。