神经节苷脂GM1对神经生长因子诱导PC12细胞分化的影响

目的 研究神经节苷脂GM1是否介导神经生长因子（NGF）诱导的PC12细胞的分化。方法 采用MTT法、葡萄神经酰胺合成抑制剂（D－PDMP）分析神经节苷脂GM1对NGF诱导的PC12细胞分化的影响。结果 神经节苷脂GM1对PC12细胞的生长无明显的影响，而能够促进NGF对PC12细胞的生长抑制作用；NGF能诱导PC12细胞分化，但NGF无法诱导神经节苷脂缺乏型PC12细胞的分化；在神经节苷脂缺乏型PC12细胞中添加神经节苷脂GM1后，细胞恢复对NGF的反应性。结论 神经节苷脂GM1在NGF诱导的PC12细胞分化过程中发挥重要作用。     

Nogo-C对PC12细胞分化和突起生长的影响

目的:利用PC12细胞研究Nogo-C和神经元细胞分化及突起生长的关系. 方法: NGF诱导PC12细胞,利用RT-PCR及免疫荧光技术检测细胞内Nogo-C的表达,并在PC12细胞中过表达Nogo-C,通过细胞计数检测Nogo-C对突起生长的影响. 结果: ① RT-PCR检测到NGF诱导的PC12细胞中有少量Nogo-C的mRNA分子表达;②免疫荧光染色观察到NGF诱导的PC12细胞中有少量Nogo-C的表达;③细胞计数观察到转染Nogo-C后的PC12细胞在NGF诱导后突起增长百分数相对于EGFP组明显增高. 结论: NGF诱导的PC12细胞中有Nogo-C的表达,同时过表达Nogo-C可促进NGF诱导下的PC12细胞的分化以及影响细胞的突起生长.     

鼠神经生长因子对大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤PC12细胞活性及形态学的影响

目的:观察鼠神经生长因子(NGF)对大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤PC12细胞活性及形态的影响.方法:体外培养PC12细胞,将其分为阴性对照组和诱导分化组.诱导分化组使用浓度为50 ng/ml NGF,阴性对照组加入等量的磷酸盐缓冲液.采用CCK-8实验检测细胞活性.制作细胞爬片后,于显微镜下直接观察活细胞形态.HE染色后,...     

NGF诱导PC12细胞向神经元的分化

目的：研究NGF诱导PC12细胞向神经元的分化情况。方法：实验分为10、20、50和80 μg•L^-1 NGF组及含10%胎牛血清的对照组。不同浓度的NGF组均诱导PC12细胞72 h,在24、48和72 h分别观察细胞的突起长度和细胞最大直径的变化情况;在诱导72 h后利用免疫细胞化学技术,观察不同剂量NGF作用后PC12细胞向MAP2阳性细胞分化的情况。 结果： 20、50和80 μg•L^-1 NGF组MAP2阳性细胞数明显高于对照组,且以50 μg•L^-1 组最为明显（P<0.05）。与对照组比较,加入NGF组分化的细胞其突起和细胞直径明显增长和增大,以50 μg•L^-1 组最为明显（P<0.01）。结论：NGF能够诱导PC12细胞向神经元分化,50 μg•L^-1 的NGF浓度是诱导PC12细胞向神经元分化的最适浓度。     

PC12细胞凋亡进程中NGF诱导BimEL表达

目的 调查神经生长因子(NGF)缺乏诱导的PCI2细胞凋亡中Bim EL表达的变化情况.方法 分别用含有NGF或NGF抗体的培养基培养PC12细胞,RT-PCR方法检测BimEL在PC12细胞中的表达变化.结果 拮抗NGF处理的PC12细胞中Bim EL的表达明显大于NGF处理组(P<0.05),而拈抗NGF一段时间后再加入NGF培养的处理组,细胞中Bim EL的表达量少于NGF拮抗组(P<0.05),但却大于NGF处理组(P<0.05).结论 提示NGF可能通过调节Bim EL参与PC12细胞凋亡.     

NGF诱导PC12细胞分化的神经细胞行为观察

目的：观察PC12细胞分化的神经细胞的分裂、突起延伸、迁徙和分化等细胞行为。方法：采用Giemsa、甲绿-派郎宁染色和增殖细胞核抗原（PCNA0免疫组织化学染色方法观察培养的PC12细胞,结果：培养分化的神细胞呈现横裂=纵裂等不同方式的无丝分裂像;分裂中的神经细胞可呈现形态及化学不对称性;分化的神经细胞有明显的细胞迁徙运动和突起延伸,结论：NGF诱导PC12细胞分化的神经细胞能以无丝分裂方式增殖;分化神经元可以通过细胞迁徙、突起延伸及共同胞质桥等方式相连接。     

朊蛋白106-126肽段对分化后PC12细胞的凋亡作用

目的：研究朊蛋白106-126肽段在细胞水平上的毒性作用。 方法：PC12细胞常规培养后加入神经生长因子（NGF）诱导成神经元样细胞,再加入朊蛋白106-126肽段,MTT法检测细胞存活率,同时观察细胞生长和形态变化,通过形态学改变、流式细胞术和DNA电泳检测细胞凋亡。 结果：细胞接触肽段后存活率下降28.9％;光镜下可见细胞贴壁不良,胞体缩小,细胞突起断裂缩短;荧光染色可见细胞突起缩短、胞核固缩、胞质染成橘红色的凋亡细胞;电镜下可见胞质中出现空泡样结构,细胞染色质浓集于核膜内侧并裂解成碎块状;流式细胞仪检测细胞出现亚二倍体峰,DNA电泳出现梯状带。 结论：朊蛋白106-126肽段能够诱导分化后的PC12细胞凋亡,具有明确的毒性作用。利用106-126肽段感染分化的PC12细胞可能是在细胞水平上研究朊蛋白毒性作用的理想模型。     

波形蛋白影响PC12细胞神经分化的研究

目的 探究波形蛋白分子在PC12细胞神经分化中的作用。方法 用免疫印迹方法检测PC12H和PC12L细胞中波形蛋白的表达情况。用免疫印迹方法检测PC12H细胞和PC12L细胞在NGF处理前后波形蛋白的表达情况。构建波形蛋白干扰质粒,用免疫印迹方法检测该质粒的干扰效果。分别将对照质粒、波形蛋白干扰质粒瞬时转染PC12H细胞,培养0、1、2、3天观察与记录细胞的分化情况,用Image-pro plus软件定量分析这两组细胞的平均神经突长度和含分化神经突细胞的百分比例。结果 PC12H细胞中波形蛋白的表达明显高于PC12L细胞（P=0.000）。NGF处理后PC12H和PC12L细胞中波形蛋白的表达量均增加,且在PC12L细胞中更明显（P=0.000）。波形蛋白干扰质粒能有效地抑制PC12H细胞中波形蛋白的表达（P=0.000）。瞬时转染波形蛋白干扰质粒能有效地抑制PC12H细胞的神经分化,定量分析结果显示干扰组细胞的平均神经突长度和含分化神经突细胞的百分比均明显小于对照组,差异均有统计学意义（P=0.000）。结论 波形蛋白分子可以促进PC12细胞的神经分化。     

刺五加皂苷对化学诱导缺氧PC12细胞中缺氧诱导因子-1α表达的影响及机制

目的探讨缺氧诱导因子（HIF）-1α在刺五加皂苷（ASS）对神经元缺氧保护中的作用及可能的调控机制。方法建立神经生长因子（NGF）诱导PC12细胞分化和氯化钴诱导化学缺氧的神经元缺氧模型。采用Western blot和RT-PCR方法分别检测ASS对缺氧PC12细胞中HIF-1α mRNA的基因转录、蛋白表达及ERK1/2磷酸化的影响。结果正常培养的PC12细胞几乎没有HIF-1α mRNA的转录和表达,氯化钴的处理可显著增加HIF-1α mRNA的转录和表达,ASS可进一步增加缺氧PC12细胞中HIF-1α mRNA的转录和表达;ASS和NGF的预处理还可以增加磷酸化ERK1/2的表达。以上变化均有统计学意义（均P〈0.05）。ASS的上述作用与NGF作用的差异无统计学意义（P〉0.05）。结论ASS对氯化钴诱导化学缺氧的PC12细胞具有明显的保护作用,其作用可能与促进HIF-1α mRNA的转录和通过激活ERK1/2途径进而抑制HIF-1α降解从而增加其含量有关。     

Cx43形成的GJIC在NGF诱导PC12细胞神经元样分化中作用的研究

【立论依据】 在神经系统的发育和修复过程中,神经元间的细胞通讯在细胞的静息、增殖、分化和凋亡过程的发生发展中发挥着重要作用。细胞间通讯有缝隙连接、膜表面分子接触通讯和化学通讯三种方式,而缝隙连接(GJ)是细胞间直接通讯的唯一方式。缝隙连接蛋白(connexin)是GJ结构和功能的基础,在缝隙连接蛋白家族中,Cx43在中枢神经系统的发育过程中发挥重要作用。功能性缝隙连接(GJIC)是通过缝隙连接在相邻细胞间传递氨基酸、离子、小分子等的一种通讯方式。研究表明,神经生长因子(NGF)可以促进Cx43磷酸化,同时可以诱导嗜铬细胞瘤PC12细胞分化而产生与交感神经元相似的神经元。但是Cx43形成的功能性缝隙连接(GJIC)在NGF诱导PC12细胞分化中的作用尚不清楚。因此,本研究拟阐述Cx43形成的GJIC在NGF诱导PC12细胞分化中的作用。 【设计思路】 本实验拟构建Cx43稳定转染的PC12细胞系,并检测Cx43形成的GJIC的功能。 NGF诱导PC12细胞和Cx43稳定转染的PC12细胞,分析Cx43形成的GJIC在NGF诱导PC12细胞神经元样分化过程中的作用,为神经损伤和修复提供新的研究靶点。 【实验内容】 (1)构建Cx43稳定转染的PC12细胞系;(2)实验分组:NGF诱导PC12细胞组,NGF诱导Cx43稳定转染的PC12细胞组,NGF诱导PC12细胞组+缝隙连接抑制剂(CBX),NGF诱导Cx43稳定转染的PC12细胞组+CBX;(3)形态学观察和NES免疫荧光细胞化学染色检测细胞分化率;(4)Dye Coupling检测Cx43形成的GJIC。 【材料】 PC12细胞;NGF;Cx43真核表达质粒;Cx43引物和抗体;CBX;NES单克隆抗体;FITC-IgG。 【可行性】 本研究前期研究工作通过形态学观察及Image软件测量显示在一定范围内,NGF量的增加可以有效提高PC12细胞的分化水平,课题组成员熟练掌握相关实验的方法和技术;研究室能提供相关的仪器和材料。实验思路清晰,实验过程明确。 【创新性】 本研究应用NGF诱导PC12细胞分化模型,探究Cx43形成的GJIC在NGF诱导PC12细胞分化过程中的作用,从而为神经损伤和修复提供新的研究依据和调控靶点。     

培养Schwann细胞用于构建毛囊神经嵴干细胞定向分化饲养层

目的培养原代Schwann细胞,用于构建毛囊神经嵴干细胞饲养层构建。探索Schwann细胞（Schwanncells）对胎牛血清浓度的依耐性;检测Schwann细胞在不同血清浓度下的活性及分泌状态,并应用此饲养层定向诱导毛囊神经嵴干细胞分化。方法原代培养及纯化Schwann细胞;用不同血清浓度的胎牛血清（FBS）培养基培养Schwann细胞,测定并用四氮唑盐（MTT）比色法检测Schwann细胞生长及增殖情况;使用$100特异性标识抗体间接免疫荧光法与荧光染料Hoechst33342对Schwann细胞进行鉴定。用ELISA方法检测Schwann细胞的分泌因子。利用丝裂霉素C处理Schwann细胞建立饲养层,培养Schwann细胞和毛囊神经嵴干细胞。结果体外成功培养Schwann细胞,用S100间接免疫荧光法与核染料Hoechst33342鉴定Schwann细胞呈阳性表达,纯度约95％,成功培养毛囊神经嵴干细胞。无血清的培养基可使Schwann细胞生长状态良好。饲养层细胞能够稳定分泌神经生长因子（nerve growth factor,NGF）和脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）,可诱导毛囊神经嵴干细胞定向分化。结论无血清的培养基更利于毛囊神经嵴干细胞饲养层的构建。饲养层Schwann细胞可持续分泌NGF和BDNF等神经营养因子,可成为使毛囊神经嵴干细胞定向分化的稳定饲养层细胞。     

人牙周膜细胞条件培养基促PC12细胞分化的作用研究

目的研究牙周组织中是否存在神经生长因子(NGF)的表达。方法采用培养的人牙周膜成纤维细胞(hPDLF)的条件培养基与PC12细胞共培养的方法研究hPDLF是否分泌具有活性功能的NGF。结果在hPDLF条件培养基中培养的PC12细胞长出突起,向神经元样细胞分化。对照组及NGF抗血清培养的PC12细胞仅有少量长出突起。结论本研究通过体外研究初次显示培养的hPDLF分泌NGF蛋白,提示NGF可能作为信号分子在牙周组织损伤愈合过程中的神经再支配中发挥作用。     

人破骨细胞的体外分离培养及与骨髓瘤细胞的相互作用

目的研究体外分离培养人破骨细胞的可行性及与骨髓瘤细胞的相互作用。方法分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMC）体外培养形成破骨细胞（osteoclasts,OC）,PBMC-OC与骨髓瘤（multiple myeloma,MM）细胞进行共培养。结果 PBMC在完全OC培养基中培养4 d后形成定型的破骨细胞前体（osteoclast precursor cell,pOC）;8226细胞可诱导pOC迁移并促进其向成熟的OC分化;pOC经完全OC培养基继续培养6～10 d后形成OC,在无OC培养基条件下,MM细胞仍可促进OC存活;OC明显促进MM细胞增生,抑制去血清培养诱导的MM细胞死亡。结论体外培养正常人PBMC-OC具有可行性,MM细胞促进OC成熟,OC促进骨髓瘤细胞生长与存活。     

MAPK、PI3K途径在蛇毒神经生长因子诱导PC12细胞分化的作用

目的 研究丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt途径在蛇毒神经生长因子(NGF)诱导PC12细胞分化中的作用.方法 应用蛋白免疫印迹法分析p44/p42MAPK和Akt的磷酸化水平,并利用MAPK抑制剂PD98059和PI3K抑制剂LY294002,观察其对NGF诱导的PC12细胞形态学改变的影响.结果 眼镜蛇毒NGF在10ng/mL即可诱导PC12细胞长出突起,100,1000ng/mL作用明显,呈剂量效应关系;NGF能有效刺激p44/p42MAPK、Akt的磷酸化;分别用特异抑制剂PD98059抑制MAPK活性,LY294002抑制PI3K活性后,NGF诱导的细胞分化均受抑制.结论 蛇毒神经生长因子诱导PC12细胞的分化作用与p44/p42MAPK和PI3K/Akt途径相关.     

模拟微重力对大鼠PC12细胞衰老的影响

目的 探讨模拟微重力对PC12细胞衰老的影响及相关机制.方法 用旋转细胞培养系统进行模拟微重力条件下的细胞培养.选取模拟微重力和正常重力条件下培养6h,12 h,24h,48 h,72 h和96 h的PC12细胞作为研究对象.流式细胞仪检测PC12细胞各个细胞周期分布的变化;Western blot方法检测PC12细胞P53蛋白的变化;生化反应试剂盒检测活性氧变化;衰老相关β半乳糖苷酶(SA-β-gal)特异性染色对衰老的PC12细胞进行评估.结果 细胞周期分析的结果显示,经过模拟微重力培养的PC12细胞其细胞周期阻滞在G1期.在模拟微重力培养96 h细胞周期蛋白P53表达均升高.SA-β-gal染色的结果显示在模拟微重力的作用下,PC12细胞SA-β-gal的活性随着模拟微重力培养时间的延长而逐步升高.PC12细胞内H202的水平升高,并且具有时间依赖性.模拟微重力细胞培养上清中的H2O2也相应升高,但是滞后于细胞内的H2O2.结论 ①模拟微重力可以引起PC12细胞SA-β-gal的活性升高,G1期细胞周期阻滞和P53的活化;②模拟微重力条件下诱导PC12细胞衰老可能通过氧化应激实现.     

脊髓源神经干细胞向胆碱能神经元诱导分化的研究

目的 研究胚胎大鼠脊髓源性神经干细胞的培养和在体外骨髓基质细胞诱导其分化的情况。方法 从孕龄13d的胚胎大鼠脊髓组织中分离获得神经干细胞，采用含表皮生长因子（EGF）及碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的无血清限定性培养基培养，同时进行诱导分化，观测脊髓神经干细胞向胆碱能神经元分化的情况，用细胞免疫荧光化学方法鉴定分化结果。结果 可从胚胎脊髓中分离得到大量的神经于细胞，通过限定性培养基培养可获得于细胞球，经从骨髓基质细胞培养液中获得的限制性培养液在体外可被诱导分化，用细胞免疫荧光化学法鉴定，可见有胆碱能神经元生成。结论 胚胎大鼠脊髓神经干细胞在添加EGF与bFGF的限定性培养基中可以增殖并长期保持稳定的性状，在体外可以被诱导分化为胆碱能神经元。     

大鼠骨髓基质细胞诱导分化为神经细胞的实验研究

目的 探讨大鼠骨髓基质细胞（MSCs）体外诱导分化为神经细胞的可行性,为MSCs移植治疗缺血性脑血管病提供实验依据.方法从大鼠骨髓中分离培养骨髓基质细胞,应用bFGF进行预诱导,然后用ATRA和NGF来诱导骨髓基质细胞,观察细胞的形态变化,用免疫组化法检测细胞的NSE和GFAP的表达.结果大鼠MSCs经ATRA和NGF诱导后,细胞的形态发生改变,免疫组化显示部分细胞表达NSE和GFAP.结论骨髓基质细胞可被ATRA和NGF在体外诱导分化为神经细胞和胶质细胞.     

神经细胞生长因子诱导的神经元化对PC12细胞紫外线耐受量的影响

目的 评估神经细胞生长因子(NGF)诱导的神经元化对PC12细胞紫外线耐受量的影响.方法 采用10、30、60、80、100、200 mJ/cm2紫外线分别照射经NGF诱导的PC12细胞(研究组)和未经NGF诱导的正常PC12细胞(对照组),照射后继续培养24 h,MTT测定细胞存活率.结果 对照组细胞在辐射强度30 mJ/cm2时开始出现明显的细胞凋亡,研究组细胞在辐射剂量100 mJ/cm2时才出现明显凋亡.结论 NGF诱导的神经化可提高PC12细胞的紫外线耐受量.     

神经生长因子对β-淀粉样蛋白诱导PC12细胞凋亡的保护作用

目的:研究神经生长因子(NGF)对β淀粉样蛋白(Aβ)诱导鼠肾上腺嗜咯瘤细胞(PC12)凋亡的作用,从而探讨NGF对阿尔茨海默病的治疗作用。方法:以PC12细胞为神经元的细胞模型,将Aβ和NGF+Aβ分别加入培养的PC12细胞中,采用MTT法观察细胞存活率,相差显微镜观察细胞形态改变,hochest33258观察细胞核变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率,比较两组间差异。结果:Aβ组细胞存活率随作用时间延长而下降(P<0.01),胞体变小,轴突退化变形,可见特征性的凋亡细胞核,并检测到典型的凋亡峰;而NGF+Aβ组细胞存活率明显增高,凋亡率明显减少(P<0.01)。结论:一定浓度的Aβ2535能诱导PC12细胞凋亡,NGF对Aβ诱导的PC12细胞凋亡具有保护作用。     

牛膝多肽可能通过ERK1/2途径诱导PC12细胞向神经元分化

目的:研究牛膝多肽(ABPP)诱导PC12细胞向神经元分化的作用,初步探讨ABPP作用于PC12细胞的信号转导途径?方法:以体外培养的PC12细胞为研究模型,观察在低血清的情况下不同浓度ABPP(0.25?0.50?1.00 μg/ml)诱导PC12细胞发生的形态学改变?采用免疫荧光细胞化学法,观察神经丝蛋白(NF-H)在ABPP诱导分化的PC12细胞中的表达;采用Western blot法观察ABPP(1.0 μg/ml)加药后不同时间段(0?6?12 h和1?2?3?7 d)和不同浓度ABPP(0.25?0.50?1.00 μg/ml)加药2 d后对PC12细胞ERK1/2活性的影响,同时应用ERK1/2特异性拮抗剂PD98059与ABPP共培养PC12细胞,分析ABPP对PC12细胞的作用与ERK1/2通路的关系?结果:ABPP处理3 d后,部分PC12细胞开始出现神经元样的形态?随着加药时间延长具有神经元样的细胞逐渐增多,到7 d时,可以见到神经生长因子(NGF)和ABPP处理组PC12细胞的突起都显著增多,能形成网络;14 d时,这种现象愈发显著?加药后7 d和14 d,ABPP各浓度组的细胞分化率以及细胞突起长度均明显提高,且存在明显的剂量反应关系?加药第7天和第14天,ABPP高剂量组与NGF组的PC12细胞均出现NF-H标记阳性的分化细胞?ABPP对ERK1/2的激活作用存在明显的量效关系,以1.0 ug/ml作用2 d为最大?当用PD98059抑制ERK1/2的活化时,ABPP对ERK1/2的激活作用被部分阻断?结论:ABPP具有诱导PC12细胞神经元性分化的作用,此作用可能是通过ERK1/2信号转导途径实现的?