人类生精相关基因TSARG6的原核表达和抗体制备

目的 构建人类生精相关基因pGEX-KG/TSARG6原核表达载体,原核表达、制备并鉴定多克隆抗体.方法 以人类睾丸cDNA文库为模板,用PCR方法扩增得到TSARG6基因开放阅读框(ORF)全长序列,插入原核表达载体pGEX-KG中,经测序鉴定后将重组质粒转入E.coli JM109细菌,IPTG 诱导表达GST/TSARG6融合蛋白,采用SDS-PAGE 和Western blot鉴定融合蛋白,免疫家兔,制备抗TSARG6 多克隆抗体,Western blot检测抗体特异性.结果 经测序验证,我们成功构建了pGEX-KG/TSARG6 重组质粒;转化重组质粒的E.coli JM109细菌经 IPTG 37℃诱导3 h后高效表达GST/TSARG6融合蛋白;Western blot 实验结果显示制备的多克隆抗体可与原核表达融合蛋白特异性结合.结论 成功进行了TSARG6基因的原核表达和多克隆抗体制备,为TSARG6的后续功能研究提供了有力的工具.     

癌症转移相关基因Syntenin1多克隆抗体的制备与鉴定

目的 获得原核表达GST-Syntenin1融合蛋白,制备高效价的抗Syntenin1多克隆抗体.方法 RT-PCR扩增Syntenin1 cDNA开放阅读框(CDS)序列,亚克隆到编码GST的pGEX-4T-2原核表达载体上,将编码Syntenin1的pGEX-4T-2-Syntenin1重组质粒化学转化BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导GST-Syntenin1融合蛋白表达,对融合蛋白亲和纯化.SDS-PAGE鉴定后,将纯化的融合蛋白辅以弗氏佐剂,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blot检测抗体效价及特异性.结果 成功制备GST-Syntenin1融合蛋白及多克隆抗体.Western blot结果表明Syntenin1兔多克隆抗体效价可达到1∶20 000,且与Syntenin1蛋白特异结合.结论 成功制备Syntenin1多克隆抗体,为进一步研究Syntenin1基因的功能奠定了基础.     

PAK6基因的克隆、抗体制备及在前列腺癌中的表达

目的 在克隆P21相关激酶6(PAK6)全长cDNA的基础上,进一步克隆PAK6-N端基因并使其在大肠杆菌中高效表达,纯化基因产物并进行多克隆抗体制备,为研究PAK6与疾病的关系奠定基础.同时研究PAK6在前列腺癌中的表达.方法 根据人全长PAK6 cDNA序列,设计PCR引物,以人前列腺癌cDNA文库为模板利用PCR技术克隆PAK6全长cDNA.在此基础上,以PAK6全长cDNA为模板克隆PAK6-N端基因,将扩增产物克隆至大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1中,经EcoRI/XhoI双酶切鉴定后,进行DAN序列测定.GST-PAK6-N融合蛋白在硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下在大肠杆菌BL21中得到表达.利用G1utothione亲和层析纯化融合蛋白,用纯化的GST-PAK6-N融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并用纯化的抗PAK6多克隆抗体在3例前列腺癌病人标本中进行了免疫组化表达的初步研究.结果 成功克隆了PAK6全长cDNA和PAK6-N端基因片断,在E.coli中表达了PAK6-NT,纯化了GST-PAK6-N融合蛋白,并制备了PAK6特异性抗体.免疫组织化学研究表明:3例前列腺癌患者石蜡包埋病理组织切片免疫组化染色全部表现为间质阳性,PAK6在前列腺癌间质中呈现表达,而前列腺癌细胞则不染色.结论 首次克隆了PAK6全长cDNA和PAK6-N端基因片断并成功制备了PAK6特异性抗体,为深入探讨PAK6在前列腺癌中的作用奠定了基础.初步揭示PAK6在前列腺癌的表达     

小鼠精子蛋白Sp17的克隆、表达及其免疫原性研究

目的 获得鼠精子蛋白Sp17基因,构建重组表达载体并实现其在大肠杆菌中的高效表达,为制备免疫性避孕疫苗奠定基础.方法 提取BALB/c小鼠睾丸组织总RNA,通过RT-PCR扩增Sp17基因全长cDNA序列,并将其克隆至pMD 18-T质粒载体中,再经HindⅢ/ XhoⅠ双酶切将Sp17基因片段亚克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western blot对表达产物进行初步鉴定,并检测重组蛋白Sp17免疫小鼠后血清特异抗体滴度.结果 获得了小鼠Sp17的全长cDNA,成功构建了重组原核表达载体pET/Sp17,在IPTG的诱导下实现了目的蛋白在大肠杆菌中的高效表达,免疫后小鼠血清中检测到特异性抗体.结论 小鼠精子蛋白Sp17基因序列已被克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,并在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效、正确的表达,重组蛋白Sp17能够诱导产生特异性免疫反应,具有一定程度的免疫原性.     

多疣壁虎血管活性肠肽基因的克隆及表达

目的:克隆多疣壁虎血管活性肠肽(VIP)的cDNA全长序列,研究VIP在正常壁虎各组织中的表达及断尾损伤后脊髓再生过程中的表达变化。方法:通过对多疣壁虎断尾损伤cDNA文库克隆测序获得VIP基因序列。通过Northern blot验证VIP转录本的大小,通过原位杂交检测VIP mRNA在正常壁虎脊髓中的分布。制备壁虎断尾损伤模型,通过采用Real time-PCR和原位杂交的方法检测VIP mRNA在壁虎损伤模型断端近侧脊髓中的表达变化。结果:VIP mRNA全长1933 bp,编码156个氨基酸的前原蛋白。编码的成熟肽与其他物种的同源性约为82.1%。RT-PCR和Northern blot显示VIP在正常壁虎组织中广泛表达,且通过Northern blot发现正常壁虎体内只一个转录本,大小约1.9kb。原位杂交结果显示VIP阳性信号主要分布于脊髓灰质中,白质中仅有少量表达。Real-time PCR和原位杂交结果表明断尾损伤后的近端脊髓组织中VIP表达呈动态变化。结论:获得壁虎VIP全长mRNA序列的基本特征及其多组织表达图谱。VIP在壁虎的脊髓中主要分布于灰质中,壁虎在断尾损伤后近端脊髓VIP的表达呈动态变化。     

His标记小鼠SRG-S基因的克隆和表达纯化

目的构建His标记的小鼠精子发生相关基因SRG-S的原核表达载体并实现其表达及纯化。方法提取小鼠睾丸组织总RNA,应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增目的基因片段,克隆入pGEM-T-easy载体,经测序正确后,定向亚克隆入pET-30a( )表达载体,转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3),异丙基硫代--βD-半乳糖苷(IPTG)诱导表达,Ni-NTA亲和层析纯化融合蛋白,并利用抗His单克隆抗体进行Western blot检测。结果RT-PCR扩增得到大小约591 bp的目的基因片段,DNA序列分析结果与GenBank公布的序列一致,SDS-PAGE电泳显示经IPTG诱导有约32 kD的重组蛋白表达,纯化后的蛋白纯度达90%以上,且Western blot印迹表明该融合蛋白具有特异的抗His抗体特性。结论采用基因克隆技术成功构建了带His标签的小鼠SRG-S原核表达载体,并获得了高纯度的重组蛋白,有利于后期抗体的制备,为进一步从蛋白质水平研究该基因的功能奠定了基础。     

BC022687融合蛋白在大肠杆菌中的表达、纯化、抗体制备及特异性鉴定

目的:构建BC022687的原核表达载体,诱导该质粒在大肠杆菌中表达并纯化其表达的融合蛋白,制备抗体并进行特异性鉴定。方法:采用RT-PCR法从18-20g体重雄性小鼠睾丸组织中扩增BC022687cDNA,经TA克隆及亚克隆方法后定向连入原核表达质粒pET-28a,将重组表达质粒转化至大肠杆菌BL-21(DL3)上,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析,用考马斯亮蓝染色及Western blot分析鉴定后,利用镍亲和层析法纯化表达融合蛋白,免疫新西兰兔,制备多克隆抗体,以诱导表达的融合蛋白为样本,Western blot实验检测抗体的特异性。结果:测序结果证实成功扩增出目的基因BC022687;酶切和测序结果证实pET-28a-BC022687原核表达载体构建成功;SDS-PAGE电泳显示表达出18.0kU的外源蛋白。Western blot检测结果显示,表达出的蛋白为6×His tag的融合蛋白,而且Ni-NTA亲和层析法纯化该重组蛋白成功;将纯化的融合蛋白免疫新西兰兔,制备获得了抗BC022687蛋白的多克隆抗体,鉴定实验显示抗体特异性好。结论:已成功构建、表达、纯化了BC022687融合蛋白,以及成功制备了其特异性抗体,为研究BC022687蛋白在精子发生中的作用奠定了基础。     

重症肌无力相关基因P9 TRAF型锌指结构域的表达及抗体制备

目的 克隆重症肌无力相关基因P9 TRAF型锌指结构域(P9 TRAF-type zinc finger domain,简称P9-ZFD)的cDNA片段及表达其编码的蛋白质,制备P9-ZFD多克隆抗体。方法 应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)克隆编码P9-ZFD的cDNA序列,构建pET24a-P9-ZFD表达载体,在E.coli BL21(DE3)宿主菌中胞内诱导表达P9-ZFD蛋白,用经组氨酸亲和层析纯化的P9-ZFD融合蛋白免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体,Western blot鉴定抗体的免疫特异性。结果 扩增的P9-ZFD基因片段经测序证实与基因库报道的序列完全一致。表达、纯化的P9-ZFD融合蛋白相对分子质量约30 000,其纯度达 95％以上。制备的P9-ZFD抗体仅与纯化的P9-ZFD融合蛋白产生特异性免疫反应。结论 P9基因TRAF型锌指结构域编码的蛋白质能够在原核细胞中表达,并能获得具有特异免疫反应性的P9-ZFD多克隆抗体。     

睾丸表达新基因HSD-28的克隆及其编码蛋白质的研究

目的 研究从人初级精母细胞特异EST文库中克降的新基因HSD-28及编码蛋白质在精子发生过程中的表达及可能发挥的功能.方法 利用根据本实验室构建的人初级精母细胞特异EST文库,通过电子克隆方法,从网络数据库资源获取基因HSD-28.纯化原核表达系统表达的HSD-28蛋白,以此免疫新西兰白兔制备针对HSD-28的特异性多克隆抗体.采用免疫组化的方法研究HSD-28在人睾丸组织中的表达定位.最后,利用酵母舣杂交系统筛选与HSD-28相互作用的蛋白质.结果 克隆得到了的HSD-28基因,提交GenBank获得登陆号为AY251533,全长为641个碱基,其中开放阅读框为504碱基,编码一个由168个氨基酸构成的蛋白质,命名为HSD-28蛋白.将构建的pET-30a-HSD-28重组质粒转化到BL21(DE3)宿主菌,表达并纯化了HSD-28蛋白,大小约为28kDa.免疫组织化学结果显示,HSD-28蛋白特异的定位于人精原细胞和早期初级精母细胞.筛选得到与HSD-28相互作用的两个阳性克隆45#和106#.结论 从人睾丸cDNA文库中成功克隆得到HSD-28基因,其编码蛋白质表达定位于人精原细胞和初级精母细胞中,可能参与精子发生过程中减数分裂的调节.     

一种广州管圆线虫新基因——胶原蛋白全长cDNA的克隆和鉴定

目的克隆和鉴定广州管圆线虫(Angiostrongyluscantonensis)新基因——胶原蛋白(collagen,COL)全长cDNA序列。方法根据表达序列标签(expressionsequencetag,EST)中部分序列和文库载体序列设计引物,采用PCR技术从广州管圆线虫幼虫的cDNA文库中分段扩增cDNA序列,用DNAMAN软件拼接分段扩增的序列以得到全长cDNA序列;利用多种生物信息学软件对cDNA全长序列进行同源性搜索与结构分析。根据cDNA全长序列,设计新的引物从文库中扩出包含胶原蛋白全长开放阅读框(openreadingframe,ORF)的cDNA片段,PCR产物纯化后克隆到pMD18-T载体上并测序。重组T载体经双酶切后切下的新基因AcCOL亚克隆到原核表达质粒pET32a( )中。结果克隆一个广州管圆线虫新基因全长cDNA序列;序列比对、蛋白结构域搜索及结构分析结果显示,该新基因所编码的是一种胶原蛋白。构建的新基因重组质粒经双酶切后证明含有与目的片段长度相符的插入片段。结论克隆并鉴定了广州管圆线虫新胶原蛋白编码基因全长,成功构建了该基因的原核表达重组质粒pET32a( )-AcCOL。     

小鼠DNAJB13与HK1 的相互作用

目的探讨小鼠DNAJB13与HK1是否具有相互作用。方法应用双酶切连接方法构建pGEX-4T-1/Dnajb13原核表达载 体,测序验证;重组质粒转化感受态细胞DH5α,用IPTG诱导融合蛋白GST-DNAJB13表达,采用SDS-PAGE考马斯亮蓝染色和 Western blotting分析蛋白和鉴定;提取小鼠睾丸蛋白,采用GST pull down检测DNAJB13与HK1是否具有相互作用。结果成 功构建pGEX-4T-1-Dnajb13重组质粒,测序结果与标准序列一致;转化重组质粒的大肠杆菌在37 ℃,IPTG浓度1 mmol/L诱导 下高效表达融合蛋白;GST pull down检测结果阳性,显示DNAJB13与HK1存在相互作用。结论在小鼠睾丸中,DNAJB13与 HK1存在相互作用,可能参与精子形成和精子运动。     

Study on the Specific Gene Expression during Spermatogenesis of Rat

Testicular spermatogenic cells possess the characteristics of selectable geneexpression during the germ cell differential process. There is a property oftransitional expression of the gene types during spermatogenesis[1 ] .For example,when structure genetic expression of testicular somatic cells was terminated,thespecific gene expressions of the testicular germ cell were activated[2 ] . Therefore,differential process of germ cells of differentdevelopmental stage is performed underthe programme…     

一种新的睾丸特异核孔蛋白基因特性的研究

目的通过筛选人睾丸特异基因及对其结构和功能的研究,为阐明精子发生与成熟提供新的线索。方法采用筛选人睾丸表达文库、快速扩增ｃＤＮＡ５′末端、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹分析、荧光原位杂交（ＦＩＳＨ）以及基因重组等技术。结果（１）获得一新的长度为２２０９ｂｐ的ｃＤＮＡ,编码７００个氨基酸,将该基因命名为ＢＳ－６３。Ｇｅｎ－Ｂａｎｋ注册号为Ｕ６４６７５。（２）ＢＳ－６３Ｎ端具有核孔蛋白的特征性结构元件“ＸＦＸＦＧ”或“ＦＧ”以及与Ｒａｓ相关核蛋白（Ｒａｎ）结合的典型特征。（３）Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹分析显示,ＢＳ－６３基因有６．０和８．５ｋｂ两种转录形式,其中６．０ｋｂ为睾丸组织特异性转录本。（４）ＦＩＳＨ显示,ＢＳ－６３基因定位于２ｑ１１．２～１２。（５）ＢＳ－６３ｃＤＮＡ在大肠杆菌中获得高效表达,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示,表达蛋白的相对分子质量约为８００００。（６）体外功能实验表明,该表达蛋白可被蛋白激酶Ｃ及细胞周期依赖性蛋白激酶Ⅱ磷酸化。结论ＢＳ－６３可能是一种新的睾丸特异核孔蛋白。     

人肿瘤坏死因子样蛋白全长cDNA的克隆及原核表达

目的分离、克隆编码人肿瘤坏死因子样蛋白(TNFLP)的全长cDNA,并对其功能进行初步研究。方法从本室构建的λZAP表达胎脑文库中分离到编码TNFLP的全长cDNA。应用多种软件对该基因及其编码蛋白进行分析,寻找其同源蛋白,分析其亲、疏水性及其存在的结构域和基序。以Northern印迹分析检测TNFLP的mRNA的组织分布,并用谷胱苷肽-S-转移酶(GST)原核表达系统分段表达TNFLP的N端和C端蛋白。结果TNFLP全长共2112bp,编码一208个氨基酸的蛋白。亲、疏水性分析显示,TNFLP有两个疏水区,且C端95个氨基酸与小鼠的TNF-α一致性为42%。基序分析显示,TNFLP的C端有一内质网膜定位信号-TYKRL,与TNF-α完全一致。人的TNFLP位于人的16号染色体上。Northern杂交显示,TNFLP在心、脑和胰腺中呈高表达,可见一个转录本。用GST原核表达系统,分段表达了TNFLP的N端和C端。结论初步分析了TNFLP的组织表达谱,并分段表达了其N端和C端,为进一步研究其功能提供了条件。     

小鼠生精相关基因pQE/Dnajb13重组载体的构建和蛋白表达

目的利用分子克隆技术构建重组表达载体pQE/Dnajb13,在大肠埃希菌中高效表达、鉴定并纯化。方法应用RT-PCR技
术,以小鼠睾丸cDNA文库为模板扩增Dnajb13基因全长开放阅读框,将其连接到pQE载体后测序鉴定;将重组质粒转入宿主菌
E.coli M15,经IPTG诱导表达His/Dnajb13融合蛋白,Ni2+亲和层析纯化融合蛋白,采用SDS-PAGE 和Western blotting 对融合蛋
白进行分析和鉴定。结果成功构建了pQE/Dnajb13重组质粒,测序结果与预期一致;转化重组质粒的E.coli M15经IPTG 37 ℃
诱导4 h后高效表达His/Dnajb13融合蛋白。结论成功进行了pQE/Dnajb13重组质粒的构建和重组蛋白的表达,为Dnajb13基因
的功能研究奠定了基础。
     

发育中Wistar大鼠大脑皮层甲基化结合蛋白-2基因表达变化

目的:研究甲基化结合蛋白-2(methyl-CpG-binding protein 2,mecp2)基因在发育中正常Wistar大鼠大脑皮层表达水平的变化.方法:应用实时定量PCR(real-time PCR),Northern印迹杂交对mecp2基因在正常Wistar大鼠发育的不同阶段:胚胎第15天(E15)、第17天(E17)、第19天(E19)、出生当日(P0),生后第7天(P7)、生后第14天(P14)、生后第28天(P28),成年期大鼠mRNA的表达水平进行定性、定量分析;应用Western印迹杂交对MeCP2的表达水平进行半定量分析.结果:mecp2基因是在正常Wistar大鼠大脑皮层中表达的mRNA,约为10kb.从胚胎至成年期的发育过程中,mecp2基因mRNA的表达虽有波动,但差异无显著性.mecp2基因在正常Wistar大鼠大脑皮层中仅表达一种MeCP2,相对分子质量为75 000.在不同发育阶段其表达水平表现为,胚胎E15表达水平最低,自胚胎E19始至成年期MeCP2表达水平较E15明显增高.生后第7日至成年期,各时间点间表达水平的变化差异没有显著性.结论:随着正常Wistar大鼠大脑皮层神经元的发育成熟,MeCP2的表达水平逐渐增高,说明MeCP2对神经元的成熟有重要作用,并可能与维持神经元的成熟状态有关.     

人tau融合蛋白的原核表达及纯化

目的构建人His-tau和GST-tau融合蛋白表达质粒并在大肠杆菌中诱导表达及纯化。方法以质粒pEGFP-tau为模板通过PCR扩增出人tau全长cDNA,并构建到原核表达载体pET28a和pGEX-5X-1中,挑选阳性重组子,经限制性内切酶鉴定后转化到大肠杆菌BL21中,然后用IPTG诱导表达,通过SDS-PAGE染色及Western-blot方法鉴定表达的融合蛋白。分别使用His Bind Resin和Glutathione Sepharose 4B与融合蛋白结合来纯化融合蛋白。结果成功构建原核表达质粒pET28a-tau和pGEX-5X-1-tau并在大肠杆菌BL21中诱导其大量表达。经His Bind Resin和Glutathione Sepharose 4B纯化后,可以得到较纯化的His-tau和GST-tau融合蛋白。SDS-PAGE及Western-blot分析显示,特异性的抗tau单克隆抗体(tau-5)所识别的融合蛋白分子量与理论值相近。结论构建了人tau两种原核表达的融合蛋白质粒,并高效表达和纯化了该蛋白,为进一步的tau与其它功能性蛋白的相互作用研究奠定了基础。     

γ-突触核蛋白的克隆、表达及纯化

目的对γ-突触核蛋白(synuclein)基因进行克隆,并对其表达及纯化条件进行优化。方法根据GenBank中γ-突触核蛋白的基因序列,设计PCR引物,从人脑cDNA文库中扩增γ-突触核蛋白的编码DNA序列,将其克隆至pGEX-6p-1载体中,构建重组质粒,将测序正确的重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,用IPTG诱导表达;对培养温度、IPTG的用量、诱导时间等条件进行了优化;用SDS-PAGE和质谱分析表达的目标蛋白;用亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤纯化目标蛋白。结果γ-突触核蛋白在大肠杆菌中高效、可溶性表达,经质谱鉴定及SDS-PAGE分析,表达产物为γ-突触核蛋白。经过纯化,得到纯度高达98%的γ-突触核蛋白。结论成功地在大肠杆菌中高效表达了γ-突触核蛋白,并建立了纯化工艺,得到高纯度的重组蛋白,为进一步研究γ-突触核蛋白的晶体结构、生物学活性及功能,探讨其在肿瘤中的发病机制奠定了基础。     

人Survivin蛋白的表达?纯化及初步应用

目的:克隆、表达肿瘤特异性凋亡抑制因子(Survivin),并对其在人肝癌诊断中的意义进行研究。方法:从人白血病细胞系HL60提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出Survivin基因片段。将Survivin基因片段插入载体pMD-18T中,测序正确后亚克隆到原核表达载体pGEX-2TK中。IPTG诱导重组质粒pGEX-2TK-Survivin在大肠杆菌BL21中表达N端融合GST的目的蛋白,采用GST蛋白纯化系统进行纯化,经SDS-PAGE分析后,将所得产物用Thrombin裂解后进行Westernblot鉴定。将获得的目的蛋白包板,用ELISA法初步检测了肝癌患者血清中抗Survivin蛋白的表达。结果:克隆了人Survivin基因、表达出相对分子质量约为16.2ku的蛋白并进行了肝癌患者血清的检测应用。结论:成功克隆、表达和纯化了Survivin基因和融合蛋白,为进一步探讨以Survivin为基础的肿瘤诊断和治疗奠定了实验基础。     

GST-p16融合蛋白的表达、纯化及鉴定

目的利用GST融合基因表达系统表达、纯化及鉴定GST-p16融合蛋白。方法以质粒pM-p16为模板,扩增出p16基因片段,将其克隆至大肠杆菌表达载体pGEX-6P-1,将所构建的重组质粒pGEX-p16转化大肠杆菌B121并诱导表达,采用GST蛋白纯化系统进行纯化,所得产物进行SDS-PAGE及Westernblot鉴定。结果大肠杆菌细胞经诱导高效表达出约42kD蛋白,其分子量与GST-p16融合蛋白相符。Westernblot结果显示该蛋白能够被p16．抗体特异性识别。结论本实验在大肠杆菌表达系统中高效表达了有活性的GSTipl6融合蛋白并可用于以后的实验研究。