浙江地区奈瑟淋球菌临床菌株porinⅠ基因优势型及原核表达系统的构建

目的分析浙江地区奈瑟淋球菌临床菌株porinⅠ基因优势型分布情况,构建porinⅠA与porinⅠB基因的原核表达系统。方法在先前研究的基础上,对确定的porinⅠA和porinⅠB基因进行T-A克隆后测定核苷酸顺序,分析porinⅠA和porinⅠB的地区优势基因型。再构建porinⅠA和porinⅠB基因优势基因型的原核表达系统,0.5 mmo L/L IPTG诱导后,10%SDS-PAGE检测蛋白表达情况。结果测序的5株porinⅠA全为血清型ⅠA-6;测序的11株porinⅠB中,血清型ⅠB-3有5株,血清型ⅠB-3/6有3株,血清型ⅠB-6有1株,其余2株为变异株。构建的原核表达系统PET-42-PⅠA的PⅠA表达量占细菌总蛋白量的30%;PET-42-PⅠB的PⅠB表达量占细菌总蛋白量的20%。结论浙江地区奈瑟淋球菌临床菌株porinⅠA以血清型ⅠA-6为优势基因型,porinⅠB以血清型ⅠB-3为优势基因型,porinⅠA相对于porinⅠB而言更加保守。所构建的原核表达系统能高效表达PⅠA与PⅠB重组蛋白。     

多重PCR技术检测b型流感嗜血杆菌荚膜基因

目的应用多重PCR技术研究杭州地区儿童中分离的流感嗜血杆菌b型菌株的检出率。方法以玻片凝集法的血清分型为金标准,以流感嗜血杆菌(Hi)荚膜编码基因(bexA)和b型特异性荚膜基因序列设计引物,应用多重PCR技术对流感嗜血杆菌菌株进行荚膜基因检测。结果 2001-2002年和2006-2007年分离的399株Hi临床株中,血清分型显示不可分型株297株,占74.44%,可分型株102株,占25.56%。b型仅1株,构成比0.98%。多重PCR检测显示:102株玻片凝集法可分型的菌株中,101株bex A PCR结果阳性,1株阴性;297株不定型株中2株bex A阳性。敏感度99.02%;特异度99.33%。Hib检测结果显示b型1株,占有荚膜菌株0.99%,与血清分型结果一致。结论 bex A PCR联合针对b型特异性荚膜基因的多重PCR技术,对Hib检出率100%,克服了血清分型的弊端。     

淋病奈瑟菌pI优势基因型及其G120/A121突变与耐药性关系

目的 分析浙江省上虞地区淋病奈瑟菌临床菌株外膜孔蛋白优势基因型及其G120和A121突变与耐药性关系.方法 建立能同时检测pIA和pIB基因的双重PCR.目的 扩增产物T-A克隆后测序,以分析G120和A121突变情况及证实双重PCR的检测特异性.采用酸性纸片法和二倍琼脂稀释法,分别检测pIA~+和pIB~+菌株产β-内酰胺酶情况以及对6种抗生素的耐药性.结果 多重PCR可准确地对所有受检淋病奈瑟菌临床菌株进行porin I(pI)基因分型,其检测灵敏度为1 ng DNA模板.116株淋病奈瑟菌临床菌株中,30.2%(35/116)为pIA~+菌株,69.8%(81/136)为pIB~+菌株.所有pIA~+菌株出现G120D/A121G双突变(88.6%)或A121G单突变(11.4%),98.8%pIB~+菌株出现G120K/A121D(65.0%)、G120K/A121G或G120N/A121D(13.8%)双突变以及G120D/N/K单突变(21.3%).34.5%(40/116)菌株产β-内酰胺酶,其中pIA+菌株产酶率(20%)明显低于pIB~+菌株(40.7%)(P＜0.05).上述临床菌株对青霉素、四环素、环丙沙星和阿奇霉素耐药率高达75.0%～90.5%,仅有3株菌株对头孢曲松耐药,未发现大观霉素耐药菌株.100%和71.4%不产β-内酰胺酶、G120和/或A121突变pIA~+菌株分别对青霉素和四环素敏感,但不产β-内酰胺酶G120和/或A121突变的pIB~+菌株对该2种抗生素耐药率均为100%.结论 所建立的多重PCR可用于淋病奈瑟菌pI基因快速和准确分型.上虞地区流行的淋病奈瑟菌主要携带pIB基因.大观霉素和头孢曲松仍可作为治疗淋病的首选药物.G120和/或A121突变增强对青霉素和四环素耐药性仅限于pIB~+菌株.     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌SCCmec分型的研究

目的应用多重聚合酶链反应(PCR)对临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的SCCmec基因型及亚型进行分型。方法收集医院2007年1月~2008年12月临床分离的65株MRSA用多重PCR检测MRSA的SCCmec的基因型及亚型。结果SCCmecⅠ型菌株5株(4.6%),SCCmecⅢ型菌株47株(72.3%),SCCmecⅣ型菌株2株(3.1%),未分型11株(16.9%),未检测到Ⅱ型。结论研究结果显示,医院分离的MRSA以SCCmecⅢ为主;多重PCR对MRSA进行SCCmec基因分型结果可靠,适合临床实验室。     

淋病奈瑟菌临床菌株porB基因分型及其突变与耐药相关性研究

目的:分析本地区淋病奈瑟菌临床菌株porB基因分型特点及其Gly120和Ala121突变与耐药性关系。方法:多重PCR扩增非产酶淋病奈瑟菌临床菌株porB基因、测序分析Gly120和Ala121突变,并与药敏试验比较。结果:154株非产酶淋病奈瑟菌临床菌株中,porB1A型和porB1B型临床菌株分别占29.9%和70.1%。porB1A型菌株均出现Gly120Asp/Ala121Gly双突变,对青霉素和四环素的耐药率分别为15.2%和10.9%;95.4%porB1B菌株存在出现Gly120和/或Ala121突变,耐药率分别为99.1%和97.2%,其中4株porB1B菌株121和122位氨基酸存在删除突变的菌株对青霉素和四环素的MICs分别高达为8 mg/L～16mg/L和8 mg/L。结论:建立的多重PCR可用于淋病奈瑟菌porB基因分型。本地区流行的非产酶淋病奈瑟菌主要携带porB1B基因,不同基因型临床菌株对抗生素的耐药率有显著性差异(P<0.05)。Gly120和/或Ala121突变增强耐药性仅限于porB1B菌株。     

2010年-2012年嘉兴港区头孢曲松非敏感淋病奈瑟菌流行现状及penA基因研究

目的调查2010年-2012年嘉兴港区头孢曲松非敏感淋病奈瑟菌的流行特征和基因型。方法收集患者中分离的淋病奈瑟菌256株,采用K-B法筛选出头孢曲松非敏感株78株,分析与头孢曲松非敏感淋病奈瑟菌感染的相关因素;用PCR扩增所有非敏感菌株的pen A基因片段,分析头孢曲松非敏感淋病奈瑟菌pen A基因的流行状况。结果在256株淋球菌中,检出头孢曲松非敏感菌株78株,占30.47%,并且每年呈上升趋势,未发现头孢曲松耐药菌株,年龄≥21岁和近2个月有服用抗生素与头孢曲松非敏感淋病奈瑟菌感染有相关。基因检测结果显示头孢曲松非敏感菌株pen A基因检出率极高,为82.05%。结论 2010年-2012年分离到的淋病奈瑟菌中头孢曲松非敏感株的比例较高,流行具有一定的特征性;本地区头孢曲松非敏感淋病奈瑟菌菌株的基因型以pen A为主。     

脑膜炎奈瑟菌检测及基因分群

目的 建立多重聚合酶链反应(PCR)技术对脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis,Nm)的快速诊断及分群方法.方法 应用多重PCR技术对本实验室保存的70株已鉴定Nm进行核酸鉴定及基因分群,同时检测23例流行性脑脊髓膜炎(简称流脑)疑似病例脑脊液标本中脑膜炎奈瑟菌特异性DNA片段.用传统的细菌培养法和血清凝集法作对照,比较其特异性.结果 68株Nm的多重PCR检测结果与血清分群结果一致,2株血清未能分群的Nm经多重PCR检测为C群;23例流脑疑似病例脑脊液标本经多重PCR检测有5例为C群,1例为A群,1例为B群,阳性检出率为30.43％.传统的病原分离培养、生化鉴定和血清学鉴定出4例为C群,阳性检出率为17.39％.结论 多重PCR技术对脑膜炎奈瑟菌检测的特异性优于传统的细菌培养法以及血清凝集法.     

上海市浦东地区淋病奈瑟菌分型与耐药性的相关分析

目的了解上海市浦东地区淋病病原体奈瑟双球菌的不同基因分型及各基因型与耐药性之间的对应关系。方法运用随机扩增多态性DNA(RAPD)指纹图谱对78株分离自不同患者淋球菌菌株进行区分，从分子水平对淋球菌进行基因分型，并在此基础上探讨不同的基因分型与耐药性之间的关系。结果78株淋球菌分离株RAPD图谱上相似，但各菌株基因图谱之间有明显不同DNA多态性，可将菌株区分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三种基因分型，对此三种基因分型与A、B、C、D四种不同的耐药类型进行对应分析，发现耐药类型与基因型别之间存在对应关系。结论通过研究发现浦东地区淋球菌流行株有着不同的耐药特点及基因型别，耐药性与不同的基因分型之间存在着一定相关性。     

荚膜多糖基因聚合酶链反应在肺炎链球菌临床诊断中的应用

目的 评价荚膜多糖基因(capsular polysaccharide synthesis locus,CPS)聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)在肺炎链球菌病例临床诊断中的应用价值。 方法 收集保定市各医院诊断为肺炎病例的临床标本,其中痰液1 850份、血液1 850份、脑脊液245份,分别进行cpsA基因PCR检测和传统细菌培养,比较两种方法对肺炎链球菌的检测结果。同时根据cps基因血清特异性区域设计引物,采用多重聚合酶链反应(multiplex polymerase chain reaction,MP-PCR)对210株肺炎链球菌分型,并与荚膜肿胀试验结果进行比较分析。 结果 cpsA基因PCR检测法在3945份临床标本中检出肺炎链球菌600例,检出率为15.21%,高于细菌培养法。以细菌培养法为参考标准,cpsA基因PCR检测肺炎链球菌的灵敏度为97.67%,特异度为89.54%。且在两种方法中痰液中肺炎链球菌检出率均高于血液与脑脊液,差异具有统计学意义(P<0.05)。210株肺炎链球菌中,198株被MP-PCR法分出血清型,分型率为94.29%,高于荚膜肿胀试验。两种方法鉴定血清型别一致率达80.81%。其中有7株被荚膜肿胀试验鉴定为其它型别:63株多重PCR鉴定为19F的菌株中,有5株被荚膜肿胀试验鉴定为6A;35株多重PCR鉴定为19A菌株中,有1株被荚膜肿胀试验鉴定为19F;8株多重PCR鉴定为14的菌株中,有1株被荚膜肿胀试验鉴定为19A。 结论 cpsA基因PCR检测和cps基因血清特异性区域的MP-PCR检测在肺炎链球菌检出和分型上优于传统细菌培养法和荚膜肿胀试验,可用于肺炎链球菌的临床诊断,且标本以痰液为宜。     

社区医院耐苯唑西林金黄色葡萄球菌的分子流行病学调查

目的调查本院2014年7月-12月MRSA分布情况、耐药表型、SCCmec分型及检测PVL基因。方法收集本院2014年下半年MRSA共53株。用VITEK 2鉴定菌株,检测耐药模式,多重PCR检测SCCmec分型,PCR检测PVL基因。结果 MRSA检出率前2位的科室是普外科9株(17.0%)、儿内呼吸科8株(15.1%)。标本类型居前2位的是脓液18株(34.0%)、痰17株(32.1%)。SCCmec分型为Ⅰ型3株、Ⅱ型14株、Ⅲ型25株、Ⅳa型7株、Ⅴ型1株、未分型5株。检出PVL基因阳性株10株。Ⅱ型、Ⅲ型和部分Ⅳa型除对β内酰胺类耐药外,对其他抗生素也多重耐药。结论本院分离的MRSA主要分布在普外科和儿科,标本类型以脓液、痰为主。SCCmec的型别以Ⅱ型、Ⅲ型为主,存在对非β内酰胺类抗生素耐药的SCCmecⅣ型菌株。应加强抗生素的合理使用,减少多重耐药菌的产生。     

多重PCR同时检测淋病奈瑟球菌及其青霉素、四环素耐药基因的研究

目的建立一种多重PCR方法,在同一扩增体系内同时检测淋病奈瑟球菌及其青霉素、四环素耐药基因,探讨采用多重PCR同时检测淋菌及其耐药基因的可行性. 方法根据淋菌CPPB、TeM-1、Tet-M基因序列,分别设计了3对引物,并在同一扩增体系内行PCR扩增,扩增的靶序列分别为150 bp、224 bp、316 bp. 结果淋菌及其青霉素、四环素耐药的标准菌株,上述3个基因位点的检测均为阳性,对125例临床标本同时进行传统培养、药敏和多重PCR检测,结果显示淋菌的检出率:培养法为20.0%,PCR法为24.8%;PPNG检出率:药敏法为16.0%,PCR法为20.8;TRNG检出率:药敏法为14.4%,PCR法为19.2%. 结论该法与传统的培养及药敏试验相比具敏感、特异、迅速、标本不受淋菌存活以及药敏试验诸多因素的影响,是一种简便、快速、可靠的方法.     

男性泌尿生殖道感染奈瑟菌属菌种的基因检测分析

目的 研究男性泌尿生殖道感染奈瑟菌属菌种的基因的检测分析,同时探讨非淋球菌奈瑟菌引起男性泌尿生殖道感染的病原学诊断及临床意义.方法 自2010年3月～2011年10月采集的102例慢性前列腺炎患者的前列腺的精液或按摩液标本,接种于淋球菌琼脂培养基中,放入烘箱中进行培养,采用聚合酶链反应(PCR)检测淋球菌隐蔽性质粒pJDL基因.结果 102例患者的前列腺液、精液标本分离到103株革兰阴性双球菌,其中粘液奈瑟菌39株、灰色奈瑟47株、嗜乳糖奈瑟菌7株、干燥奈瑟菌6株、微黄奈瑟菌2株、多糖奈瑟菌2例.pJDL基因经PCR检测结果显示,99株(95.19％)形成与淋病奈瑟菌一致的阳性反应;103株奈瑟菌对头孢菌素类、喹诺酮类抗生素具有显著的耐药性(35.6％～99.9％).结论 常规的细菌学形态检查、氧化酶试验以及检测隐蔽性质粒,其他淋球菌非特异性基因的方法,可导致对于非淋球菌奈瑟菌感染的误诊与漏诊.感染了泌尿生殖道非淋球菌奈瑟菌对临床常用的多种抗生素具有耐药性或多重耐药性,在疑似奈瑟菌属菌种感染的实验室检查中联合使用常规细菌学方法与基因检测方法,可有助于提高奈瑟菌属菌种鉴定及其感染诊断的准确率.     

应用多重PCR法快速检测伤寒沙门菌的研究

目的:建立快速、特异检测伤寒沙门菌的多重PCR法,应用于临床肠热症的快速诊断。方法:根据GenBank,EMBL及DDBL公布的伤寒沙门菌鞭毛蛋白抗原基因、菌体抗原基因及表面抗原基因的核酸序列,设计出针对fliC-d,rfbE,rfbS及viaB基因的4对特异性引物,采用多重PCR法检测伤寒沙门菌标准株、非伤寒沙门菌标准株及伤寒沙门菌临床菌株。结果:实验结果证实,所有伤寒沙门菌株应用多重PCR法均成功扩增出预先设计的4条特异性目的条带。结论:所建立的多重PCR法可用于快速检测和鉴定伤寒沙门菌,为肠热症的临床诊断及流行病学溯源提供了一种更简便易行的检测技术。     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌SCCmec分型与耐药性研究

目的研究临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)耐药性,检测MRSA葡萄球菌染色体mec盒(SCCmec)基因型,并进行杀白细胞素(PVL)毒力基因检测。方法采用标准平皿两倍稀释法测定250株MRSA对多种抗菌药物最低抑菌浓度(MIC),采用多重PCR方法对MRSA进行SCCmec基因分型,单一PCR方法对MRSA菌株进行PVL毒力基因检测。结果 250株MRSA经多重PCR方法检测SCCmec基因型,SCCmecⅡ-dcs型菌株30株,占12.0%,Ⅱ型的亚型1株,占0.4%,Ⅲ型62株,占24.8%,含有342 bp(dcs)额外扩增条带的Ⅲ型菌株141株,占56.4%,Ⅳ型7株,占2.8%,Ⅳa型1株,占0.4%,Ⅴ型1株,占0.4%,7株细菌未能分型,占2.8%,未发现Ⅰ型;单一PCR方法获得PVL呈阳性的菌株共2株,占临床分离MRSA的0.8%;各基因型对多种抗菌药物呈现不同程度的耐药。结论临床分离的MRSA以SCCmecⅢ型为主;其次为SCCmecⅡ型;有少量SCCmecⅣ型,少数菌PVL毒力基因阳性。     

多重耐药淋病奈瑟球菌耐药基因的研究

目的探讨淋病奈瑟球菌多重耐药与耐药基因的关系. 方法 应用K-B法与琼脂稀释法测定35株淋菌对抗生素的敏感性,煮沸法提取菌株DNA,PCR扩增TEM、tetM、erm和mefA基因. 结果 35株淋菌的敏感性测定显示:多重耐药现象明显,TEM耐药基因的检出率为88.6%,tetM基因的携带率为11.4%,首次在国内从35株淋菌中检出mef、erm耐药基因,其中mefA基因2株阳性,erm基因1株阳性. 结论淋菌的多重耐药与各耐药基因型之间密切相关.     

多重PCR检测毒力型艰难梭菌的方法学研究及应用

目的建立多重PCR方法检测毒力型艰难梭菌。方法设计艰难梭菌种特异tpi引物和毒力基因tcdA、tcdB特异性引物,建立多重PCR方法。利用已知菌株,验证方法的特异性和最低检出限。与厌氧培养法、ELISA法比较其检测临床菌株和其毒素分泌的准确性。结果多重PCR方法检测艰难梭菌的最低检出浓度为0.7 pg/μ1,特异性为100%。53株厌氧培养法鉴定的艰难梭菌临床分离株,多重PCR方法检测tpi基因均为阳性,其中tcdA+/tcdB+为39株,tcdA-/tcdB-为14株。ELISA法检测毒素A/B显示23株为阳性、30株为阴性。23株ELISA法毒素A/B阳性的艰难梭菌多重PCR方法检测结果均为tcdA+/tcdB+。结论多重PCR方法可用于检测毒力型艰难梭菌具有较高的临床应用价值。     

47株金黄色葡萄球菌临床血流感染分离株的基因分型研究

目的 研究金黄色葡萄球菌临床血流感染分离株的分子流行病学特征.方法 收集2006年1月至2008年12月解放军总医院分离的临床血流感染金黄色葡萄球菌菌株(共47株),标本来源均为患者静脉血.采用琼脂稀释法检测所有菌株对多种抗生素的耐药性,PCR方法 检测pvl毒素基因,DiversiLab~(TM)Rep-PCR分型系统分析菌株的同源性;对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)进行葡萄球菌染色体/mec(SCCmec)分型以及ST239型别的快速筛查;综合分型和药敏试验结果,挑选部分代表菌株进行多位点序列分型(MLST).结果 47株血流感染金黄色葡萄球菌中,pvl基因检出率为4.3%.MRSA占51.1%.MRSA均为SCCmec Ⅲ型菌株;Rep-PCR分为A～L共12个型,其中A型为最主要的型,共22株(46.8%),所有的MRSA均属于A、B两型.结论 47株临床血流感染金黄色葡萄球菌中的MRSA绝大部分为多重耐药克隆ST239-MRSA-SCCmecⅢ型.     

金黄色葡萄球菌sasX基因的检测及其分子流行特征

目的调查医院金黄色葡萄球菌sasX基因的携带情况并探究其分子流行特征,为揭示该基因在本地区的流行状况提供依据。方法收集中南大学湘雅医院2012年1-12月临床分离鉴定的金黄色葡萄球菌128株,采用PCR检测sasX基因,对该基因阳性的菌株采用多重PCR检测SCCmec分型、PCR扩增pvl毒素基因,并进行多位点序列分型(MLST)和葡萄球菌A蛋白序列分析。结果 128株金黄色葡萄球菌中共检测出2株sasX基因阳性菌株,检出率为1.6%,经头孢西丁鉴定这2株菌株均为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA),SCCmecⅢ分型均为SCCmecⅢ型,pvl基因均阴性,MLST分型为ST239,spa分型为t037型。结论首次在湖南地区临床分离的金黄色葡萄球菌中发现存在sasX基因,sasX基因可能是导致医院持续感染的毒力因素之一,应密切关注其流行发展趋势。     

实时荧光PCR方法分型检测细菌16S rRNA基因的临床应用

目的建立快速、准确、特异的检测细菌16S rRNA基因的实时荧光PCR法。方法根据Taq Man探针技术实时荧光PCR反应原理结合细菌16S rRNA基因序列,在高保守区域设计通用引物和特异性探针,对10种标准菌株及15种临床培养分离菌株进行PCR检测,优化反应体系,评价该方法的特异性、灵敏度、重复性,并对187份标本采用培养法和实时荧光PCR法进行检测比较。结果 10种标准株和15种临床培养株采用通用引物检测全阳性,9株革兰阳性菌株通过革兰阳性探针检测全阳性,16株革兰阴性菌株通过革兰阴性探针检测也全阳性。187例临床标本经实时荧光PCR检测阳性率为16.22%(30/185),培养法检出率为9.73%(18/185),2种方法革兰菌分型结果一致,细菌检出率前者明显高于后者,差异有统计学意义(P0.05)。结论多探针实时荧光PCR法检测细菌16S rRNA具有敏感性高、特异性强、方便快捷等特点,可在细菌感染性疾病中给临床医生提供更全面的病原学资料,早期指导抗生素的应用。     

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌基因诊断及多重PCR SCCmec基因分型方法的建立

目的建立对临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)基因诊断和金黄色葡萄球菌染色体mec基因盒(SCCmec)基因分型的方法。方法对临床分离的11株金黄色葡萄球菌采用双重PCR(femA和mecA)鉴定,再将鉴定为MRSA的临床菌株和3株标准株用多重PCR方法在一个反应体系(针对MRSA的8个基因)中进行SCCmec基因分型。结果临床分离株中有6株鉴定为MRSA,对其和MRSA标准株的多重PCR基因分型结果显示,两株临床株为SCCmecⅡ型,4株为Ⅲ型,标准株SA-w2为Ⅰ型,MRSA252为Ⅱ型。结论该研究可以很好地对临床MRSA进行基因诊断和分型,对MRSA的诊断和分型、耐药研究以及分子流行病学有重要意义。