补肾中药密骨片对成骨细胞生长因子转化生长因子β1 mRNA表达的影响

背景：补肾中药密骨片可有效防治骨质疏松，但其具体的药理学机制仍不是很清楚。转化生长因子β1是调节骨吸收与骨形成的重要耦联因子。 目的：探讨补肾方对成骨细胞转化生长因子β1mRNA表达的影响。设计：随机分组设计，对照实验。单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院骨伤科研究室。材料：实验于2003—05／2004—04在华中科技大学同济医学院附属协和医院中西结合骨代谢实验室完成。动物：选择出生一两天清洁级SD大鼠16只。实验药：密骨片药液在华中科技大学同济医学院附属协和医院骨伤科研究室制备，主要成分为淫羊藿、杜仲、胡桃肉、干地黄、淮牛膝等；阳性对照药：重组碱性成纤维细胞生长因子由北京邦定公司提供。阴性对照组分为探针阴性对照和抗体阴性对照。 方法：将体外分离培养的新生SD大鼠的颅骨成骨细胞加入100，1000，5000，10000mg／L补肾中药密骨片药液及阳性对照药5μg/L重组碱性成纤维细胞生长因子。24h后，利用自行制备的地高辛标记的鼠转化生长因子β1 cDNA探针进行成骨细胞的核酸分子原位杂交分析，以其细胞内杂交阳性颗粒的平均光密度值代表转化生长因子β1 mRNA的表达水平。在200倍视野下，每组随机选取40个成骨细胞，用TJTY-300型全自动图像分析仪测定细胞内杂交颗粒的平均光密度值（A）。主要观察指标：各组成骨细胞转化生长因子β1mRNA表达。结果：全自动图像分析显示，5000，10000mg／L密骨片药液组的细胞转化生长因子β1mRNA表达分别是阴性对照组的1．18倍和1．30倍，差异有显著性[5000，10000mg／L密骨片药液组、阴性对照组的细胞内杂交颗粒的平均光密度值似）分别为0．21367&;#177;0．01500，0．23703&;#177;0．02173，0．18127&;#177;0．01528，P〈0．05和P〈0．01]，5μg/L重组碱性成纤维细胞生长因子组的细胞内杂交颗粒的平均光密度值（A）（0．25445&;#177;0．02081）虽高于5000，10000mg／L密骨片药液组，但差异无显著性（P〉0．05）。 结论：补肾中药密骨片可刺激成骨细胞转化生长因子β1的分泌和合成，从而促进骨形成和抑制骨吸收。     

成纤维细胞生长因子对兔纤维环细胞转化生长因子β2的调节

目的:观察成纤维细胞生长因子对培养兔纤维环细胞转化生长因子β2表达的调节作用。方法:实验于2005-03/2006-04在华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科实验室完成。培养4月龄雌性日本大白兔的纤维环细胞,在每次换液时加入成纤维细胞生长因子100μg/L,铺满后收集细胞,作纤维环细胞转化生长因子β2常规免疫组织化学研究,细胞呈棕黄色染色为阳性表达信号,同时为进一步明确纤维环细胞转化生长因子β2的定位进行免疫胶体金标记电镜观察。结果:光镜下细胞明显呈棕色,电镜下细胞膜表面有明显的胶金颗粒粘附。结论:成纤维细胞生长因子能促进纤维环细胞转化生长因子β2的表达。     

大鼠转化生长因子β1基因转染成骨细胞后的表达

背景将生物材料复合细胞因子基因,或复合转入细胞因子基因的细胞植入骨缺损处可以促进骨修复.目的观察将大鼠转化生长因子β1基因转染成骨细胞后进行骨缺损基因治疗的可行性.设计对照观察实验.单位华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科.对象新生SD大鼠5只,雌雄不限.方法实验于2000-02/09在华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科实验室完成.通过脂质体介导将转化生长因子β1基因导入大鼠成骨细胞,并以质粒pcDNA3转染细胞作为对照.转染24 h后通过链霉亲和素-生物素化过氧化物酶复合物法和原位杂交法检测目的基因瞬时表达的情况.采用G418筛选转染细胞2周,获得阳性细胞克隆,用链霉亲和素-生物素化过氧化物酶复合物法检测转染细胞稳定表达转化生长因子β1的情况.主要观察指标链霉亲和素-生物素化过氧化物酶复合物法和原位杂交法检测转染细胞基因表达情况.结果①pcDNA3-TGF-β1转染成骨细胞瞬时表达组化检测和原位杂交检测结果24 h转染成骨细胞胞浆中充满染色的棕黄色颗粒,对照组空载体转染细胞胞浆中则没有棕黄色颗粒,说明转基因细胞中转化生长因子β1 mRNA明显增高.②G418筛选转基因细胞组化检测G418筛选2周后的转染细胞仍然有较高的转化生长因子β1表达.结论利用基因转染技术可使成骨细胞瞬时、高效表达细胞因子,转染后瞬时和筛选2周后,均呈现转化生长因子β1基因转染成骨细胞后稳定的高表达,说明采用细胞因子基因转染成骨细胞进行骨缺损的基因治疗具有可行性.     

大鼠转化生长因子β1基因转染成骨细胞后的表达

背景：将生物材料复合细胞因子基因，或复合转入细胞因子基因的细胞植入骨缺损处可以促进骨修复。目的：观察将大鼠转化生长因子β1基因转染成骨细胞后进行骨缺损基因治疗的可行性。设计：对照观察实验。单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科。对象：新生SD大鼠5只，雌雄不限。方法：实验于2000—02／09在华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科实验室完成。通过脂质体介导将转化生长因子β1基因导人大鼠成骨细胞，并以质粒pcDNA，转染细胞作为对照。转染24h后通过链霉亲和素-生物素化过氧化物酶复合物法和原位杂交法检测目的基因瞬时表达的情况。采用G418筛选转染细胞2周，获得阳性细胞克隆，用链霉亲和素-生物素化过氧化物酶复合物法检测转染细胞稳定表达转化生长因子β1的情况。主要观察指标：链霉亲和素-生物素化过氧化物酶复合物法和原位杂交法检测转染细胞基因表达情况。结果：①pcDNA3-TGF-β1转染成骨细胞瞬时表达组化检测和原位杂交检测结果：24h转染成骨细胞胞浆中充满染色的棕黄色颗粒，对照组空载体转染细胞腧浆中刚没有棕黄倘．颗粒．说明转基因细胞中转化毕长因子β1 mRNA明显增高。②G418筛选转基因细胞组化检测：G418筛选2周后的转染细胞仍然有较高的转化生长因子β表达。结论：利用基因转染技术可使成骨细胞瞬时、高效表达细胞因子，转染后瞬时和筛选2周后，均呈现转化生长因子β1基因转染成骨细胞后稳定的高表达，说明采用细胞因子基因转染成骨细胞进行骨缺损的基因治疗具有可行性。     

转化生长因子β调节体外培养人成骨细胞结缔组织生长因子mRNA的表达

目的:观察转化生长因子β对体外培养人成骨细胞结缔组织生长因子mRNA表达的影响。方法:实验在青岛海慈医疗集团检验科完成。选择2005-02/03在青岛海慈医疗集团骨科住院的无其他疾患的骨折患者3例,年龄30～50岁,经患者知情同意后,取其髂骨松质骨,剪碎,Ⅳ型胶原酶消化后,将骨片贴于25cm2培养瓶,加入MEM培养液约15d后,可见细胞游出,约25d达汇片,胰酶消化,按1×106个细胞接种培养后第2天,换含1g/LBSAMEM培养液继续培养24h后,加入10ng/L转化生长因子β干预培养0,3,6,12,24h,或在转化生长因子β作用峰值时,分别给予不同浓度(0,5,10,25ng/L)干预,抽提总RNA,采用半定量反转录-聚合酶链反应和Northernblot法检测干预后成骨细胞结缔组织生长因子mRNA表达水平。结果:①半定量反转录-聚合酶链反应检测转化生长因子β对体外培养成骨细胞结缔组织生长因子mRNA表达的影响:与0ng/L对照组相比,5,10和25ng/L转化生长因子β干预后结缔组织生长因子mRNA表达水平显著升高(P<0.01),呈明显剂量依赖关系;10ng/L转化生长因子β干预6h时转化生长因子β上调作用达高峰(P<0.01),然后下降,至24h时转化生长因子β对结缔组织生长因子的上调作用基本消失(P>0.05)。②Northernblot法检测转化生长因子β对体外培养成骨细胞结缔组织生长因子mRNA表达的影响:与0ng/L对照组相比,10和25ng/L转化生长因子β干预后结缔组织生长因子mRNA表达水平显著升高(P<0.01),但无明显剂量依赖关系(P>0.05);10ng/L转化生长因子β干预6h时转化生长因子β上调作用达高峰(P<0.01),然后下降,至24h时转化生长因子β对结缔组织生长因子的上调作用基本消失(P>0.05)。结论:转化生长因子β可呈剂量依赖性上调人成骨细胞结缔组织生长因子mRNA的表达。     

氟影响成骨细胞转化生长因子超家族成员表达的传导通路

背景：氟中毒骨转换过程中转化生长因子β超家族成员参与了骨转换过程,但是机制不清楚。目的：观察氟对体外培养成骨细胞中转化生长因子β1,骨形态发生蛋白2和SMAD4信号转导通路的影响。方法：体外培养人成骨细胞,按染氟（NaF）剂量将成骨细胞分为0（对照）,0.625,1.25,2.5,5,10,20,40,80,160mg/L组进行实验观察。结果与结论：氟对成骨细胞增殖影响与转化生长因子β1,骨形态发生蛋白2表达有密切的关系。当氟质量浓度为0.625mg/L时,氟化物产生的效应主要通过转化生长因子β1,骨形态发生蛋白2,SMAD4信号转导通路调节。当低于或超过此剂量时,氟化物产生的效应与信号转导通路关系不大,可能存在转化生长因子β1及骨形态发生蛋白2其他传导通路的调节。     

压力超负荷早期大鼠心肌组织转化生长因子β1及c-myc和c-jun mRNA表达的差异

目的:观察转化生长因子β1,c-myc和c-jun癌基因mRNA在压力超负荷早期大鼠心肌中的表达。方法:实验于2004-11/2005-07在华中科技大学同济医学院附属协和医院老年病科老年医学实验室完成。选择雄性Wistar大鼠50只,随机数字表法分为压力超负荷组和假手术组,每组25只。采用腹主动脉缩窄法建立左室压力超负荷模型,分子杂交系列观察心肌组织转化生长因子β1,c-myc和c-jun癌基因mRNA的变化,并用计算机图像分析技术定量分析,以假手术组作对照。结果:纳入动物50只,均进入结果分析。①压力超负荷组转化生长因子β1mRNA术后4h开始升高,8h达峰值,48h降至术前水平(分别为1.08±0.30,5.83±0.40,0.90±0.61,0.86±0.22);c-myc和c-jun癌基因mRNA均于术后8h开始升高,24h达峰值,48h降至术前水平(c-mycmRNA分别为4.25±0.97,5.94±1.42,0.80±0.43,0.68±0.11;c-junmRNA分别为4.36±0.55,5.91±1.66,0.93±0.35,0.79±0.12)。②假手术组各时间点转化生长因子β1,c-myc,c-jun癌基因mRNA斑点积分光度均无明显差别。结论:压力超负荷早期大鼠心肌组织中转化生长因子β1mRNA先于c-myc及c-junmRNA升高,提示转化生长因子β1可能是比c-myc及c-jun更早表达的信号因子。     

结缔组织生长因子反义寡核苷酸对人增生性瘢痕成纤维细胞结缔组织生长因子表达及胶原合成的作用

目的:观察结缔组织生长因子反义寡核苷酸对转化生长因子β1诱导的人增生性瘢痕成纤维细胞结缔组织生长因子mRNA、蛋白的表达和胶原合成的影响。方法:实验于2005-03/12在哈尔滨医科大学免疫教研室完成。选取哈尔滨医科大学附属第二医院整形美容中心手术标本,包括正常皮肤和增生性瘢痕。将手术中切下的正常皮肤、增生性瘢痕组织在无菌条件下去除表皮后采用组织块贴壁法培养于含体积分数为0.1的胎牛血清的RPMI1640培养液中,置37℃,体积分数为0.05的CO2条件下原代培养。经2.5g/L胰蛋白酶消化传代,传代至3～5代时进行实验。实验分4组:①正常皮肤成纤维细胞组。②增生性瘢痕成纤维细胞组。③增生性瘢痕成纤维细胞 5.0mg/L转化生长因子β1组(简称转化生长因子β1组)。④增生性瘢痕成纤维细胞 5.0mg/L转化生长因子β1 结缔组织生长因子反义寡核苷酸组(简称反义寡核苷酸组)。用5.0mg/L转化生长因子β1刺激增生性瘢痕成纤维细胞后,以脂质体介导方法将结缔组织生长因子反义寡核苷酸转染增生性瘢痕成纤维细胞中,用反转录-聚合酶链反应方法和WesternBlot方法检测细胞中结缔组织生长因子mRNA和蛋白质的表达;采用3H-脯氨酸掺入法检测细胞的胶原合成量。结果:①反转录-聚合酶链反应结果:结缔组织生长因子mRNA在正常皮肤成纤维细胞中无表达,在增生性瘢痕成纤维细胞中表达增强,转化生长因子β1刺激后表达量0.64±0.32明显高于增生性瘢痕成纤维细胞0.31±0.14,差异显著(P<0.01);反义寡核苷酸组可以大部分抑制结缔组织生长因子mRNA的表达,表达量0.12±0.62明显低于增生性瘢痕成纤维细胞组和转化生长因子β1组,差异显著(P<0.01)。②Western印迹结果:蛋白水平趋势与mRNA水平相一致。结缔组织生长因子蛋白在正常皮肤成纤维细胞中无表达,在增生性瘢痕成纤维细胞中表达增强84.63±11.49,转化生长因子β1刺激后表达量102.89±14.35明显高于增生性瘢痕成纤维细胞组,差异显著(P<0.01);反义寡核苷酸组可以大部分抑制转化生长因子β1的作用,结缔组织生长因子蛋白表达量41.75±10.56低于增生性瘢痕成纤维细胞组和转化生长因子β1组(P<0.01)。③结缔组织生长因子反义寡核苷酸对增生性瘢痕成纤维细胞胶原合成的作用:增生性瘢痕成纤维细胞组、转化生长因子β1组、反义寡核苷酸组的3H-脯氨酸掺入率分别为5381±185,8273±357,2475±859,转化生长因子β1可以显著增加成纤维细胞胶原的合成(P<0.01);而结缔组织生长因子反义寡核苷酸对转化生长因子β1刺激后的成纤维细胞胶原合成有明显抑制作用,差异显著(P<0.01)。结论:结缔组织生长因子反义寡核苷酸能够抑制转化生长因子β1引起的结缔组织生长因子mRNA、蛋白质表达的增高和胶原合成的增多,表明阻断结缔组织生长因子可能是延缓瘢痕纤维化的有效手段。     

转化生长因子β1基因修饰成骨细胞复合仿生基质材料治疗骨缺损

背景:通过分子生物学技术与组织工程技术相结合以修复骨缺损,是骨科当前重要的研究方向之一。转化生长因子β1作为重要的骨形成因子,在骨代谢和骨损伤修复中发挥着极为重要的作用。目的:观察转化生长因子β1基因修饰的成骨细胞复合仿生基质材料修复鼠胫骨骨缺损的治疗效果。设计:随机对照实验。单位:华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科。材料:实验于2003-03/08在华中科技大学同济医学院附属协和医院完成。选用健康SD大鼠20只,雌雄不限,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。方法:将转化生长因子β1基因转染的成骨细胞与涂覆多聚赖氨酸的聚DL乳酸仿生基质材料复合,植入鼠胫骨骨缺损模型,术后摄X射线片和组织学检查观察修复情况。主要观察指标:术后4,8周X线摄片和组织学检查情况。结果:20只SD大鼠均进如结果分析,无脱失。①实验组:4周时X线片可见骨痂形成,组织学观察有类骨组织和新骨形成,成骨细胞贴附于基质材料表面。8周时缺损基本修复,新骨密度与自体骨接近。②对照组:4周时X线片未见骨痂形成,组织学观察没有类骨组织形成,基质材料表面成骨细胞贴附较少,材料腔隙中有大量淋巴细胞浸润。8周时植入材料基本吸收,为纤维组织替代。结论:将分子生物学和组织工程学结合修复骨缺损,获得理想的治疗效果。     

氟影响成骨细胞转化生长因子超家族成员表达的传导通路

背景:氟中毒骨转换过程中转化生长因子β家族成员参与了骨转换过程,但是机制不清楚.目的:观察氟对体外培养成骨细胞中转化生长因子β1,骨形态发生蛋白2 和SMAD4 信号转导通路的影响.方法:体外培养人成骨细胞,按染氟(NaF)剂量将成骨细胞分为0(对照),0.625,1.25,2.5,5,10,20,40,80,160 mg/L组进行实验观察.结果与结论:氟对成骨细胞增殖影响与转化生长因子B1,骨形态发生蛋白2 表达有密切的关系.当氟质量浓度为0.625 mg/L时,氟化物产生的效应主要通过转化生长因子B1,骨形态发生蛋白2,SMAD4 信号转导通路调节.当低于或超过此剂量时,氟化物产生的效应与信号转导通路关系不大,可能存在转化生长因子β1 及骨形态发生蛋白2 其他传导通路的调节.     

工频电磁场对小鼠骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白2和转化生长因子β1 mRNA表达的刺激

背景:研究证实电磁场刺激能够促进多种骨生长因子的合成与分泌,而某些生长因子具有诱导骨髓间充质干细胞定向分化成骨的作用。目的:分析工频电磁场对体外培养的小鼠骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白2和转化生长因子β1mRNA表达的影响。设计:单一样本、区组设计,观察对比动物实验。单位:华中科技大学同济医学院附属同济医院创伤外科。材料:实验于2005-02/12在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨外科实验室完成。①选取清洁级昆明种小鼠20只,作为实验用骨髓间充质干细胞的来源。②电磁场发生器由武汉市海军工程大学研制,能生成场强为0～100mT的连续可调的50Hz正弦波电磁场。③引物均由北京赛百胜生物工程公司合成。方法:①小鼠以颈椎脱臼法处死,取双侧股骨和胫骨,体外分离培养骨髓间充质干细胞,取第2代细胞用于实验。②不同强度电磁场刺激实验:设立阴性对照组、阳性对照组、电磁场0.4,0.8,1.6mT刺激组,每组均取5瓶第2代细胞。阴性对照组、阳性对照组均不给予电磁场刺激,但阳性对照组于传代时加入含成骨性诱导剂(含10-8mol/L地塞米松,10mmol/Lβ-甘油磷酸钠,50mg/LVitaminC)的培养基;电磁场0.4,0.8,1.6mT刺激组在细胞贴壁后分别于0.4,0.8,1.6mT场强中进行电磁场刺激,每天均连续刺激1h,5d后进行指标检测。③相同场强不同作用时间电磁场刺激实验:设立阴性对照组、电磁场1.6mT刺激15,30,60min组,每组均取5瓶第2代细胞。阴性对照组不进行电磁场刺激;电磁场1.6mT刺激15,30,60min组在1.6mT场强条件下每天分别给予15,30,60min的连续电磁场刺激,5d后进行指标检测。④RT-PCR技术检测各组细胞骨形态发生蛋白2与转化生长因子β1mRNA的表达。主要观察指标:①不同强度电磁场刺激对小鼠骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白2与转化生长因子β1mRNA表达的影响。②相同场强不同作用时间电磁场刺激小鼠骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白2与转化生长因子β1mRNA表达的影响。结果:①电磁场刺激5d后,与阴性对照组比较,阳性对照组及电磁场0.4,0.8,1.6mT刺激组骨形态发生蛋白2、转化生长因子β1mRNA的表达均明显增强(P均<0.01);且电磁场1.6mT刺激组骨形态发生蛋白2mRNA的表达达到最大值(57.74±0.23)%,电磁场0.4mT刺激组转化生长因子β1mRNA的表达达到最大值(126.20±0.21)%。②电磁场刺激5d后,与阴性对照组比较,电磁场1.6mT刺激15,30,60min组骨形态发生蛋白2与转化生长因子β1mRNA的表达均明显增强(P均<0.01);且电磁场1.6mT刺激60min组两种因子mRNA的表达分别达到最大值(28.06±0.11)%和(75.20±0.16)%。结论:适当强度及作用时间的工频电磁场刺激,能够明显促进体外培养的小鼠骨髓间充质干细胞骨形态发生蛋白2与转化生长因子β1mRNA的表达。     

冷冻异体神经移植中宿主局部应用转化生长因子β1质粒的研究

背景:异体神经移植修复神经缺损,降低免疫排斥反应是关键问题之一,目前主要手段是降低移植神经段的抗原性和全身使用免疫抑制剂。目的:观察经反复冻融处理的冷藏异体神经移植,局部使用转化生长因子β1质粒处理的效果。设计:随机对照动物实验。单位:华中科技大学同济医学院附属协和医院手外科。材料:实验于2003-01/2004-12在华中科技大学同济医学院完成,选择健康成年不同窝的Wistar大鼠40只,随机分为实验组和对照组,每组各20只。方法:制备转化生长因子β1质粒及冷冻的异体坐骨神经。实验组和对照组大鼠将坐骨神经在梨状肌孔下0.5cm处,切除2.0cm,神经缺损用预制冷冻的异体神经2.0cm移植修复,实验组局部肌肉及神经两断端注射转化生长因子β1质粒,对照组注射等量的生理盐水。分别于6,12周各组10只大鼠取材、切片、染色并进行轴索计数和统计学分析。结果:在实验过程中无动物死亡,均进入结果分析。6周时对照组神经移植段轴索间有轻度水肿,实验组轴索间基本无水肿,再生神经数量接近正常;12周时,实验组整个神经移植段基本被再生轴突充满,有髓纤维排列整齐,轴突和髓鞘发育良好,实验组再生轴突数显著高于对照组,差别具有极显著性[(98.6±4.8),(75.8±5.1)个/μm2,t=2.962,P<0.01]。结论:反复冻融冷藏保存可降低异体神经的抗原性,具有修复神经缺损的可能性。局部使用转化生长因子β1质粒,可在局部发挥免疫抑制作用,降低宿主的免疫排斥反应。     

转化生长因子-β3对增生性瘢痕成纤维细胞的生物学作用

背景哺乳类动物有3种TGF-β异构体即TGF-β1,β2,β3,这3种异构体各自具有独特而不同的生物学作用,TGF-β1是明显的促瘢痕形成因子,而TGF-β3可减少TGF-β1,β2的产生,从而减少细胞外基质(ECM)合成,因此,TGF-β3有可能是人体内天然的抗瘢痕形成因子.目的通过外源性TGF-β3对增生性瘢痕成纤维细胞(HSFB)生长增殖及Ⅰ,Ⅲ型胶原及TGF-β1蛋白表达的影响,了解其生物学行为,为临床治疗提供理论依据.设计随机对照实验研究.地点和对象汕头大学医学院第二附属医院整形烧伤外科完成,对象为新鲜无菌增生性瘢痕组织,来源于本科收治及门诊手术的增生性瘢痕患者6例,男3例,女3例;年龄5～45岁.干预6例增生性瘢痕成纤维细胞体外培养,分为4组,实验组又分为5,10,50 mg/L组分别加TGF-β3 5,10,及50 mg/L,对照组加入FBM1.5 mL,采用MTT比色法测定TGF-β3对HSFB增殖活性的影响,3H-脯氨酸掺人法测定其胶原合成,免疫组化检测Ⅰ,Ⅲ型胶原及TGF-β1蛋白表达情况.主要观察指标TGF-β3对HSFB体外增殖,HSFB Ⅰ,Ⅲ型胶原及TGF-β1蛋白表达的影响,TGF-β3作用后HSFB胶原合成情况.结果转化生长因子β3可抑制HSFB细胞增殖,作用120 h后实验组细胞密度分别为(6.34±0 51),(6.01±0.38),(5.24±0.65)×105/瓶,明显低于对照组(10.69±0.76)x105/瓶(F=102.432～163 024,P＜0.01);转化生长因子β3可抑制胶原蛋白合成,实验组(10,50mg/L组)脯氨酸含量分别为(164.01±70.27),(151 02±49 85)min-1明显低于对照组9231.56±67.83)min-1(q=32.124,31.021,P＜0.01);下调TGF-β1蛋白及Ⅰ型胶原蛋白表达;而对Ⅲ型胶原影响较小.结论TGF-β3可抑制HSFB细胞增殖,下调TGF-β1蛋白表达,减少胶原合成,显示其具有抗组织纤维化的作用,具有临床应用价值.     

胶质细胞源性神经营养因子联合转化生长因子β1体外诱导大鼠脊髓源性神经干细胞的分化

背景:胶质细胞源性神经营养因子与转化生长因子β1同属于转化生长因子β超家族,两者在哺乳动物中枢与外周神经系统发育、分化及细胞周期的调节中扮演重要角色。目的:观察胶质细胞源性神经营养因子联合转化生长因子β1体外诱导脊髓源性神经干细胞的分化,并与单一因子诱导培养液比较。设计:对照观察。单位:南方医科大学附属深圳医院中心实验室。材料:选用10只清洁级孕16d的SD大鼠,由华中科大同济医学院动物中心提供。主要试剂及材料:DMEM/F12,B27(GIBCO);碱性成纤维细胞生长因子,EGF,胶质细胞源性神经营养因子,转化生长因子-β1(PeproTech);胎牛血清(Hyclone);神经巢蛋白(nestin)多抗(武汉博士德);胶质纤维酸性蛋白(GFAP)多抗,神经丝蛋白(NF-200)单抗(Sigma)。方法:实验于2005-10/2006-09在南方医科大学附属深圳医院中心实验室完成。无菌条件下分离大鼠胚胎,进行脊髓源性神经干细胞的分离培养。实验分①基础培养基组:含青霉素、链霉素、两性霉素B及体积分数为0.02 B27添加液的DMEM/F12。原代培养1周后,获取体外稳定增殖的鼠脊髓源性神经干细胞克隆。②对照组:在基础培养基中加入体积分数为0.1的胎牛血清。③碱性成纤维细胞生长因子组。④转化生长因子β1组。⑤胶质细胞源性神经营养因子 转化生长因子β1组。换用诱导培养基,即分别在基础培养基中加入20μg/L碱性成纤维细胞生长因子、2μg/L转化生长因子β1、10μg/L胶质细胞源性神经营养因子 2μg/L转化生长因子β1。①光镜观察在不同因子诱导情况下脊髓源性神经干细胞的分化情况。②免疫细胞化学染色标记检测神经元与星状胶质细胞的表达。③通过荧光激发流式细胞仪分选技术对分化细胞计数,检测不同诱导环境下神经干细胞分化为神经元及星状胶质细胞的阳性百分率。主要观察指标:①各组细胞分化的形态学特点。②各组神经干细胞免疫组织化学检测结果。③各组神经干细胞分化为神经元及星状胶质细胞的阳性百分率。结果:①细胞分化形态:分化早期可见神经球贴壁,大量细胞向四周爬出,1周后迁徙的大部分细胞完全贴壁,完成分化过程。在细胞密度较低区域可辨认出神经元样细胞、星状胶质样细胞、寡突胶质样细胞。②免疫组织化学检测结果:对照组、转化生长因子β1组存在大量胶质纤维酸性蛋白染色阳性的星状胶质细胞;而碱性成纤维细胞生长因子组及胶质细胞源性神经营养因子 转化生长因子β1组分化的神经元细胞数量较多,神经丝蛋白染色阳性。③神经元及星状胶质细胞的阳性百分比:诱导1周后,胶质细胞源性神经营养因子 转化生长因子β1组神经元阳性百分比高于血清对照组、碱性成纤维细胞生长因子组及转化生长因子β1组(χ2=24.15,19.56,25.32,P<0.05～0.01),星状胶质细胞阳性百分比低于血清对照组及转化生长因子β1组(χ2=24.45,23.79,P<0.01)。结论:体外胶质细胞源性神经营养因子与转化生长因子β1的联合诱导有利于脊髓源性神经干细胞向神经元的分化,说明两者具有协同作用。     

基于循证构建住院患者肠内营养护理质量评价指标体系

目的 构建肠内营养护理质量评价指标体系,为提高临床护士执行力提供理论依据,以提高肠内营养护理质量。方法 基于循证方法学结合本院临床数据分析,应用德尔菲法对20名专家进行2轮函询,确定各指标内容及及重要性,结合层次分析法确定各指标权重。结果 经过2轮专家函询后,得到聚焦于过程质量指标下的一级指标1项即肠内营养规范符合率;4项二级指标即营养风险护理评估落实率、肠内营养护理评估落实率、肠内营养溶液配制落实率和肠内营养输注护理落实率;每项二级指标下级包括依次为3项、2项、3项、13项,共21项三级指标。结论 肠内营养护理质量评价指标体系具有科学性、有效性和可行性,可有效指导护士行为,评价肠内营养护理质量。     

转化生长因子β1对新鲜同种异体神经移植后神经再生的影响

背景周围神经缺损多采用自体神经移植,但存在一些问题,许多学者尝试异体神经移植,但存在许多问题,免疫排斥反应就是其中之一.目的观察局部应用转化生长因子β1对新鲜同种异体神经移植后神经再生的影响.设计随机对照的实验.单位华中科技大学同济医学院附属协和医院手外科.材料实验于2001-08/2002-10在华中科技大学同济医学院附属协和医院完成.选择健康成年不同窝的Wistar大鼠60只,随机分为实验组、空白组、对照组3组,每组20只.方法制备转化生长因子β1质粒待用.制备动物模型,将两组大鼠的坐骨神经在梨状肌孔下0.5 cm处,用消毒的剃须刀片整齐切断并切除2.0 cm,切除的神经段互换移植修复神经缺损,实验组局部肌肉及神经两断端注射转化生长因子β1质粒,空白组、对照组注射等量的生理盐水,实验组、空白组不使用任何药物,对照组给予环孢霉素A(15 mg/kg)喂养.分别于6周和12周各取10只取材、切片、染色染色①Gleesluxotfast blue法染色.②髓鞘坚牢蓝染色法.轴索计数术后12周的移植体中段染色标本,随机取视野,在光镜400倍下计算1.0mm2内轴索数.组间比较采用t检验.主要观察指标各组移植区形态学观察和轴突计数.结果实验动物数量分析60只动物在实验过程中无死亡,全部进入结果分析.①空白组可见移植物的不同地方出现广泛的单核细胞浸润,髓鞘脱水,可见大量的空泡变性,以6周时最为明显,整个移植物均被单核细胞浸润,排异反应严重,在移植段中,有极少量的轴突再生.12周时,移植体变细,大量瘢痕组织增生,水肿明显,可见极少量的许旺氏细胞和再生轴突,绝大多数再生的轴突未通过整个移至段.实验组、对照组有少量的单核细胞浸润,水肿较明显,但可见新生的血管在移植神经中形成,再生的轴突通过移植体.6周时,可见较多的许旺氏细胞增生.12周时,再生轴突已通过移植体,有一定量的髓鞘形成,许旺氏细胞增生明显,轴索间水肿减轻.各组移植段中外周的神经再生的轴突数量和髓鞘再生的数量较中心的多,且实验组中外周的轴索间水肿较中心的明显减轻.②术后12周,每组各取5只大鼠,在神经移植体中段随机取视野,400倍显微镜下观察计算1.0 mm2内轴突数,实验组、对照组轴突数显著高于空白组,组间差异有极显著性[(78.3±4.6),(76.1±4.2),(15.0±3.5),t=3.056,t=2.948,P＜0.01].实验组和对照组接近,差异无显著性[(78.3±4.6),(76.1±4.2),t=1.982 P＞0.05].结论局部使用转化生长因子β1质粒,可在局部发挥免疫抑制作用,降低宿主的免疫排斥反应.并使移植体轴突数增多,促进神经生长.     

转化生长因子β1中和抗体对转化生长因子β诱导肌腱胶原和术后粘连的影响

背景:研究表明,转化生长因子β1在肌腱损伤愈合过程中增加了肌腱细胞胶原的合成和术后粘连的形成.目的:观察转化生长因子β1抗体对转化生长因子β诱导的肌腱细胞胶原产生及术后粘连形成的影响.设计、时间及地点:随机分组观察实验,于2005-09/2006-06在同济医学院实验动物中心完成.材料:选择2-5月龄新西兰大白兔,体质量3.5～4.5 kg.转化生长因子由美国SantaCruz B iotechnology公司提供.方法:取兔屈指肌腱分离肌腱成纤维细胞、腱外膜细胞和腱内膜细胞,将细胞随机分成2组,实验组加入1 μg/L转化生长因子β后,再加入0.1,0.5,1.0mg/L转化生长因子β1中和抗体,对照组不添加任何试剂,酶联免疫吸附实验测定Ⅰ型胶原.取84只兔行中趾屈指肌腱切断吻合术,将其中36只兔随机分成3组,腱鞘内分别注入生理盐水、1.0,2.0 mg/L转化生长因子β1中和抗体,4,8周后取出肌腱行肌腱粘连检测、生物力学测定、组织学观察和扫描电镜观察;余48只兔随机分成2组,腱鞘内分别注入生理盐水和1.0mg/L转化生长因子β1中和抗体,1,2,4,8周后取出肌腱,原位杂交方法测定肌腱转化生长因子β1和Ⅰ型胶原mRNA的表达.主要观察指标:各组兔肌腱细胞胶原产生及术后粘连情况.结果:酶联免疫吸附实验显示,转化生长因子β1能明显提高肌腱细胞Ⅰ型胶原的产生;转化生长因子β1抗体能降低3种细胞Ⅰ型胶原的产生,随抗体质量浓度增加,Ⅰ型胶原水平逐渐降低,且呈剂量依赖性;术后4,8周,与1.0,2.0mg/L转化生长因子β1组比较,生理盐水组屈趾肌腱滑动距离较短,模拟主动屈曲度明显受限(P<0.05),最大抗断裂载荷各组间比较差异无显著性意义(P>0.05).扫描电镜和组织学观察结果显示,术后4,8周生理盐水组胶原纤维排列紊乱,1.0,2.0 mg/L转化生长因子β1组胶原纤维排列整齐.原位杂交结果显示,术后各时间点1.0 mg/L转化生长因子β1组转化生长因子β1和Ⅰ型胶原mRNA表达均低于生理盐水组(P<0.05).结论:转化生长因子β1抗体能有效抑制转化生长因子β1在肌腱损伤修复中的作用,减少粘连形成.     

血管平滑肌细胞中溶血磷脂酸受体mRNA表达含量的检测

背景:体内溶血磷脂酸存在3种受体,已有研究表明溶血磷脂酸受体1,2,3广泛分布于小鼠大脑皮质、肾脏的外髓层和内髓层、睾丸、胸腺、心脏、肺、胃、脾脏,而肝脏、小肠和骨骼肌分布较少,小鼠血管平滑肌细胞膜上是否存在多种溶血磷脂酸受体有待研究。目的:观察血管平滑肌细胞中溶血磷脂酸受体mRNA表达含量情况。设计:观察对比实验。单位:华中科技大学同济医学院。材料:选用24只C57BL/6小鼠,雌雄不限,7～8周龄,体质量(25±3)g左右,由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供。Trizol试剂购自美国Invitrogen公司;dNTP Mix、RNasin购自TaKaRa公司;M-MLV逆转录酶及缓冲系统购自Promega公司;Taq DNA聚合酶及缓冲系统购自Biostar公司;Oligo(dT)18引物购自上海生工。引物参照文献及核苷酸序列数据库设计,由上海生工合成。方法:实验于2005-08/2006-01在华中科技大学同济医学院综合实验室完成。20g/L氯胺酮(5mL/kg)腹腔麻醉小鼠,无菌操作取出胸主动脉段,采用贴壁法培养血管平滑肌细胞,实验用4～6代细胞,细胞纯度达95%以上。采用RT-PCR技术测定小鼠血管平滑肌细胞溶血磷脂酸3种受体基因的mRNA相对表达量。主要观察指标:小鼠血管平滑肌细胞溶血磷脂酸受体mRNA的相对表达量检测及受体种类的比较。结果:溶血磷脂酸受体1与溶血磷脂酸受体2在小鼠血管平滑肌细胞的表达量相近(P>0.05)。溶血磷脂酸受体3在小鼠血管平滑肌细胞的表达量为(0.53±0.05),少于溶血磷脂酸受体1和溶血磷脂酸受体2(0.79±0.05,0.82±0.06,q=23.78,26.53,P<0.01)。结论:血管平滑肌细胞存在3种溶血磷脂酸受体,溶血磷脂酸受体1与溶血磷脂酸受体2在小鼠血管平滑肌细胞的表达量没有差别,而溶血磷脂酸受体3在小鼠血管平滑肌细胞的表达量少。