检测猪链球菌2型胞外因子（EF）的PCR方法的建立

根据猪链球菌2型的ef基因和ef^*基因合成了一对可扩增长度为626bp目的片段的引物,成功地建立了检测胞外因子（EF）的PCR方法。用HaeⅡ内切酶进行酶切,获得了与预期一致的354bp和272bp的两个片段,并进行了PCR的牧民性试验和敏感性试验。对马腺疫链球菌兽疫亚种、猪丹毒杆菌、猪肺疫巴氏杆菌和猪肺炎霉形体的PCR检测结果均呈阴性;检测的敏感度可达100个细菌。另外,对9株猪链球菌2型菌株进行了检测,7株呈EF阳性,1株呈EF^*阳性,1株呈EF阴性;对15份正常屠宰猪扁桃体分离物的检测结果1份为阳性。实验结果表明此法特异性和敏感性很高,可作为EF快速诊断和流行病学调查的手段。     

猪链球菌2型四川株溶血素主要抗原决定簇基因的克隆及表达

目的研究有效的猪链球菌病疫苗。方法采用PCR方法,以四川株、参考菌株和江苏分离株猪链球菌2型基因组DNA为模板扩增溶血素基因,克隆至PMD18-T载体。提取阳性质粒,进行PCR和酶切鉴定。经测序正确后,构建原核表达载体pET32a-SLY,将重组质粒转化入大肠杆菌BL21（DE3）中,经IPTG进行诱导。结果重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量约为43ku的重组蛋白,表达产物经纯化后,免疫印迹法（Western-blotting）分析证实,该重组蛋白与SS2-6阳性血清发生特异性反应。结论本实验旨在通过对溶血素主要抗原决定簇基因的克隆表达,分析表达产物的抗原性和免疫原性,为进一步对猪链球菌2型疫苗共表达的研制奠定基础。     

SS2人源分离株ZYH24 EF的表达纯化及其单克隆抗体的制备

目的建立猪链球菌2型(SS2)胞外因子(EF)的免疫学检测方法。方法将SS2四川人源分离株ZYH24EF抗原性强的区域进行克隆、原核表达,对表达的融合蛋白(rEF-GST)采用亲和层析法纯化、经凝血酶作用去除标签蛋白获得纯化的EF目的蛋白。以纯化的EF免疫BALB/c小鼠,间接ELISA方法筛选阳性克隆,对获得的抗EF单克隆抗体(McAbs)进行特异性分析,并建立猪链球菌EF检测方法。结果得到rEF-GST和EF相对分子量分别为62000和35000;建立了4株稳定分泌抗EFMcAbs的杂交瘤细胞系2G1、5H7、3H4和1F2;腹水的特异性鉴定结果表明4株McAbs能特异性的识别EF;以2G1单抗腹水和抗EF多克隆抗血清建立的夹心ELISA可特异地检测EF。结论4株抗EFMcAbs的制备对猪链球菌检测试剂盒的研制以及该病的防治有重要意义。     

2型猪链球菌Rgg调控因子的序列结构分析及原核表达

目的 克隆2 型猪链球菌Rgg转录调控因子编码基因并进行原核表达和纯化,并对其进行生物信息学分析和结构预测.方法 PCR扩增2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33基因组的rgg基因,构建重组表达质粒pQE30-rgg,转化大肠杆菌M15,筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE 鉴定表达产物;确定最佳诱导条件后,大量培养诱导重组表达菌,Ni²⁺亲和层析柱纯化重组蛋白,非变性PAGE电泳分析其体外聚合状态.结果 整个Rgg蛋白由15个α螺旋和2个β转角组成;构建的重组质粒在宿主菌中可高效表达,15 ℃过夜诱导获得可溶性重组蛋白的比例最高;获得了较高纯度的Rgg重组蛋白,并证实其在体外可形成同源二聚体.结论 成功地原核表达并纯化了Rgg重组蛋白,证明它存在二聚体结构,为进一步研究其调控机制奠定了基础.     

猪链球菌2型毒力相关因子及保护性抗原最新研究进展

摘要：猪链球菌（Streptococcus suis）感染是影响全世界养猪业重要的经济问题。根据荚膜多糖可划分为35个血清型,其中猪链球菌2型（Streptococcus suis serotype 2,SS2）最具致病力、流行范围最广。SS2不仅导致猪的疾病,也可感染与养猪业密切接触的人群,是重要的人兽共患病原菌。虽然目前已鉴定了多种SS2毒力因子,但对SS2的感染、致病机制仍缺乏系统的了解,本文对近三年来新发现SS2毒力因子及保护性抗原做一综述。     

猪链球菌2型福建分离株的主要毒力基因分析

目的为了解福建地区猪链球菌2型菌株毒力因子分布情况。方法选取谷氨酸脱氢酶(gdh)、荚膜多糖(cps)、溶菌酶释放蛋白(mrp)、胞外因子(ef)、溶血素(sly)、纤连蛋白/血纤蛋白原结合蛋白(fbps)及毒力相关序列orf2等7个猪链球菌2型主要毒力基因,分别设计了7对引物,采用PCR方法,对本室分离保存的猪链球菌2型福建分离株的毒力基因进行分析。结果从屠宰生猪体内分离的4个猪链球菌2型菌株和SS2PFJ07株基因型为gdh+/cps2J+/mrp+/ef-/sly-/fb-ps+/orf2+,另1株从生猪体内分离的分离菌株基因型为gdh+/cps2J+/mrp+/ef+/sly+/fbps+/orf2+。结论福建地区生猪中猪链球菌2型至少有两种毒力基因型。     

2型猪链球菌酪氨酸激酶Cps2C基因过表达株的构建

目的 构建2型猪链球菌酪氨酸激酶Cps2C基因过表达株,为cps2C基因功能研究提供实验材料。方法 使用重叠延伸PCR技术将延伸因子TufA(又名EF-Tu,编码基因为SSU05＿0530)的启动子(命名为P0530)与cps2C基因连接为P0530cps2C片段,将P0530cps2C酶切后连接至猪链球菌-大肠埃希菌穿梭质粒pSET2,构建过表达质粒pSET2::P0530cps2C。将pSET2::P0530cps2C电转化导入S.suis 2野生毒株05ZYH33感受态细胞,抗性及组合PCR筛选得到cps2C过表达株。qRT-PCR检测过表达株cps2C基因的转录水平。结果 重叠延伸PCR成功将P0530启动子片段(300 bp)和cps2C基因片段(696 bp)拼接为P0530cps2C(996 bp),片段及载体经BamH I和EcoR I酶切后连接,成功构建出过表达质粒pSET2::P0530cps2C;将pSET2::P0530cps2C电转化导入S.suis 2 05ZYH33感受态细胞,抗性筛选及组合PCR检测结果显示cps2C过表达株构建成功。提取野生株05ZYH...     

3个猪链球菌2型四川分离株4个毒力因子基因序列测定与分析

目的设计了特异性引物对3个致病性猪链球菌2型(Ss2)四川分离株4个主要毒力因子基因mrp、epf、sly和orf2分别进行了扩增,序列测定与分析结果表明3个Ss2四川分离株均存在4个毒力因子基因mrp、epf、sly和orf2,其核苷酸序列与1998年江苏分离株9801及国外参考菌株的同源性均大于99.5%,提示3个四川分离菌株与1998年江苏流行的高毒力菌株可能具有共同的来源。     

猪2型链球菌毒力因子研究进展

猪链球菌根据菌体荚膜抗原特性的不同,可以分为35个血清型(1—34型及1/2型)〔1〕,其中以2型流行最广,对猪的致病性最强,其次是1、4、7、9型和1/2型等。猪链球菌2型又称为猪链球菌血清2型或荚膜2型猪链球菌,分类上属于兰氏分类法的R群〔2。此菌通常以引起断奶仔猪关节炎、脑膜炎     

2型猪链球菌细胞分裂蛋白GpsB的原核表达及其鉴定

目的 利用原核表达系统诱导表达2型猪链球菌(Streptococcus suis 2,S.suis 2)分裂相关因子GpsB重组蛋白,为后续研究奠定基础。方法 以S. suis 2菌株05ZYH33全基因组DNA为模板,经PCR扩增得到目的基因片段。目的基因经双酶切后连接至表达载体pET32a,转化大肠杆菌(Escherichia coli, E. coli)DH5α感受态细胞。重组质粒经测序鉴定正确后转化E. coli BL21感受态细胞。获得的重组表达菌经IPTG诱导表达目的蛋白。利用Ni离子亲和层析柱纯化重组蛋白,并进行SDS-PAGE和Western blot 鉴定。利用重组蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体。结果 成功构建出重组表达载体pET32a^gpsB,并经IPTG诱导表达出目的蛋白。重组蛋白主要存在于表达菌裂解液上清中,分子质量约30 kD,与预期大小一致。Western blot 检测发现,该蛋白能被His-Tag 单克隆抗体特异性识别。制备的多克隆抗体能特异性识别重组GpsB蛋白(rGpsB)。结论 成功表达和纯化了rGpsB并获得了该蛋白的多克隆抗体,为进一步研究该蛋白在S.suis 2 分裂过程中的作用鉴定了基础。     

猪链球菌2型甲基受体趋化蛋白编码基因05SSU0273的原核表达及纯化

目的 原核表达猪链球菌2型甲基受体趋化蛋白编码基因05SSU0273。方法 通过PCR方法检测该基因在不同血清型猪链球菌中的分布情况,然后利用获得的猪链球菌2型05SSU0273基因片段, 构建重组表达载体pET32a::05SSU0273。将质粒转入E. coli BL21中,经IPTG诱导,SDS-PAGE和Western blot实验证实目的基因的表达, 然后以His亲和层析柱纯化重组蛋白。结果 在S. suis 2 35个血清型标准株中,有20株分离株扩增出目的条带。重组质粒可在宿主菌中高效表达,经镍柱亲和层析得到相对分子质量为43 kD的重组蛋白。结论 本实验成功获得S. suis 2 MCP蛋白,为研究其在猪链球菌2型致病过程中发挥的作用奠定了基础。     

猪链球菌2型谷氨酸脱氢酶基因的克隆表达及酶活性测定

目的克隆表达猪链球菌谷氨酸脱氢酶(GDH),并测定其酶活性。方法设计引物采用PCR法自海安病人分离株Habb基因组扩增GDH的编码基因gdh,进行序列分析;构建重组表达质粒pGEX4T-2-gdh,转化E.coliBL21(DE3),IPTG诱导表达,PAGE检测;通过亲和层析纯化,获得融合蛋白GST-GDH,用凝血酶剪切去除GST,获得完整的GDH纯化蛋白后测定其酶活性。结果PCR法自猪链球菌菌株Habb基因组扩增出约1.3kb的目的片段;序列分析显示猪链球菌的GDH具有GDH蛋白家族I的典型保守序列;体外构建筛选原核表达质粒pGEX4T-2-gdh,诱导重组体,表达的蛋白经PAGE初步测定其相对分子质量(Mr)约为71×103;用凝血酶酶切去除融合蛋白中的GST标签后得到的蛋白相对分子质量为45×103;GDH活性测定显示猪链球菌GDH利用α-酮戊二酸做底物,用NADPH做辅酶催化氨的同化和谷氨酸的合成。结论克隆并表达出猪链球菌GDH;猪链球菌GDH属于GDH蛋白家族I,是NADP(H)-特异性GDH。     

广东省猪链球菌2型菌株毒力基因及分子分型分析

目的 掌握广东地区猪链球菌2型菌株毒力因子及分子分型情况,为诊断、治疗和制定防控措施提供科学依据。方法 选取荚膜多糖(cps2J)、溶菌酶释放蛋白(mrp)、溶血素(sly)、谷氨酸脱氢酶(gdh)、胞外因子(ef)等5个猪链球菌2 型主要毒力基因,分别设计引物对分离自病人、病猪的22株猪链球菌2 型菌株进行PCR检测,并对菌株进行MLST分型分析。结果 22株菌分为5种毒力基因型,其中cps2J+/mrp+/sly+/gdh+/ef+型别为病人及病猪菌株所共有,cps2J+/mrp+/sly-/gdh-/ef+、cps2J+/mrp+/sly-/gdh+/ef+为病人菌株所特有,cps2J+/mrp-/sly+/gdh+/ef+、cps2J+/mrp-/sly-/gdh+/ef-为病猪菌株所特有;MLST分型结果显示,22株分为ST1、ST7和ST28三个型别,其中ST1、ST7型为病人和病猪菌株所共有,均同属于ST1克隆复合物,ST28型为病猪所特有。结论 广东地区病人、病猪的猪链球菌2 型菌株毒力基因型及MLST分子分型均呈现多样化,且部分型别为两者所共有,为阐明猪传染给人提供了直接的证据。     

环境条件对猪链球菌2型电转化效率的影响

目的探讨环境条件对猪链球菌2型强毒株05ZYH33电转化效率的影响。方法采用电穿孔的方法对05ZYH33强毒株进行外源DNA的转化,通过调整参数,对影响电转化效率的主要因素进行探索。结果电穿孔法可以成功地转化猪链球菌2型强毒株05ZYH33,转化效率最高可达107/μg质粒DNA。结论猪链球菌2型强毒株05ZYH33高效电转化方法的建立,为深入研究该病原菌的功能基因组学奠定了基础。     

2型猪链球菌中国强毒株溶血素样蛋白基因的原核表达及其抗血清制备

目的克隆2型猪链球菌溶血素样蛋白(Hemolysin-like protein,HLP)编码基因并进行原核表达,纯化重组蛋白并制备相应的多克隆抗体。方法采用PCR法,从2型猪链球菌中国强毒株05ZYH33基因组扩增基因hlp,构建重组表达质粒pET32a::hlp,转化E.coliBL21(DE3),筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定表达产物;His亲和层析柱纯化重组蛋白;重组蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,间接ELISA和Western blot检测多抗血清。结果构建的重组质粒在宿主菌中可高效表达,His亲和层析柱纯化获得较高纯度的重组蛋白;重组蛋白免疫新西兰兔后获得高效价的抗血清。结论在原核系统中成功地表达了hlp基因编码的蛋白,并以重组蛋白为抗原制备出高效价的多抗血清,为进一步研究hlp基因的功能奠定了基础。     

血清2型猪链球菌全菌体蛋白的免疫蛋白质组学研究

目的寻找血清2型猪链球菌(Streptococcus suis,S.suis)全菌体蛋白中具有抗原活性的蛋白,为S.suis特异诊断抗原和新的疫苗侯选抗原的筛选提供线索。方法采用免疫蛋白质组学技术,分析和研究血清2型S.suisSC84菌株全菌体蛋白中能与猪链球菌病人恢复期血清发生免疫杂交的蛋白点。应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对这些蛋白进行鉴定。结果S.suisSC84全菌体蛋白与3份猪链球菌病人恢复期血清进行免疫杂交反应,发现8个与IgG抗体发生阳性反应的蛋白点。经MALDI-TOF-MS鉴定,这8个蛋白分别为溶菌酶释放蛋白(MRP)、琥珀酸脱氢酶/延胡索酸还原酶黄素蛋白亚单位(SDHFp/FRDFp)、触发因子(TF)、延长因子G(EF-G)、细菌糖磷酸转移酶系统甘露糖特异ⅡAB亚单位(PTS/MAN-IIAB)、丙酮酸激酶(PK)、6-磷酸果糖激酶(6-PFK)、色氨酸-tRNA合成酶(TrpRS)。MRP定位于胞壁;TF、PTS/MAN-IIAB、PK及TrpRS定位于胞质;SDHFp/FRDFp、EF-G及6-PFK定位于胞外。并且确定了它们在S.suis05ZYH33菌株基因组的编码基因。结论在S.suisSC84全菌体蛋白中发现8个抗原活性蛋白,其中SDHFp/FRDFp、TF、EF-G、PTS、PK、6-PFK及TrpRS是在S.suis新发现的抗原性蛋白,它们作为特异诊断抗原和疫苗侯选抗原的前景有待进一步研究。     

福建猪群猪链球菌2型血清学调查与分析

为了解福建省猪群猪链球菌2型的感染情况,应用猪链球菌2型抗体检测试剂盒测定1033份采自福建省9个地区65家猪场的血清样品和304份临床血清样品。结果显示,福建各地区猪链球菌2型血清抗体猪场阳性率为50%～100%,阳性猪场数占被检猪场总数的78.46%(51/65);抗体阳性猪群中个体阳性率为7.14%～100%,平均阳性率为34.82%(297/853),阳性率≥50%的猪场数占检出阳性场总数的37.25%(19/51)。所有被检样品的平均阳性率达到25.65%(343/1337)。这些结果说明显示本省大多数猪场存在猪链球菌2型菌株污染,相当比例的猪群存在猪链球菌2型隐性感染,具有发生2型猪链球菌病的风险。