甲基丙烯酸环氧丙酯致人支气管上皮细胞恶性转化过程中DNMT1及MBD1基因表达的变化

目的：分析甲基丙烯酸环氧丙酯（glycidyl methacrylate,GMA）致人支气管上皮16HBE细胞恶性转化过程中不同时点甲基化转移酶及甲基CpG结合蛋白家族基因的表达差异,初步探讨GMA诱导16HBE细胞发生恶性转化的表观遗传机制。方法：采用人类全基因组表达谱芯片筛选GMA诱导16HBE细胞恶性转化过程中甲基化转移酶及甲基CpG结合蛋白家族的差异表达基因,并采用实时定量PCR（Real time PCR）技术检测筛选所得差异基因DNMT1及MBD1 mRNA的表达情况。结果：芯片结果显示在转化第10代（前期）细胞中DNMT1及MBD1基因较同代龄对照细胞表达上调,实时定量PCR进一步确证DNMT1及MBD1基因表达分别上调80.60%、79.10%,与芯片结果一致。结论：甲基化可能是GMA致16HBE细胞发生恶性转化的一种机制,DNMT1及MBD1基因可能是多个甲基化相关基因转录表达下调的关键调控点,其在GMA致16HBE细胞恶性转化过程中起着重要作用。     

G6PD缺陷对 1,4-苯醌致K562细胞DNA甲基化的影响及其机制

目的：研究G6PD缺陷对1,4-苯醌（1,4-BQ）致K562细胞DNA甲基化的影响及其机制。方法：分别采用10和20 μmol/L的1,4-BQ溶液对G6PD缺陷K562细胞和正常表达细胞进行染毒,以未染毒组为对照,各组均设置12、24、48 h共3个染毒时间,另在20 μmol/L 1,4-BQ染毒组细胞中加入1.5 mmol/L谷胱甘肽（GSH）进行干预。采用比色法检测全基因组DNA甲基化相对水平,qPCR法检测甲基转移酶DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA表达水平,Western blot法检测DNMT1、DNMT3a蛋白表达水平。结果：10和20 μmol/L 1,4-BQ染毒后的K562细胞全基因组DNA甲基化水平升高（P<0.05）,除20 μmol/L 1,4-BQ染毒48 h组外,其他各染毒组的G6PD缺陷K562细胞全基因组DNA甲基化水平均高于正常细胞（P<0.05）。在1,4-BQ染毒后,G6PD缺陷细胞的DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA水平以及DNMT1、DNMT3a蛋白表达水平均高于正常细胞（P<0.05）。加入GSH后,G6PD缺陷细胞和正常细胞的全基因组DNA甲基化相对水平、DNMTs mRNA及蛋白表达水平的差异的无统计学意义（P均>0.05）。结论：G6PD缺陷可能以抑制K562细胞GSH合成的方式增加氧化应激水平,最终导致细胞DNMTs生成的增多以及全基因组DNA甲基化程度的升高。     

甲醛对人Ⅱ型肺泡上皮细胞DNA氧化和甲基化水平的影响

目的：分析甲醛染毒对体外培养的人Ⅱ型肺泡上皮细胞(A549)内8-羟基鸟嘌呤脱氧核苷(8-oxo-dG)水平、DNA5-甲基胞嘧啶(5-mC)含量的影响及其时间-效应和剂量-效应关系，探讨甲醛所致的细胞DNA氧化与DNA甲基化的关联性。方法：用5～20μmol/L甲醛作用于A549细胞，用高压液相色谱串联电化学检测技术分析细胞DNA8-oxo-dG水平，用免疫荧光和高效毛细管电泳法检测细胞全基因组DNA5-mC含量改变。 结果：甲醛染毒提高了细胞8-oxo-dG水平，但是降低了细胞的DNA5-mC含量。甲醛致细胞DNA氧化与DNA甲基化呈现不同特点，A549细胞暴露于20 μmol/L 甲醛后，DNA氧化水平在1周甚至更早时间就已显著增高，而相同条件下DNA 甲基化水平的改变需要6周以上的时间，DNA 甲基化的改变滞后于DNA氧化。 A549细胞经5～20μmol/L甲醛染毒8周后，DNA氧化水平与甲醛剂量呈正相关关系，而同样条件下DNA甲基化水平与甲醛剂量呈负相关关系。 结论：甲醛染毒可提高DNA氧化水平，降低细胞DNA甲基化水平。在甲醛的毒作用效应中，细胞DNA氧化损伤可能是早于其DNA甲基化的一个重要分子事件。     

纳米氧化石墨烯诱导人类支气管上皮细胞DNA氧化与甲基化的实验研究

目的：通过分析体外培养的人类支气管上皮细胞（16HBE）在纳米氧化石墨烯（NGO）染毒后细胞DNA中8-羟基脱氧鸟嘌呤核苷（8-OHdG）和5-甲基胞嘧啶（5-mC）比例的变化规律,探讨DNA氧化与DNA甲基化的关联性。方法：分别以1.25、2.5、5、10 μg/mL的NGO溶液染毒16HBE细胞24 h,采用高效液相色谱串联电化学检测技术分析细胞DNA中8-OHdG比例,高效毛细管电泳（HPCE）法检测细胞全基因组DNA甲基化水平。结果：在2.5、5、10 μg/mL的NGO溶液染毒后,细胞DNA中8-OHdG比例显著高于对照组（P < 0.05或P < 0.01）,以10 μg/mL浓度时为最高。NGO可引起16HBE细胞甲基化程度降低,与对照组细胞相比,2.5、5和10 μg/mL NGO组分别降低37.1%、49.7%和46.3%,与对照组间的差异均有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。DNA氧化水平与DNA甲基化水平间呈负相关（r=-0.69,P < 0.01）。结论：本研究提示,在体外NGO可导致人支气管上皮细胞16HBE的DNA氧化水平升高,DNA甲基化水平降低,我们推测细胞DNA氧化程度可能影响DNA甲基化过程。     

苯并 (a)芘染毒致人支气管上皮细胞和上皮样成纤维细胞周期的变化

目的： 观察苯并 (a)芘[benzo (a)pyrene,BaP]染毒对人支气管上皮细胞 (16HBE)和上皮样肺成纤维细胞 (W138)细胞周期的影响,并探讨其剂量效应和时间效应。方法：以16HBE和W138细胞未处理组为阴性对照组,二甲基亚砜 (DMSO)组为溶剂对照组。分别以不同浓度 (1、2、4、8、16、32 μmol/L)的BaP染毒16HBE和W138细胞,24 h后用流式细胞术检测细胞周期分布情况;分别以16 μmol/L BaP染毒16HBE和W138细胞,作用不同时间后 (1、2、4、8、12、24 h)检测细胞周期分布情况;分别以16 μmol/L BaP染毒16HBE和W138细胞,作用4 h后,再经过不同时段 (0、1、2、4、8、12、24 h)的恢复期后检测细胞周期分布情况。结果：与阴性对照组比较,随着染毒浓度和染毒时间的增加16HBE和W138 细胞S期所占比例均增加 (P<0.05);16 μmol/L BaP染毒16HBE细胞4 h后,经2~12 h的恢复期 (正常条件下培养),S期细胞所占比例与刚染毒后细胞 (32.43%)相比明显增加 (P<0.05),恢复24 h时S期细胞所占比例 (24.52%)与阴性对照组 (26.41%)相比差异无统计学意义 (P>0.05);16 μmol/L BaP染毒W138细胞4 h后恢复0~4 h时S期细胞所占比例与阴性对照组 (32.42%)相比明显增加 (P<0.05),恢复8 h开始减少,24 h时S期细胞所占比例 (32.89%)与阴性对照组 (32.42%)相比差异无统计学意义 (P>0.05)。结论： BaP染毒16HBE和W138细胞引起细胞周期分布变化,主要为S期阻滞,G1期和G2期变化不明显。     

叶酸对1,3-丁二烯诱发的小鼠DNA低甲基化和染色体损伤的影响

目的：探讨叶酸（FA）对1,3-丁二烯（BD）诱发的小鼠遗传损伤和DNA甲基化改变的保护作用。方法：雄性昆明小鼠喂养相应饲料3周建立叶酸正常组（FA-C）、叶酸缺乏组（FA-D）以及叶酸补充组（FA-S）动物模型,每组小鼠18只,再随机分为对照组、BD低剂量和高剂量染毒组（0、13.82、1 382.14 mg/m³）,染毒组小鼠每天吸入染毒6 h,每周5 d,连续染毒2周。采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测小鼠血清中FA浓度和肝组织基因组DNA总体甲基化水平,荧光定量PCR检测DNA甲基转移酶DNMT1和DNMT3a mRNA的表达,胞质分裂阻滞微核试验分析外周血淋巴细胞的染色体损伤。结果：动物喂养3周后,与FA-C组相比,FA-D组血清FA浓度显著降低,FA-S组显著升高。在相同FA处理条件下,随BD染毒剂量升高,小鼠肝组织基因组DNA甲基化水平及甲基转移酶表达出现降低趋势,微核、核质桥及核芽突比率显著升高。在相同BD染毒条件下,与FA-C组比较,FA-D组的DNA甲基化水平和DNMT1、DNMT3a的mRNA表达出现下降趋势,而微核率等染色体损伤出现升高趋势;相反,FA-S组的DNA甲基化水平及DNMT1、DNMT3a的mRNA表达出现升高趋势,染色体损伤出现降低趋势,尤其在高剂量BD染毒条件下,叶酸补充对上述指标的影响均存在显著性差异（P < 0.05或0.01）。结论：BD可诱导小鼠的DNA低甲基化改变及染色体损伤,叶酸缺乏可加重BD所致DNA低甲基化和遗传损伤,而补充叶酸则对BD诱导的甲基化改变和遗传损伤具有保护效应。     

泛素连接酶RING2对苯并[a]芘染毒人支气管上皮细胞周期和P53蛋白表达的影响

目的:探讨泛素连接酶RING2对苯并[a]芘(BaP)染毒人支气管上皮16HBE细胞周期和P53蛋白表达的影响。方法:以16HBE未处理组为阴性对照组,二甲基亚砜(DMSO)组为溶剂对照组,MOCK组为序列对照组。在使用RNA干扰技术降低16HBE细胞泛素连接酶RING2基因表达前后,分别采用不同浓度BaP(1、2、4、8、16、32 μmol/L)染毒24 h;或16 μmol/L BaP染毒不同时间(1、2、4、8、12、24 h)。用流式细胞术检测干扰前后两组细胞周期分布情况,用Western-blot法检测干扰前后两组细胞P53蛋白表达水平。结果:流式细胞术检测结果显示,与阴性对照组比较,16HBE细胞染毒后各浓度和各时点组S期细胞所占的比例均增加(P<0.05),而16HBE(siRNA-RING2)各浓度和各时点组S期细胞所占的比例均下降(P<0.05)。协方差分析显示分组因素(是否进行RNAi)和染毒浓度都对S期细胞比例有影响(P均<0.01),16HBE(siRNA-RING2)细胞组的修正均数(17.09%)比16HBE细胞组(31.55%)明显降低(P<0.01)。分组因素和染毒时间都对S期细胞比例有影响(P均<0.01),16HBE(siRNA-RING2)细胞组的修正均数(13.07%)比16HBE细胞组(28.04%)明显下降(P<0.01)。Western-blot结果显示,与阴性对照组比较,16HBE 细胞染毒后各浓度和各时点组P53的表达水平均增加(P<0.05),而16HBE(siRNA-RING2)细胞除16 μmol/L染毒8 h组外,其余各组P53的表达水平均降低(P<0.05)。协方差分析显示分组因素和染毒浓度都对P53的表达水平有影响,P值分别为0.026和0.028。16HBE(siRNA-RING2)细胞组的修正均数(0.989)比16HBE细胞组(1.375)明显下降(P<0.05);分组因素 和染毒时间都对P53的表达水平有影响,P值分别为0.007和0.035。16HBE(siRNA-RING2)细胞组的修正均数(0.857)比16HBE细胞组(1.541)明显下降(P<0.05)。结论:RING2参与的组蛋白泛素化修饰可能通过影响 P53表达和细胞周期S期的变化来发挥对DNA损伤修复的调控。     

苯并(a)芘染毒致人支气管上皮细胞的周期改变及BPDE-DNA加合物形成

目的:通过观察苯并(a)芘(BaP)染毒致人支气管上皮细胞16HBE细胞周期改变及BPDE-DNA加合物形成的情况,探讨DNA损伤与细胞周期阻滞之间的关系。方法:用不同浓度BaP(0、1、2、4、8、16、32 μmol/L)染毒16HBE细胞24 h,用16 μmol/L BaP染毒16HBE细胞不同时间(0、1、2、4、8、12、24 h)以检测BaP染毒16HBE细胞的剂量和时间效应。再根据上述结果选择16 μmol/L BaP染毒16HBE细胞4 h后,恢复不同时间(0、1、2、4、8、12、24 h),处理结束后采用流式细胞术检测细胞周期分布情况,酶联免疫法和荧光免疫组化法检测BPDE-DNA加合物表达。结果:与正常对照组相比,随着BaP染毒浓度和染毒时间的增加,S期细胞所占比例均增加(P<0.05或P<0.01)。16 μmol/L BaP染毒16HBE细胞4 h后,恢复早期(4~12 h)S期细胞所占比例与恢复0 h相比明显增加(P<0.05),恢复24 h时S期细胞所占比例(24.52%)与恢复0 h相比明显降低(P<0.01),而与正常对照组(26.41%)相比差异无统计学意义(P>0.05)。随着染毒浓度增加和染毒时间延长,16HBE细胞内BPDE-DNA加合物含量逐渐增加,与正常对照组相比差异均有统计学意义(P<0.01),染毒后恢复1 h时BPDE-DNA加合物含量与恢复0 h组相比显著增加(P<0.01),而后随恢复时间延长逐渐下降。回归分析显示BaP染毒后细胞S期所占比例与BPDE-DNA加合物含量符合Cubic方程(R²=0.386,P=0.01)。结论:BaP染毒所致BPDE-DNA加合物的形成与S期阻滞密切相关。     

组蛋白修饰改变在亚砷酸钠毒性效应中的作用研究

目的： 探讨组蛋白H3修饰在亚砷酸钠暴露引起的毒性效应中的作用及其调控机制。方法：在HBE细胞中构建组蛋白H3赖氨酸修饰位点突变的细胞株,用亚砷酸钠作用于细胞,四甲基噻唑蓝(MTT)法检测其细胞毒性;用微核实验检测组蛋白H3K4突变后对亚砷酸钠诱导DNA损伤的影响;用蛋白印迹检测亚砷酸钠对H3K4甲基化蛋白表达的影响并用qRT-PCR筛查了其上游修饰酶mRNA水平的表达。结果：组蛋白修饰缺陷细胞株中,H3K4修饰缺陷后的HBE细胞在1 μmol/L亚砷酸钠染毒作用下细胞活力降低60%左右(P<0.01),且可致HBE细胞双核微核率升高2倍以上(P<0.01);1 μmol/L亚砷酸钠处理HBE细胞可引起H3K4me2/3 蛋白水平升高(P<0.05),同时赖氨酸特异性去甲基化修饰酶1(LSD1)的表达下降(P<0.01)。结论：亚砷酸钠染毒诱导细胞组蛋白修饰发生改变,其中H3K4甲基化修饰水平上调,可能参与砷引发的细胞毒性和遗传毒性过程,其修饰改变可能受到LSD1 的调控。     

5-氮-2'-脱氧胞嘧啶对U266细胞系P16基因去甲基化作用研究

  目的 探讨5-氮-2'-脱氧胞嘧啶（5-Aza-CdR）诱导骨髓瘤细胞系U266 p16基因 DNA 5′CpG岛去甲基化作用及对U266细胞增生的影响。方法 采用巢式甲基特异性PCR法（n-MSP）、DNA序列分析、RT-PCR、细胞生长曲线、流式细胞仪DNA含量分析法检测5-Aza-CdR对U266细胞 p16基因去甲基化作用及其对U266细胞的生长、增生及细胞周期的影响。结果 （1）5-Aza-CdR能够逆转U266细胞 p16 基因异常甲基化；（2）5-Aza-CdR能激活p16基因沉默的再转录；（3）5-Aza-CdR能下调U266细胞甲基转移酶DNMT1、DNMT3A、DNMT3B 的表达并呈浓度依赖性；（4）5-Aza-CdR作用的U266细胞被阻滞于G0 ~ G1期。结论 5-Aza-CdR可能通过抑制甲基转移酶直接对p16 基因去甲基化，逆转U266 细胞DNA 异常甲基化，并有效地激活因高甲基化所致p16基因沉默的再转录     

DNA methylation status of hMLH1, p16(INK4a), and CDH1 is not associated with mRNA expression levels of DNA methyltransferase and DNA demethylase in gastric carcinomas

DNA methyltransferase and DNA demethylase are enzymes potentially affecting promoter methylation status. We examined levels of DNA methyltransferase (DNMT1, DNMT3a, DNMT3b) and DNA demethylase (MBD2) mRNA expression by semi-quantitative RT-PCR. In addition, we examined promoter methylation status of hMLH1, p16(INK4a), and CDH1 by methylation-specific PCR since all three of these genes are reported to be hypermethylated in gastric carcinoma. MBD2 appeared to be down-regulated in neoplasms. The levels of DNMT1, DNMT3a, DNMT3b, and MBD2 mRNA expression were not associated with either tumor stage or histologic type. Promoter hypermethylation of hMLH1, p16(INK4a), and CDH1 was detected in 5/20 (25%), 8/20 (40%) and 8/20 (40%) of gastric carcinomas, respectively. There was no clear relation between DNA methylation status of hMLH1, p16(INK4a), and CDH1 and the mRNA expression levels of DNMT1, DNMT3a, DNMT3b or MBD2. We divided the examined cases into two groups according to the number of hypermethylated genes. Cases with more than two hypermethylated genes comprised a hypermethylation group, and cases with no hypermethylation comprised a non-hypermethylation group. We found no group association for levels of DNMT1, DNMT3a, DNMT3b, and MBD2 mRNA expression. Our results suggest that the mRNA expression levels for pro-methylating (DNMT1, DNMT3a, DNMT3b) and anti-methylating (MBD2) enzymes is not a critical determinate of tumor-specific promoter hypermethylation of hMLH1, p(16INK4a), or CDH1 in gastric carcinoma.     

Expression of methylation-related genes is associated with overall survival in patients with non-small cell lung cancer

The abnormality of DNA methylation is involved in tumour progression, and thus has a modulating effect on clinical outcome of cancer patients. In this study, we measured the mRNA expression levels of three methylation-regulating genes (DNMT1, DNMT3b, and MBD2) in 148 tumour samples from patients with non-small cell lung cancer (NSCLC) using quantitative real-time polymerase chain reaction and then determined their prognostic values. Our data showed that the high level of DNMT1 expression was significantly associated with an increased risk of death in all NSCLC patients (hazard ratio (HR), 1.74; 95% confidence interval (95% CI), 1.04-2.90). However, the high level of DNMT3b expression was significantly associated with poor prognosis only in young patients (<65 years). The high level of MBD2 expression had a significantly reduced risk for death only in male patients and in squamous cell lung carcinoma (SQLC) patients. All three combination groups with DNMT1 and DNMT3b, DNMT1 and MBD2 or DNMT3b and MBD2 revealed significant combined effects in male patients and SQLC patients. Our results suggest that DNMT1, DNMT3b, and MBD2 may play important roles in modulating NSCLC patient survival and thus be useful for identifying NSCLC patients who would benefit most from aggressive therapy.     

DNMT1 and DNMT3b silencing sensitizes human hepatoma cells to TRAIL‐mediated apoptosis via up‐regulation of TRAIL‐R2/DR5 and caspase‐8

DNA methylation plays a critical role in chromatin remodeling and gene expression. DNA methyltransferases (DNMTs) are hypothesized to mediate cellular DNA methylation status and gene expression during mammalian development and in malignant diseases. In this study, we examined the role of DNA methyltransferase 1 (DNMT1) and DNMT3b in cell proliferation and survival of hepatocellular carcinoma (HCC) cells. Gene silencing of both DNMT1 and DNMT3b by targeted siRNA knockdown reduces cell proliferation and sensitizes the cells to tumor necrosis factor‐related apoptosis‐inducing ligand (TRAIL)‐mediated cell death. The proapoptotic protein caspase‐8 demonstrated promoter hypermethylation in HCC cells and was up‐regulated by knockdown of DNMT1 and DNMT3b both at mRNA and protein levels. In addition, death receptor TRAIL‐R2/DR5 (TRAIL receptor 2/death receptor 5) did not exhibit promoter hypermethylation in HCC cells but was also up‐regulated by knockdown of DNMT1 and DNMT3b both at mRNA and protein levels. Consistent with this observation, the combined transfection of DNMT1‐siRNA plus DNMT3b‐siRNA enhanced formation of the TRAIL‐death‐inducing signaling complex formation in HCC cells. In conclusion, our data suggest that DNA methylation of specific genomic regions maintained by DNMT1 and DNMT3b plays a critical role in survival of HCC cells, and a simultaneous knockdown of both DNMT1 and DNMT3b may be a novel anticancer strategy for the treatment of HCC. (Cancer Sci 2010)     

宫颈癌细胞系中HPV16 E6、E7及E6/E7基因对STK31基因甲基化状态及表达的影响

背景与目的：丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶31(serine/threonine kinases 31,STK31)基因在人类多种癌症中扮演重要角色,且STK31基因的表达受其启动子及第一外显子区甲基化状态的影响;病毒感染与肿瘤组织中某些抑癌基因启动子区高甲基化有关。本研究旨在探讨宫颈癌细胞系中HPV16 E6、E7及E6/E7癌基因对STK31基因甲基化状态及表达的影响,以及不同种类甲基转移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)基因在STK31基因甲基化中的潜在作用。方法：构建外源性HPV16 E6、E7以及E6/E7基因共表达慢病毒,分别感染人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)阴性宫颈癌细胞系HT-3及C33A,获得稳定转染的细胞系;采用亚硫酸氢盐基因组测序法(bisulfite genomic sequencing,BGS)和甲基化特异性PCR (methylation-specific PCR,MSP)检测3种HPV阳性宫颈癌细胞系HeLa、SiHa和CasKi以及HPV阴性宫颈癌细胞系HT-3和C33A转染前后STK31基因的甲基化状态;RT-PCR及蛋白［质］印迹法(Western blot)检测上述宫颈癌细胞系中STK31基因的表达以及DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b和DNMT3L基因在HPV16转染前后宫颈癌细胞系及HPV阳性、HPV阴性宫颈癌组织中的表达情况。结果：外源性HPV16 E6、E7以及E6/E7基因可在HPV阴性宫颈癌细胞系中稳定表达。3种HPV阳性细胞系HeLa、SiHa和CasKi中STK31基因呈低甲基化状态,STK31 mRNA及蛋白质表达阳性;2种HPV阴性细胞系HT-3、C33A中STK31基因则表现为高甲基化状态,STK31 mRNA及蛋白质表达缺失;与未感染慢病毒HT-3和C33A细胞系比较,外源性HPV16 E7以及E6/E7表达的HT-3和C33A细胞系STK31基因甲基化程度降低,其mRNA及蛋白质重新表达。DNMT1、DNMT3a和DNMT3b基因在HT-3E6/E7和C33AE6/E7细胞系中mRNA水平分别高于HT-3空载细胞系和C33A空载细胞系,差异有统计学意义(P<0.001)。DNMT1、DNMT3a和DNMT3b基因的mRNA水平在HPV16阳性宫颈癌组织中的表达高于其在HPV阴性宫颈癌组织中的表达,差异有统计学意义(t=5.997,P<0.001;t=6.743,P<0.001;t=7.926,P<0.001)。DNMT2在HT-3E6/E7和C33AE6/E7细胞系中mRNA表达水平分别低于HT-3空载细胞系和C33A空载细胞系,差异有统计学意义(t=7.451,P<0.001;t=2.451,P<0.05);DNMT2基因转录水平在HPV16阳性宫颈癌组织中低于HPV阴性宫颈癌组织(t=9.134,P<0.001)。DNMT3LmRNA表达水平在宫颈癌细胞系转染前后及HPV阴阳性宫颈癌组织中的差异无统计学意义(P>0.05)。结论：HPV感染可导致STK31基因启动子及第1外显子区甲基化状态降低,低甲基化状态促进该基因表达。STK31基因的表达受其启动子及第1外显子区甲基化状态的调控。HPV16 E7、E6/E7基因可能通过影响DNMT2的表达参与调控癌基因STK31基因启动子及第1外显子区甲基化状态。     

DNA methyltransferase expression and DNA hypermethylation in human hepatocellular carcinoma

Aberrant DNA methylation and increased expression of DNA methyltransferases (DNMTs) are features of tumor cells. To investigate roles for DNMTs during hepatocarcinogenesis, we examined DNMT expression at both the mRNA and protein level in hepatocellular carcinomas (HCCs) and paired non-neoplastic liver tissues, along with measuring the DNA methylation status of five tumor suppressor genes. Expression of DNMT1, DNMT3a and DNMT3b mRNA was detected in 33.3, 59.3, and 55.6% of HCCs and 40.7, 22.2, and 0% of non-neoplastic liver tissues, respectively. DNMT1 and DNMT3a were immunoreactive in 100 and 48% of HCCs and 52 and 0% of non-neoplastic liver tissues. The DNMT3a mRNA expression profile showed significant correlation with its immunoreactivity (P=0.022). DNA methylation status of five tumor suppressor genes, HIC-1, p16, RASSF1A, p53, and RB1 was detected in 85.2, 48.1, 44.4, 22.2, and 0% of HCCs, respectively. There was no significant correlation between DNMT mRNA expression and DNA methylation (P>0.05). DNMT immunoreactivity was also not associated with DNA methylation except HIC-1 (P=0.036) and p53 methylation (P=0.009). Despite the lack of correlation between DNA methylation status and DNMT expression, the frequency of hypermethylation of tumor suppressor genes remained relatively high in HCCs, suggesting that regional DNA hypermethylation is involved in hepatocarcinogenesis and that there may be other mechanisms for increasing DNA methylation.     

p63和p73的表达与苯并(a)芘致H1299和16HBE细胞DNA损伤的关系

背景与目的:研究p63与p73的mRNA表达与BaP致人肺腺癌细胞(H1299)和人支气管上皮细胞(16HBE)DNA损伤的关系.材料与方法:分别用不同浓度BaP(8、16、32、64和128 μmol/L)处理H1299和16HBE两种细胞,在4 h和12 h时,使用相应的生化检测试剂盒分别测定细胞裂解液中MDA的水平和SOD、GSH-Px的活性,用qRT-PCR方法测定处理后细胞的p53、p63、p73、mdm2和mdm4的mRNA水平;用Comet实验评价细胞DNA损伤程度.结果:16、32和64 μmol/L BaP处理4 h时,两种细胞MDA水平显著性升高,SOD和GSH-Px活性显著性下降(P<0.05).用BaP处理H1299和16HBE细胞4 h和12 h时均观察到DNA损伤随浓度增加而加重,且呈剂量-效应关系(P<0.01),mdm2、mdm4 mRNA表达水平升高(P<0.01).不过仅在12 h时p53基因mRNA表达水平较对照组显著增加(P<0.01).在4 h和12 h时点,仅在H1299细胞的p63和p73 mRNA表达增加(P<0.05). 结论:在BaP致p53缺失的H1299细胞的DNA损伤中,BaP可能通过不依赖p53信号通路激活了p63和p73 mRNA的表达.