大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养及生物学特性

用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),体外培养传代扩增,观察细胞生长特性,对细胞进行免疫组化染色鉴定,电镜观察细胞形态。动态观察示培养细胞具有不断增殖的干细胞特性,并保持细胞活性。证实密度梯度离心结合贴壁法以及消化传代能有效分离纯化和扩增骨髓MSCs,培养的细胞具有骨髓MSCs的基本表型和特性。本研究可为临床进行细胞移植奠定基础。     

逆转录病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达

目的:观察逆转录病毒介导绿色荧光蛋白基因在SD大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)中的表达,为干细胞移植机制的研究提供基础.方法:采用密度梯度离心法分离培养BMSCs,诱导培养液诱导其向成脂肪方向分化,行细胞表面抗原鉴定,及油红O染色评价细胞成脂肪情况.在此基础上,采用逆转录病毒pLEGFP-N1对细胞进行荧光蛋白标记,观察细胞形态学改变荧光表达的时间与强度,计算转染率.结果:细胞扩增迅速,形态良好,纯度较高,经诱导后细胞内可见脂滴.逆转录病毒载体pLEGFP-N1成功标记SD大鼠骨髓间充质干细胞,并对4 wk体外培养进行了良好的标记.结论:逆转录病毒pLEGFP-N1转染效率高,转染成功的BMSCs可以长期稳定表达目的基因,是一种理想的病毒载体.     

重组大鼠GATA4-pEGFP基因在骨髓间充质干细胞的表达及意义

目的 体外获得表达重组大鼠GATA4-pEGFP基因的骨髓间充质干细胞(MSCs),为进一步研究后者在心肌梗死治疗中的作用奠定基础.方法 提取胎鼠心肌细胞总RNA,RT-PCR法扩增获得GATA4基因,将目的基因克隆到pEGFP-N3载体并获得重组后GATA4-pEGFP质粒,采用密度梯度离心法联合贴壁法分离骨髓单个核细胞并获得MSCs.将重组质粒GATA4-pEGFP以Lipo2000转染到大鼠MSCs,G418筛选2周,Western blot和荧光检测重组质粒在MSCs中的表达情况.结果 成功构建重组大鼠GATA4-pEGFP真核表达载体并转染入MSCs中,Western blot和荧光检测证实GATA4-pEGFP基因在MSCs中呈阳性表达.结论 成功建立表达大鼠GATA4-pEGFP基因的MSCs,此为利用组织工程学方法治疗心肌梗死的研究奠定了基础.     

全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞

目前,原位肝移植仍然是治疗终末期肝病最有效的措施,但肝源缺乏、费用昂贵及免疫排斥反应等限制了其广泛应用.干细胞移植是目前具有发展潜力的一种治疗手段,其中骨髓间充质干细胞(BMSCs)由于具有干细胞的多向分化潜能、取材方便、易于体外分离及扩增等特点,在组织工程及临床方面受到人们广泛关注.     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定

目的 探讨体外分离和培养大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的生物学特性,对其表型和生长曲线进行初步鉴定.方法 采用全骨髓培养法提取培养MSCs,绘制原代及三代细胞生长曲线,利用免疫组化法检测表面标志物CD34、CD44;流式细胞分析法检测表面标志物CD90.结果 成功培养出MSCs,免疫组化CD44阳性表达,CD34阴性表达;流式细胞术CD90阳性表达.结论 该实验分离培养的细胞群与MSCs的生物学特性相吻合,说明MSCs易于体外分离、培养和扩增.     

一种改进的人骨髓间充质干细胞培养方法

目的提高体外培养人骨髓间充质干细胞(HMSCs)的获得率和扩增率。方法在无菌条件下采用骨髓穿刺术提取健康人骨髓2～3ml加入含10%胎牛血清(FBS)的α-MEM培养基中,按2×106/cm2密度接种于培养瓶中,置于培养箱中培养。第3天半量换液,第6天用PBS冲洗三遍后全量换液,待细胞生长至80%～90%融合时,消化传代;倒置显微镜进行细胞形态学观察;MTT法测定细胞P1和P5生长曲线;应用流式细胞仪检测细胞表面CD34和CD29抗原的表达进行细胞鉴定。结果分离HMCs大小较为均匀,基本上呈梭形或星形;细胞生长曲线测定表明接种后第3天细胞进入指数增生期,至第5天进入平台期,随着传代次数的增加,细胞增殖速度变慢;经流式细胞仪检测显示CD34阴性、CD29阳性。结论本实验采用贴壁法培养的骨髓细胞为HMSCs,本培养体系能有效地提高HMSCs的获得率和扩增率。     

SD大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养及表型、纯度鉴定

目的探索获得高纯度MSCs简单、系统的实验方法。方法采用贴壁培养法体外培养SD大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）,确定最佳接种密度,经数次传代后纯化,以表面抗原CD29、CD44作为标志分子,CD34作为阴性对照,免疫荧光法鉴定MSCs的生物学特性及纯度。结果以0．5—1×10^10个／L的细胞密度接种骨髓细胞原代培养时间明显缩短,免疫荧光法鉴定MSCs生物学特性好,第3代时已达较高纯度。结论本实验建立了较为理想的MSCs体外培养体系,纯化速度快,鉴定方法简单,为进一步研究MSCs生物学行为及临床应用奠定了基础。     

不同培养方法对骨髓间充质干细胞贴壁和纯度的影响

目的 探讨骨髓间充质于细胞(MSCs)理想的分离、培养方法.方法 将MSCs分别于普通培养瓶、Co60培养瓶、胶原培养瓶中培养,观察三批标本细胞贴壁情况;将3个批次标本细胞分别用IMDM、1640和Mesencult培养液培养,观察细胞纯化情况;流式细胞术检测细胞表面标志.结果 胶原培养瓶及Co60培养瓶细胞贴壁,情况明显好于普通培养瓶,且后者费用低;MesenCult培养体系能获得高纯度MSCs,且传代后细胞不易分化.流式细胞术示三种培养体系中细胞表型均表现为CD34(-)、CD45(-)、CD71(++)、CD44(++)、CD90(++).结论 应用Co60照射处理的培养瓶结合MesenCult培养基可以收获大量、高纯度的MSCs;本实验为MSCs进一步的研究及其用于临床提供了实验方法及依据.     

人骨髓间充质干细胞体外培养及其生物学特性分析

目的探讨人骨髓间充质干细胞（MSC）的体外分离培养方法,并分析其生物学特性。方法无菌条件下抽取健康志愿者骨髓,采用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞,培养在含10%胎牛血清的DMEM培养基中,用贴壁筛选法纯化获得MSC。相差显微镜下观察细胞形态学变化,细胞计数法绘制生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面抗原及细胞周期。结果原代和传代培养的细胞呈梭形,具有较强的生长增殖能力。细胞表面CD90、CD105表达阳性,CD34、CD11b阴性。第1、3、5代MSC生长曲线呈S形,均经历潜伏期、对数生长期和平台期。第3代MSC中,G0/G1期细胞约占77.42%,S＋G2/M期细胞约占22.58%。结论采用密度梯度离心结合贴壁筛选培养法可获得纯度较高的MSC,且该细胞增殖活性较强。密度梯度离心结合贴壁筛选培养法是一种简单、有效的分离纯化MSC的方法。     

慢病毒载体介导人缝隙连接蛋白43基因在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达

目的构建带有缝隙连接蛋白43基因的慢病毒载体,并实现该基因在大鼠骨髓间质干细胞中的表达。方法通过逆转录聚合酶链反应获得人缝隙连接蛋白43基因,利用infusion技术重组构建慢病毒载体质粒FUGW-缝隙连接蛋白43,在脂质体介导下与包装质粒和包膜质粒VSVG共转染293T细胞包装生产慢病毒。所获慢病毒感染大鼠骨髓间充质干细胞后,在荧光显微镜下观察缝隙连接蛋白43蛋白表达情况。结果所获缝隙连接蛋白43基因经测序后与GeneBank报道序列完全一致;重组慢病毒载体质粒FUGW-缝隙连接蛋白43经鉴定正确;三质粒共转染293T细胞成功,收集、浓缩病毒后测定其滴度为1×1011TU/L;感染大鼠骨髓间充质干细胞后荧光显微镜观察到胞膜位置点线状荧光分布。结论成功构建带有缝隙连接蛋白43基因的慢病毒载体并实现在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达,为间充质干细胞移植治疗心肌梗死的应用奠定了基础。     

罗曼鹤鸡骨髓间充质干细胞的分离培养和鉴定

目的建立鸡骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离培养和鉴定体系。方法从1～14天龄罗曼鹤鸡骨髓中分离骨髓细胞,差速贴壁法纯化、扩增BMSCs。倒置显微镜下观察细胞形态特征,MTY法绘制生长曲线,流式细胞仪检测细胞标志物,并分别进行成骨、成脂诱导分化能力检测。结果分离培养的细胞呈成纤维细胞样或长梭形,生长状态良好;CD29阳性表达率为92．10％,CD34阳性表达率仅为0．80％;经成骨诱导分化,出现明显的钙化结节,茜素红染色阳性;经成脂诱导分化,油红O染色阳性,细胞内出现明显的脂质小滴。结论建立了操作简单、高效的鸡BMSCs分离培养和鉴定体系,为鸡BMSCs的进一步研究和应用提供了良好的基础。     

增强型绿色荧光蛋白转染豚鼠间充质干细胞的研究

目的探讨增强型绿色荧光蛋白（EGFP）作为种子细胞标记物的可行性。方法构建EGFP逆转录病毒载体,转染豚鼠骨髓间充质干细胞（MSC）,用阳离子脂质体介导法将病毒质粒导入HEK293包装细胞内。经G418筛选出阳性细胞克隆,取阳性克隆的病毒上清感染豚鼠骨MSC。筛选出稳定表达EGFP的MSC克隆,并向神经元方向诱导。检测神经元样细胞的特异性标志神经丝蛋白（NF）的表达。结果EGFP的逆转录病毒载体成功构建。病毒上清转染豚鼠MSC后,EGFP能稳定表达1个月以上,并且MSC细胞诱导后能表达NF。结论EGFP逆转录病毒载体易于构建成功并能在靶细胞中长期稳定表达,不影响细胞的分化特性,可以用作细胞标记。     

Construction of the Eukaryotic Expression Vector with EGFP and hVE GF121 Gene and its Expression in Rat Mesenchymal Stem Cells

Objectives To construct a recombinant plasmid carrying enhanced green fluorescent protein (EGFP) and human vascular endothelial growth factor (VEGF) 121 gene and detect its expression in rat mesenchymal stem cells (MSCs). Methods Human VEGF121 cDNA was amplified with polymerase chain reaction (PCR) from pCD/hVEGF121 and was inserted into the eukaryotic expression vector pEGFPC1. After being identified with PCR, double enzyme digestion and DNA sequencing. The recombinant plasmid pEGFP/hVEGF121 was transferred into rat MSCs with lipofectamine. The expression of EGFP/VEGF121 fusion protein were detected with fluorescence microscope and immunocytochemical staining respectively. Results The recombinant plasmid was confirmed with PCR, double enzyme digestion and DNA sequencing. The fluorescence microscope and immunocytochemical staining results showed that the EGFP and VEGF121 protein were expressed in MSCs 48h after transfection.Conclusions The recombinant plasmid carrying EGFP and human VEGF was successfully constructed and expressed positively in rat MSCs. It offers a promise tool for further research on differentiation of MSCs and VEGF gene therapy for ischemial cardiovascular disease.     

骨髓细胞参与甘油引起的小鼠急性肾小管坏死修复的实验观察

目的：观察骨髓来源的细胞能否分化成肾小管上皮细胞。方法：15只绿色荧光蛋白（GFP）标记的C57BL／6转基因小鼠提供骨髓细胞，64只同种无荧光标记的C57BL／6小鼠随机分为正常对照组（N组）、全身照射组（TBI组）、骨髓移植组（BMT组）、骨髓移植＋甘油注射组（B＋G组），每组16只。各组小鼠于不同时间点取血检测血常规、尿素氮及血肌酐，并取肾行H-E染色检查肾脏病理变化。流式细胞仪可以明确受体鼠骨髓细胞中CFP阳性细胞的比例，利用荧光显微镜及激光共聚焦显微镜采用荧光组织化学、免疫组织化学等方法观察GFP阳性细胞在受体鼠肾脏的分布及数量。结果：致死剂量^60Co照射虽然引起血常规三系减少，但并未对肾脏的组织结构及功能造成损伤。BMT组受体鼠在骨髓移植后第56天、84天时，肾小管中有少量GFP阳性细胞的存在，B＋G组受体鼠于上述同样时间点时肾小管中的GFP阳性细胞增多。激光共聚焦显微镜进一步证实了这些GFP阳性细胞位于肾小管上皮，并且荧光组织化学显示，这些GFP阳性细胞表达肾小管上皮细胞特异性功能蛋白Megalin。结论：骨髓细胞可以向肾小管上皮细胞分化．参与肾小管上皮细胞的更新。并且损伤可以使骨髓细胞的肾向分化率增加。     

人骨髓间充质干细胞的生物学特性分析

目的对人骨髓间充质干细胞（HMSCs）的生物学特性进行初步分析,为其临床应用奠定基础。方法抽取4例健康人髋骨内骨髓5～20ml,密度梯度离心法分离HMSCs。体外培养扩增后流式细胞仪检测HMSCs表面标记物;MMT法绘制生长曲线,计算细胞倍增时间;吉姆萨染色法检测细胞核型。结果HMSCs表面标记物CD29、CD44、CD71、CD105、CD166、HLA-ABC、UEA-1阳性表达;CD34、CD45、HLA-DR阴性表达;生长曲线呈S形,细胞倍增时间随代次增加而延长;核型分析显示第3、6代HMSCs的染色体数目未发生改变。结论密度梯度离心法可得到纯度较高的HMSCs,表可达人类间充质干细胞的表型特征。HMSCs可在体外较长时期培养。在第7代之前细胞增殖旺盛,之后细胞增殖能力逐渐下降;在第6代之前染色体数目未发生改变。     

The composition of the mesenchymal stromal cell compartment in human bone marrow changes during development and aging

Life-long hematopoiesis depends on the support of mesenchymal stromal cells within the bone marrow. Therefore, changes in the hematopoietic compartment that occur during development and aging probably correlate with variation in the composition of the stromal cell microenvironment. Mesenchymal stromal cells are a heterogeneous cell population and various subtypes may have different functions. In accordance with others, we show that CD271 and CD146 define distinct colony-forming-unit-fibroblast containing mesenchymal stromal cell subpopulations. In addition, analysis of 86 bone marrow samples revealed that the distribution of CD271(bright)CD146(-) and CD271(bright)CD146(+) subsets correlates with donor age. The main subset in adults was CD271(bright)CD146(-), whereas the CD271(bright)CD146(+) population was dominant in pediatric and fetal bone marrow. A third subpopulation of CD271(-)CD146(+) cells contained colony-forming-unit-fibroblasts in fetal samples only. These changes in composition of the mesenchymal stromal cell compartment during development and aging suggest a dynamic system, in which these subpopulations may have different functions.     

体外诱导骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的研究

目的观察人骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）体外扩增和定向诱导分化为神经元样细胞的变化,为其临床应用奠定基础。方法采用密度梯度离心法分离BM-MSCs细胞,用MesencultTM培养基和贴壁培养法培养、纯化和扩增细胞,流式细胞术检测细胞表面CD29和CD90分子表达率。采用20 ng/ml重组碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、20 ng/ml新型人表皮生长因子（hEGF）和20 g/L二甲基亚砜（DMSO）、5 mmol/Lβ-巯基乙醇（BME）分别诱导BM-MSCs;采用免疫组化法检测细胞的神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胶原纤维酸性蛋白（GFAP）、波形蛋白（VIM）表达情况。结果BM-MSCs细胞增殖迅速,3周可传代培养;BM-MSCs传十代扩增1－2×10^3倍。分离和扩增BM-MSCs CD29、CD90强表达率分别为95.02%、93.81%。药物诱导后的BM-MSCs发生轴突等神经元样细胞变化,阳性表达NSE、GFAP、VIM分子。结论人BM-MSCs能体外培养和扩增,并能定向诱导分化为神经元样细胞。     

人胎肝间充质干细胞体外分离培养和生物学鉴定

目的建立人胎儿肝脏非实质细胞间充质干细胞(nonparenchymalmesenchymalstemcells,NPMSC)的分离、培养方法,观察NPMSC形态学、细胞生物学特性及细胞表型特征,以获得大量人源性间充质干细胞(MSC)。方法采用体外细胞培养技术分离培养人胎儿NPMSC,用显微摄像、MTT和图像分析研究其增殖及生长特征,用流式细胞仪和免疫组化法鉴定其表型。结果每个胎儿肝脏可获得10000±2000个贴壁细胞,可见5～10个高速增生的细胞集落。原代和传代培养均生长缓慢,按1∶3传代,传1代需8～10d,细胞经传代后逐渐纯化,传10代后可达109个细胞。流式细胞仪检测NPMSC不表达CD34,而表达CD166。对传代NPMSC进行人甲胎蛋白和白蛋白免疫组化分析,细胞表达微量甲胎蛋白,不表达白蛋白。结论肝非实质细胞中含有MSC,且量较大,可成为种子细胞。NPMSC在普通培养条件下不向肝细胞分化。     

Haematopoietic stem cells participate in muscle regeneration

It has previously been shown that bone marrow cells contribute to skeletal muscle regeneration, but the nature of marrow cell(s) involved in this process is unknown. We used an immunocompetent and an immunocompromised model of bone marrow transplantation to characterize the type of marrow cells participating regenerating skeletal muscle fibres. Animals were transplanted with different populations of marrow cells from Green Fluorescent Protein (GFP) transgenic mice and the presence of GFP(+) muscle fibres were evaluated in the cardiotoxin-injured tibialis anterior muscles. GFP(+) muscle fibres were found mostly in animals that received either CD45(-), lineage(-), c-Kit(+), Sca-1(+) or Flk-2(+) populations of marrow cells, suggesting that haematopoietic stem cells (HSC) rather than mesenchymal cells or more differentiated haematopoietic cells are responsible for the formation of GFP(+) muscle fibres. Mac-1 positive population of marrow cells was also associated with the emergence of GFP(+) skeletal muscle fibres. However, most of this activity was limited to either Mac-1(+) Sca(+) or Mac-1(+)c-Kit(+) cells with long-term haematopoietic repopulation capabilities, indicating a stem cell phenotype for these cells. Experiments in the immunocompromised transplant model showed that participation of HSC in the skeletal muscle fibre formation could occur without haematopoietic chimerism.     

自体骨髓间充质干细胞移植治疗心肌梗死的进展

心肌梗死可引起心肌细胞的丢失,进而引起心脏功能的下降,是心力衰竭最主要的病因。骨髓间充质干细胞（BM—MSCs）是一类具有横向分化为各系统器官和组织能力的干细胞,能补充丢失的心肌细胞并通过旁分泌等机制增强心功能,为心肌梗死提供一种全新的治疗方法,极具发展潜力。本文对BM—MSCs的分离培养、诱导因素、移植以及临床研究等方面进行了综述。