结核分支杆菌Ag85B基因真核表达株的构建

目的 构建结核分支杆菌分泌蛋白Ag85B编码基因的DNA疫苗。方法 以结核分支杆菌H37Rv基因组为模板，PCR扩增Ag85B编码基因，用限制性内切酶消化后，插入真核表达载体pVaxl中，转化大肠杆菌DH5a，进行重组子筛选、鉴定。结果 以结核分支杆菌PCR扩增为阳性，经限制性内切酶消化后可见目的条带，所测定序列与报道的Ag85B序列一致。结论 成功地构建了结核分支杆菌Ag85B基因真核表达株。     

结核分支杆菌分泌蛋白Ag85B基因的克隆及表达

目的 对分支杆菌的一种分泌蛋白Ａｇ８５Ｂ的基因进行克隆、表达,为结核病进行诊断打下基础。方法 以结核杆菌Ｈ３７Ｒｖ株基因组ＤＮＡ为模板,以ＰＣＲ法对基因ａｇ８５ｂ进行扩增,产物与载体质粒ｐＥＴ２４ｂ构建表达Ａｇ８５Ｂ的重组质粒,将此重组质粒先转化入大肠杆菌ＤＨ５ａ内,抽提质粒,酶切检验,再转化入表达宿主大肠杆菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）菌株内,对转化菌株以ＩＰＴＧ进行诱导后,破菌,离心,上清进行ＳＤＳ－     

结核分支杆菌Ag85B蛋白在大肠杆菌中的高效表达

目的：通过结核分支杆菌Ag85B基因在大肠杆菌中的表达，获得大量纯化的重组Ag85B(rAg85B)蛋白。方法:应用PCR技术扩增结核分支杆菌H37RvAg85B DNA序列；以质粒pET24b为表达载体，构建Ag85B重组质粒，然后转化大肠杆菌BL21(DE3)；以IPTG诱导转化子，通过SDS—PAGE电泳鉴定rAg85B的表达水平，采用Novagen公司生产的His．Bind蛋白纯化试剂盒纯化rAg85B蛋白。结果:重组质粒PET24b—Ag85B测序表明与报道的序列相同；它在大肠杆菌BL21(DE3)细胞内以包涵体形式存在，表达量占菌体总蛋白的30％左右。纯化后的rAg85B样品经SDS—PAGE和光密度扫描分析表明其纯度约为95％左右，每100ml培养菌可获得10mg左右纯化的重组蛋白。结论:pET24b—Ag85B大肠杆菌工程菌株能高效表达rAg85B蛋白，大量纯化的rAg85B为其进一步的研究与应用奠定了基础。     

结核分支杆菌Ag85B基因在大肠杆菌中的高效表达

目的 通过结核分支杆菌Ag85B蛋白编码基因在大肠杆菌中稳定表达，以获得大量纯化的Ag85B蛋白。方法 采用DNA重组技术构建结核分支杆菌Ag85B基因的表达载体，双酶切和聚合酶链反应(PCR)鉴定重组子，阳性重组子转化大肠杆菌，并诱导表达外源蛋白。十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)鉴定Ag85B蛋白抗原在大肠杆菌中的表达，对染色的凝胶扫描，以测定目的蛋白表达水平。结果 菌体蛋白经SDSPAGE，含阳性重组质粒的菌体蛋白中出现一条新蛋白带，表达量占菌体总蛋白的33％～38％。Ag85B蛋白抗原在大肠杆菌中表达方式主要是包涵体形式。结论 构建的大肠杆菌重组体能高效表达结核分支杆菌Ag85B蛋白抗原。     

结核分支杆菌外分泌蛋白——Ag85复合体的研究进展

抗原Ag85复合物是结核杆菌的一种重要的外分泌蛋白,能诱导实验动物Th1型细胞免疫应答,该应答抵抗结核杆菌再感染的能力仅次于BCG所诱导的应答,并对其他分支杆菌如麻风杆菌也有一定的免疫保护作用。鉴于目前BCG作为疫苗存在的不足,以Ag85编码基因研制DNA疫苗已引起了较为普遍的重视。     

结核分支杆菌Ag85B融合蛋白表达载体的构建及纯化

目的：构建结核分支杆菌Ag85B基因在大肠杆菌的融合表达载体,制备MBP／Ag85B融合蛋白并将其纯化。方法：常规方法构建重组表达质粒pMAL-p2-Ag85B,内切酶EcoRⅠ/HindⅢ酶切鉴定;重组表达质粒pMAL-p2-Ag85B转化大肠杆菌,经0．3mmol／L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D thiogalactoside,IPTG）诱导表达产生融合蛋白（MBP／Ag85B）,Western blot鉴定表达产物。pMAL纯化树脂（Amylose resin）对MBP／Ag85B融合蛋白纯化。结果：重组质粒pMAL-p2-Ag85B经EcoRⅠ／HindⅢ酶切后,1％琼脂糖凝胶电泳证实Ag85B正向插入pMAL-p2载体,重组菌经IPTG诱导后,有约70kD蛋白表达,与预期的融合蛋白分子量相符,蛋白表达量约占细菌总蛋白量的40％;Western blot显示,MBP／Ag85B融合蛋白与人抗结核IgG抗体呈特异性反应;经Amylose resin纯化后,MBP／Ag85B融合蛋白的纯度可达95％以上。结论：成功构建结核分支杆菌Ag85B重组融合蛋白表达质粒并制备及纯化其融合蛋白,为进一步研究Ag85B生物学功能及其抗原表位分析奠定了物质基础。     

结核分枝杆菌Ag85B-Ag85A双抗原融合真核表达质粒的构建及表达

目的：构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B-Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体．方法：采用gene SOE-ing法将Ag85B和Ag85A编码基因用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser)3行PCR扩增融合，经限制性内切酶消化后克隆入pcDNA3．1( )中构建真核表达质粒pCDAg85B-A，酶切、DNA测序鉴定，用脂质体法将pCDAg85B-A转染COS-7细胞，采用RT-PCR，ELISA方法检测其表达．结果：Ag85B-Ag85A融合基因定向克隆人pcDNA3．1( )，双向测序表明碱基无突变，Ag85B-Ag85A融合基因在真核细胞中能表达．结论：成功构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B-Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体，为结核病基因疫苗的研究奠定基础．     

结核分支杆菌抗原85B真核表达质粒的构建

目的:构建结核分支杆菌分泌性抗原85B的真核重组表达质粒。方法:设计85B的特异引物,采用多聚酶链反应(PCR)技术从含85B基因质粒DNA中扩增85B基因片段,克隆至pMD18-T载体,经测序分析后,亚克隆至真核表达载体pVAX1,PCR和双酶切鉴定阳性菌株。结果:PCR扩增获得85B的基因片段,测序获得的正确片段被亚克隆至真核表达质粒pVAX1构建真核重组表达质粒pVAX1-85B。结论:成功构建了85B的真核重组表达质粒pVAX1-85B。     

结核杆菌分泌蛋白Ag85A基因的克隆、表达及其诊断价值

目的：获得重组抗原85A(rAg85A)，研究其免疫学特性，评价其在结核病血清学诊断中的价值。方法：应用基因工程技术克隆、表达、纯化Ag85A蛋白，通过Western印迹分析其抗原性。分别以结核分支杆菌纯蛋白衍生物（PPD）或纯化的rAg85A蛋白为抗原，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）及结核病一步检测血清中抗结核抗体。结果：重组质粒pET30a-Ag85A测序表明与报道的序列相同。它在大肠杆菌BL21(DE3)细胞内以包涵体形式存在，表达量占菌体总蛋白的2％左右，Western印迹分析它与抗结核分支杆菌多克隆抗体具有良好的免疫反应性。纯化的rAg85A样品纯度约85％左右，每100ml培养菌可获得2mg左右的重组蛋白。以33例正常人血清的OD值 2s为正常界限值，一步法的特异性和敏感性分别为87.9％和65.6％；PPD分别为93.9％和62.5％；rAg85A分别为93.9％和15.6％。结论：pET30a-Ag85A大肠杆菌工程菌能以包涵 体形式表达rAg85A蛋白，该蛋白具有较高的抗原特异性，但检测抗结核抗体的灵敏度低。     

结核分枝杆菌Ag85B-MPT64融合基因的构建表达

目的：构建结核分枝杆菌(H37Rv)Ag85B-MPT64融合基因并在真核细胞中表达．方法：采用序贯PCR(geneSOEing)法将Ag85B和MPT64编码基因用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser)3经PCR扩增融合，定向克隆入pcDNA3．1( )中。采用脂质体转染法将pcDNA／Ag85B—MPT64(pcDNA／AM)转染COS-7细胞，用RT-PCR、ELISA和斑点印迹法检测其表达。结果：Ag85B-MPT64融合基因经双向DNA序列测定，碱基突变率为0．11％(2／1707)，突变为无意义突变；重组质粒转染COS-7细胞后经检测证实，该融合基因能在真核细胞中表达。结论：成功地构建了Ag85B-MPT64融合基因并在真核细胞中表达，融合蛋白具有良好的抗原性。     

结核杆菌抗原Ag85A基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的:将结核分枝杆菌Ag85A抗原基因克隆并在大肠杆菌中表达.方法:用PCR方法从结核分枝杆菌基因组中扩增Ag85A抗原基因,然后将其插入到原核表达载体pGEX5T中,构建成pGEX5T-Ag85A重组质粒.经IPTG诱导使该基因在E.coli k802菌中表达,亲和层析法纯化蛋白,Western印迹法验证表达蛋白的抗原性.结果:扩增出了约0.9 kb的单一条带,并成功地构建了pGEX5T-Ag85A重组子;经IPTG诱导后,Ag85A蛋白在k802菌中获得了表达,表达的蛋白条带大小约58 000,与预期结果相符;纯化后获得了较单一的蛋白条带.蛋白纯化前后均可被结核病患者血清特异地识别.结论:成功地克隆了Ag85A抗原基因,并将其在大肠杆菌中进行了表达、纯化,为将其应用于结核病诊断和防治的研究奠定了基础.     

结核分枝杆菌MPT64真核表达质粒的构建及其表达

目的：构建结核分枝杆菌MPT64真核表达质粒，并在真核细胞中表达。方法：从H37Rv基因组中扩增出MPT64基因，经限制性内切酶消化后，定向插入pcDNA3.1( ）中，用脂质体法将pcDNA-MPT64转染COS-7细胞。采用RT-PCR、ELISA和斑点印迹法检测其表达。结果：扩增出的MPT64基因正确插入pcDNA3.1中，DNA序列测定无突变产生。重组质粒在COS-7细胞中表达MPT64。结论：成功地构建了pcDNA-MPT64质粒，其真核表达的蛋白具有良好的抗原性，为进一步研究MPT64在抗结核菌感染中的预防作用奠定了基础。     

结核分枝杆菌Ag85BmRNA在脊柱结核病灶中的检测和临床意义

目的探讨逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）在脊柱结核临床诊治中的应用价值,从病原学角度出发探讨脊柱结核手术病灶的切除范围。方法用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测25例脊柱结核患者病灶硬化壁、硬化壁外“亚正常骨”以及干酪样坏死组织中的结核分枝杆菌Ag85BmRNA。结果干酪样坏死组织、硬化骨组织、亚正常骨组织Ag85BmRNA检测阳性率分别76％（19／25）、64％（16／25）、28％（7／25）,组间差异有统计学意义（P〈0．05）,平均报告时间2d。结论（1）逆转录聚合酶链反应检测脊柱结核病灶中结核分枝杆菌,具有快速、灵敏、特异性高等特点;（2）脊柱结核病灶硬化壁中存留具有生物活性的结核菌;（3）亚正常骨组织应根据具体情况并结合影像资料判断切除范围。     

结核分枝杆菌Ag85B与MPT64真核共表达质粒的构建及表达

目的:构建结核分枝杆菌Ag85B和MPT64编码基因的共表达载体pBud85B-MPT.方法:将结核分枝杆菌Ag85B、MPT64基因同时克隆进多启动子共表达载体pBudCE4.1中,得到真核共表达质粒pBud85B-MPT;将pBud85B-MPT转染COS-7细胞,通过RT-PCR方法检测目的基因的表达.结果:在COS-7细胞中同时检测到Ag85B、MPT64的表达.结论:pBud85B-MPT共表达质粒构建成功,为进一步研究新型结核病疫苗奠定基础.