抑制STAT3基因表达对人宫颈癌HeLa细胞定植和侵袭的影响

目的 采用RNA干扰(RNAi)技术抑制人宫颈癌HeLa细胞信号转导及转录活化因子3(STAT3)基因的表达,观察其对HeLa细胞定植和侵袭能力的影响.方法 针对STAT3基因设计并合成编码小干扰RNA(siRNA)的寡核苷酸,克隆入pSilencer2.1-U6-neo质粒中,从而构建针对STAT3基因的短发夹状siRNA真核表达质粒,用脂质体法将其转染人人宫颈癌HeLa细胞.利用RT-PCR技术和Western blot方法分别检测STAT3 mRNA和蛋白表达水平;通过软琼脂克隆形成实验和体外侵袭实验检测HeLa细胞的定植和侵袭能力.结果 针对STAT3基因的短发夹状siRNA真核表达质粒成功转染人宫颈癌HeLa细胞;转染成功的HeLa细胞的STAT3基因mRNA及蛋白表达均下降;HeLa细胞在软琼脂中形成的克隆数和穿透Matrigel膜的细胞数均明显减少.结论 针对STAT3基因的短发夹状siRNA真核表达质粒通过下调STAT3基因表达,抑制宫颈癌细胞的定植和侵袭能力.     

RNA干扰技术抑制smad4基因表达对宫颈癌细胞增殖的影响

目的：探讨用RNA干扰技术下调smad4基因表达对宫颈癌细胞增殖的影响。方法：用DNA重组技术将针对人smad4基因不同部位所设计的三对短发夹状RNA（shorthairpinRNA，shRNA）序列克隆到真核表达质粒pGenesil-1中，构建smad4shRNA表达载体pGenesil—smad4一shRNA1、2、3。脂质体介导转染人宫颈癌细胞株HeLa，经G418筛选抑制smad4表达的稳定细胞克隆。MTT法、克隆形成实验、流式细胞术检测抑制smad4基因对宫颈癌细胞增殖的影响。结果：成功构建分别携带三段shRNA及空载体对照的重组质粒pGenesil—smad4-shRNA1、2、3和pGenesil-con，三种shRNA重组质粒中pGenesil—smad4-shRNA2可明显降低细胞内smad4mRNA及smad4蛋白表达，筛选出的HeLa／shRNA2细胞增殖能力明显增强。结论：应用RNA干扰技术能筛选出特异而高效阻断smad4基因表达及功能的shRNA，smad4基因表达下调能明显促进宫颈癌细胞生长。     

沉默p53的表达对妇科肿瘤细胞系中STAT3的表达影响

[目的]通过siRNA干扰序列沉默p53蛋白的表达,以探讨p53蛋白表达水平的变化对宫颈癌细胞系(HeLa、SiHa、CasKi)、卵巢癌细胞系(HO8910、OVR3)以及子宫内膜癌细胞系HEC-1-A中核转录因子STAT3蛋白的表达影响。[方法]将p53siRNA及阴性对照siRNA通过脂质体分别转染入HeLa、SiHa、CasKi、HO8910、OVR3、HEC-1-A细胞48h后,通过WesternBlot检测STAT3、p-STAT3的表达情况。[结果]通过siRNA沉默上述细胞p53的表达后,发现在HeLa、HO8910以及HEC-1-A中STAT3和p-STAT3的表达明显升高(P<0.05),而在Si-Ha、CasKi以及OVR3细胞中STAT3和p-STAT3的表达无明显变化(P>0.05)。[结论]p53对STAT3的表达调控作用在不同的妇科肿瘤细胞系中作用机制不同。     

沉默B7-H3基因表达对人肝癌细胞侵袭能力的影响

目的 研究靶向沉默B7-H3基因表达对HepG2细胞侵袭能力的影响及可能机制。方法 设计针对B7-H3基因的shRNA沉默质粒,转染HepG2细胞,下调B7-H3的表达。划痕修复实验检测转染前后HepG2细胞移行能力的变化,Transwell实验检测基因沉默对细胞侵袭能力的影响,MST-1法和ELISA凋亡试剂盒分别检测细胞增殖和凋亡水平变化。通过Western blot实验和明胶酶谱实验检测侵袭相关分子MMP-2、MMP-9的表达和活性变化。结果 成功构建B7-H3 shRNA沉默质粒并转染HepG2细胞。与对照质粒转染组和未转染组比较,沉默B7-H3基因表达后,B7-H3 shRNA转染组HepG2细胞的移行（24 h: P=0.001; 48 h: P<0.001; 72 h: P<0.001）和侵袭（P<0.001）能力受到显著抑制,细胞的增殖和凋亡水平没有明显变化（P>0.05）。MMP-2、MMP-9的蛋白表达（MMP-2: P<0.001; MMP-9: P=0.007）和活性（MMP-2: P<0.001; MMP-9: P<0.001）均显著下降。结论 通过B7-H3 shRNA沉默质粒靶向沉默B7-H3的基因表达能抑制HepG2细胞的侵袭能力,其机制可能与抑制MMP-2、MMP-9的表达和活性有关。     

沉默NDRG1基因与三氧化二砷对宫颈癌抑制作用的研究

目的 观察沉默细胞分化相关基因NDRG1在三氧化二砷（As2O3）抑制宫颈癌HeLa细胞生长过程中的作用,探讨As2O3对宫颈癌的抑制作用与NDRG1基因的相关性。方法 构建NDRG1基因的miRNA干扰载体,稳定转染人宫颈癌HeLa细胞,半定量RT-PCR检测转染后HeLa细胞中NDRG1 mRNA的表达;不同浓度As2O3分别作用于转染及未转染HeLa细胞,MTT比色法检测细胞的生长和凋亡情况。结果 半定量RT PCR检测表明,构建NDRG1基因的miRNA干扰载体成功地转染HeLa细胞,并能够有效抑制NDRG1 mRNA表达。As2O3能够抑制转染及未转染HeLa细胞的生长,其抑制作用均呈浓度依赖性（P＜0.05）,且随时间延长,抑制作用亦增强。12.0μmol／L As2O3 作用HeLa细胞72h的细胞抑制率最大,未转染HeLa细胞组为（49.9±0.6）％,转染HeLa细胞组为（43.1±0.8）％;任一浓度As2O3对转染HeLa细胞的抑制作用较未转染HeLa细胞明显减弱（P＜0.05）。结论 沉默NDRG1基因后,As2O3对宫颈癌HeLa细胞生长的抑制作用减弱,表明As2O3对宫颈癌Hela细胞生长的抑制作用与NDRG1基因相关。     

野生型p53对SMMC-7721细胞中POLD1基因的影响

目的探讨野生型p53基因表达对人肝癌细胞SMMC-7721中POLD1基因的影响。方法设计并构建p53特异性小干扰shRNA绿色荧光真核表达质粒（p53-siRNA）和表达EGFP-p53融合蛋白的p53绿色荧光真核增强表达质粒（pEGFP-p53）,通过稳定转染,将表达pEGFP-p53重组质粒、p53-siRNA转染入SMMC-7721细胞;经G418筛选,获得稳定细胞系7721-p53、7721-p53RNAi。通过RT-PCR检测转染后p53、POLD1的mRNA。结果在人肝癌细胞SMMC-7721中,野生型p53高表达组能够抑制POLD1的基因转录（P〈0.001）;而低表达组能够促进POLD1的基因转录（P〈0.001）。结论在人肝癌细胞SMMC-7721中,p53能够调控POLD1的基因转录。     

TTTY10 调控miR-490-3p 通过HMGB1 信号通路对宫颈癌细胞迁移和侵袭的影响

[摘要] 目的：探讨长链非编码RNA（long-chain non-coding RNA,lncRNA）TTTY10 对宫颈癌细胞迁移和侵袭的影响及其对miR-490-3p 及高迁移率族蛋白1（high mobility group box 1, HMGB1）信号通路的调控作用。方法：收集华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院妇产科2013 年8 月至2014 年10 月14 例宫颈癌患者的癌组织及相对应的癌旁组织标本,qPCR检测宫颈癌组织及不同宫颈癌细胞株中TTTY10 表达情况。将编码TTTY10-siRNA 的质粒或空载质粒转染至宫颈癌CasKi 细胞中,qPCR检测质粒TTTY10-siRNA转染宫颈癌细胞的转染效率,Transwell 迁移和侵袭实验检测沉默TTTY10 后宫颈癌细胞迁移和侵袭能力的变化,qPCR检测沉默TTTY10 后miR-490-3p 和HMGB1 mRNA的表达。双荧光素酶报告基因检测miR-490-3p 与HMGB1 的相互作用,Western blotting 检测沉默TTTY10 后HMGB1 信号通路蛋白的表达情况。结果：宫颈癌组织中TTTY10 的表达显著高于癌旁组织,宫颈癌细胞株中TTTY10 的表达显著高于宫颈上皮永生化细胞（P<0.01）;TTTY10-siRNA 质粒可以有效转染进入CasKi细胞内并敲减TTTY10 的表达（P<0.01）,沉默TTTY10 可以抑制宫颈癌CasKi 细胞的迁移和侵袭能力,促进宫颈癌细胞miR-490-3p 的表达和抑制HMGB1 mRNA的表达（P<0.05 或P<0.01）。miR-490-3p 能与HMGB1 mRNA的3′ -UTR特异性结合,沉默TTTY10后HMGB1 信号通路蛋白表达水平下调。结论：TTTY10 可以靶向调节miR-490-3p,并且通过HMGB1 信号通路影响宫颈癌CasKi细胞的迁移和侵袭能力;TTTY10 可作为宫颈癌的诊断标志物和潜在的药物治疗靶点。     

靶向GPR48的shRNA抑制人宫颈癌HeLa细胞的侵袭转移

背景与目的：GPR48受体偶联Gs蛋白介导细胞内信号转导通路,通过调节做管聚合状态和基质金属蛋白酶活性,影响肿瘤细胞的侵袭转移。本研究探讨靶向GPR48的短发夹RNA（shorthairpinRNA,shRNA）对人宫颈癌细胞株HeLa体外侵袭能力及存体转移能力的影响。方法：以人GPR48mRNA编码区中两条不同序列作为RNA十扰靶点,构建靶向GPR48的shRNA真核表达质粒,同时构建不针对任何已知mRNA的阴性shRNA真核表达质粒,分别转染至HeLa细胞,新霉素抗性筛选稳定表达siRNA的转化克隆。采用RT-PCR和Westernblot检测GPR48的表达变化。通过Boyden小室实验以穿过人工基底膜的细胞数量评估HeLa细胞体外侵袭能力的变化：分别将转染和未转染GPR48shRNA的HeLa细胞接种于裸鼠皮下,观察肿瘤生长情况及怖部转移情况。结果：RNA干扰使HeLa细胞GPR48表达下捌80％：与阴性对照组比较,转染靶向GPR48重组质粒的实验组穿膜细胞数显著减少（28．3±1．5和17．6±1．5VS．94．4±15．7,P〈0．01）。裸鼠在体肺转移实验中,与阴性对照组比较,转染靶向GPR48重组质粒的实验组肺转移结节数显著减少（1．3±0．2和1．5±0．4VS．7．8±1．8,P〈0．01）。结论：shRNA真核表达载体能明显抑制HeLa细胞的GPR48表达．有效抑制HeLa细胞的体外侵袭和在体转移。     

靶向VEGF发夹状RNA对宫颈癌HeLa细胞抑制作用的研究

目的:运用RNAi技术下调血管内皮生长因子(VEGF)在HeLa细胞中的表达,观察其对肿瘤细胞凋亡的影响,为人宫颈癌治疗提供理论依据。方法:设计并构建针对VEGF的携带绿色荧光蛋白(GFP)发夹状RNA(shRNA)质粒表达载体(PGPU6/GFP/Neo-shRNA),脂质体法转染HeLa细胞;荧光显微镜观察GFP的表达,并计算转染效率;RT-PCR检测HeLa细胞VEGF的表达,筛选出靶序列;再用流式细胞仪法检测细胞凋亡。结果:构建的PGPU6/GFP/Neo载体成功转入HeLa细胞;转染48h后,HeLa-shVEGF1组HeLa细胞VEGFmRNA表达的抑制率为75.0%;与HeLa组和HeLa-shNC组相比,HeLa-shVEGF1组HeLa细胞凋亡率明显增加,P<0.01。结论:本研究构建的PGPU6-shRNA表达载体携带GFP便于观察细胞的转染情况,且不影响U6启动子的转录,同时有效沉默了VEGF基因,明显增加HeLa细胞的凋亡,为未来肿瘤的治疗提供新途径。     

smad4 shRNA 真核表达质粒的构建及鉴定

 目的 针对smad4基因的不同部位,构建不同smad4shRNA表达质粒载体,在转录后水平抑制smad4的表达,对其克隆进行鉴定并挑选出抑制效率最高的克隆。方法 用DNA重组技术将针对人smad4基因不同部位所设计的3对shRNA序列克隆到真核表达质粒pGenesil-1中,构建smad4shRNA表达载体pGenesil-smad4-shRNA1、2、3。脂质体介导转染人宫颈癌细胞株HeLa,经G418筛选抑制smad4表达的稳定细胞克隆。结果 3个smad4shRNA表达载体pGenesil-smad4-shRNA1、2、3经限制性酶切及序列分析证明基因插入正确。RT-PCR、Westernblotting均证实：3种shRNA重组质粒中pGenesil-smad4-shRNA2可明显降低细胞内smad4mRNA丰度及smad4蛋白表达。结论 成功构建了smad4shRNA表达载体pGenesil-smad4-shRNA1、2、3,并筛选出特异而高效地阻断smad4表达的克隆。此实验结果为进一步研究smad4蛋白分子的生物学功能及应用奠定了基础。     

慢病毒介导的TPX2基因沉默对人宫颈癌HeLa细胞系增殖、迁移和细胞周期的影响及机制

目的：研究慢病毒介导的TPX2基因沉默对人宫颈癌HeLa细胞系增殖、迁移和细胞周期的影响及其机制。方法：构建4种靶向TPX2基因的慢病毒表达载体（LV-TPX2-shRNA-1/2/3/4）,同时构建阴性对照质粒,将5种质粒分别转染到293T细胞中制备慢病毒。慢病毒感染宫颈癌HeLa细胞后,实时荧光定量PCR和Western blot分别检测TPX2 mRNA和蛋白的沉默效果。选择沉默效果最佳的重组慢病毒进行后续功能实验。分别采用CCK-8法、Transwell迁移实验及流式细胞术检测各组细胞的增殖、迁移及细胞周期分布情况。Western blot检测TPX2-shRNA转染前后Ki-67、cyclin B2、Aurora-A及P53的表达。结果：与对照组比较,构建的靶向TPX2基因的RNA干扰慢病毒载体均可持续稳定的抑制HeLa细胞TPX2基因的表达,尤其以LV-TPX2-shRNA-1最为明显（P < 0.01）,故选择LV-TPX2-shRNA-1进行后续实验。与对照组比较,沉默TPX2基因的表达能降低HeLa细胞增殖及迁移能力（P < 0.05）,使G2及S期细胞比例明显增加（P < 0.05）,且上调P53蛋白的表达水平,下调Ki-67、cyclin B2及Aurora-A蛋白的表达水平（P均 < 0.05）。结论：沉默TPX2基因蛋白表达能抑制宫颈癌细胞的增殖及迁移能力,可能与其改变细胞周期分布及下调Ki-67、cyclin B2、Aurora-A蛋白表达水平,上调P53蛋白表达水平有关。     

干扰组蛋白赖氨酸甲基转移酶SET8对肾透明细胞癌786-O细胞增殖的影响

目的 细胞增殖是影响肾细胞癌进展的重要因素,本研究旨在探讨组蛋白赖氨酸甲基转移酶SET8在调节肾透明细胞癌786-O细胞增殖中的作用.方法 将体外培养肾透明细胞癌786-O细胞随机分为空白对照组、空质粒组和SET8-shRNA组3组.采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测3组细胞的增殖能力;RT-PCR和蛋白质印迹法检测3组细胞Survivin和Caspase-3的表达水平,分析干扰SET8对肾透明细胞癌786-O细胞增殖及相关基因和蛋白表达的影响.结果 shRNA-SET8可成功抑制786-O细胞中SET8蛋白的表达.MTT检测结果显示,0、12、24、36和48 h SET8-shRNA组增殖抑制率分别为(10.97±2.68)%、(20.38±7.12)%、(25.03±7.60)%、(30.35±1.97)%和(31.33±1.04)%,SET8-shRNA组786-O细胞的增殖能力较空白对照组和空质粒组明显降低,P<0.05.RT-PCR和蛋白质印迹法结果显示,SET8-shRNA组Survivin mRNA相对表达量为0.257±0.024,较空白对照组(1.046±0.041)和空质粒组(0.994±0.018)明显下降(P<0.05),其蛋白的相对表达量为0.834±0.072,较空白对照组(0.951±0.047)和空质粒组(1.203±0.092)明显下降,P<0.05;而Caspase-3 mRNA的相对表达量为0.921±0.072,较空白对照组(0.421±0.022)和空质粒组(0.439±0.007)明显上升(P<0.05),蛋白的相对表达量为1.188±0.022,较空白对照组(0.541±0.060)和空质粒组(0.617±0.028)明显上升,P<0.05.结论 干扰SET8可以有效抑制肾透明细胞癌786-O细胞SET8蛋白表达,从而抑制Survivin和上调Caspase-3的表达而抑制肾透明细胞癌786-O细胞增殖能力.     

胶质瘤细胞中IL-1RAP的作用及其与STAT3的关系

目的 研究白介素1受体辅助蛋白（IL-1RAP）在胶质瘤中的作用及其与转录活化因子3（STAT3）的关系。方法 构建IL-1RAP表达载体,转染胶质瘤细胞系U251,利用流式±细胞仪检测转染IL-1RAP对U251细胞周期及凋亡影响。利用免疫共沉淀钓取STAT3,检测转染IL-1RAP后STAT3的表达情况,并利用免疫荧光方法检测IL-1RAP与STAT3的共定位情况。结果 IL-1RAP蛋白定位于胶质瘤细胞核。与转染空质粒对照组相比,IL-1RAP有明显的促进肿瘤细胞凋亡[(52.10±5.51)% vs.(7.57± 0.54)%, P＜0.05]和周期阻滞作用[(68.22±1.96)% vs.(38.31±7.22)%, P＜0.05]。通过免疫共沉淀和共定位证实IL-1RAP和STAT3可以相互作用。结论 IL-1RAP有抑制胶质瘤细胞增殖、促进细胞凋亡的作用。IL-1RAP可能通过与STAT3相互作用进入细胞核发挥促进细胞凋亡和抑制细胞周期的作用。     

稳定转染PGRMC1基因的小分子干扰RNA对卵巢癌细胞体外增殖的影响

摘要：目的观察稳定转染PGRMC1基因的小分子干扰RNA(siRNA)对卵巢癌COC1细胞体外增殖的影响。方法实验分为3组,重组载体组即由pcDNA3.1A- PGRMC1质粒转染COC1细胞;空载体组即仅转染空载体pcDNA3.1A质粒;空白组即未转染质粒组。3组均经抗性筛选获得稳定转染的细胞系。采用RT-PCR技术检测3组细胞中PGRMC1 mRNA的表达;四甲基偶氮唑盐比色法观察细胞增殖情况,绘制细胞生长曲线;裸鼠接种3组细胞后观察其成瘤能力的变化。结果（1）重组载体组细胞中PGRMC1 mRNA转染前、后的表达水平分别为(79.6±2.3)%和（29.4±1.6）%,两者比较,差异有统计学意义（P<0.05）;空载体组和空白组PGRMC1 mRNA转染前、后表达水平分别比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。（2）重组载体组COC1细胞增殖速度明显慢于空载体组和空白对照组（P<0.05）;（3）接种转染后的COC1细胞后,重组载体组裸鼠的成瘤时间为（5.8±0.7）d,明显短于空载体组的（11.9±0.5）d和空白对照组的（12.6±0.9）d,差异均有统计学意义（P<0.05）;而空载体组与空白对照组比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。接种5周后,重组载体组裸鼠的肿瘤重量和体积分别为（0.7±0.4）g和（197±26） mm³,明显低于空载体组[（2.3±0.4）g和（785±38）mm³ ]和空白对照组为[（2.5±0.8） g和（896±22） mm³ ],差异均有统计学意义（P<0.05）。结论PGRMC1 siRNA可显著降低卵巢癌细胞中的PGRMC1 表达,并对卵巢癌细胞的生长有抑制作用。     

STAT1基因对胶质瘤细胞系U251细胞周期的影响及其机制

 目的 探讨信号转导与转录激活因子1（STAT1）对胶质瘤细胞系U251细胞周期的影响及其机制。方法 利用LipofectamineTM2000转染试剂体外瞬时将pcDNA3.1-STAT1转染入胶质瘤细胞系U251，将细胞分为Mock组（无转染）、空载组（转染pcDNA3.1）和STAT1组（转染pcDNA3.1-STAT1），采用Western blot法检测胶质瘤U251细胞中STAT1表达水平，MTT法检测转染STAT1的U251细胞增殖活性，流式细胞仪检测细胞周期指标，划痕实验检测细胞迁移指标，通过Western blot法检测转染细胞中P53、P21、bcl-2、Caspase-8的表达水平及变化趋势。结果 与Mock和空载组相比，STAT1组中STAT1蛋白表达量明显增高（P<0.05），细胞增殖明显减慢（P<0.05），G₀/G₁期细胞比例明显升高，细胞的迁移能力明显下降； P53、P21、Caspase-8表达明显增强（P<0.05），bcl-2表达明显减弱（P<0.05）。结论 高表达的STAT1对人脑胶质瘤U251细胞具有抑制增殖或促进凋亡的作用，并且STAT1可调控多分子信号转导通路，对脑胶质瘤的发生和发展起到了关键的作用。     

黄芩素对HT-29细胞增殖、迁移的影响及相关机制研究

目的 探讨黄芩素对结肠癌HT-29细胞增殖、迁移能力的影响。方法 MTT法观察黄芩素（5、10、20、40、80 μg／ml）对HT-29细胞的增殖抑制作用,Transwell试验评价黄芩素（80 μg／ml）对HT-29细胞迁移能力的抑制作用,Western blotting检测黄芩素（20、40 μg／ml）对HT-29细胞中信号转导与转录激活因子3（STAT3）、核因子（NF）-κB和p53蛋白表达的影响。同时以未加黄芩素为对照组。结果 与对照组比较,黄芩素对细胞增殖能力有抑制作用,增殖抑制率随浓度升高而增加,差异均有统计学意义（P＜0.05）;黄芩素处理后的细胞迁移能力及STAT3和NF-κB蛋白水平均降低,p53蛋白水平升高,与对照组的差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论 黄芩素可显著抑制HT-29细胞的增殖、迁移能力,可能与上调细胞中p53、降低STAT3和NF-κB蛋白的表达有关。     

GBX2过表达促进人宫颈癌SiHa细胞增殖、迁移及侵袭

[摘要] 目的：探讨GBX2 基因在人宫颈癌SiHa 细胞增殖和侵袭转移中的作用及其机制。方法：应用质粒转染技术,分别将过表达GBX2 基因重组质粒pCMV6-entry-GBX2（实验组）及空载体质粒pCMV6-entry（阴性对照组）转染到宫颈癌SiHa 细胞中,用WST-1 法、集落形成实验、流式细胞术分别检测转染细胞的增殖、集落形成和细胞周期,用划痕愈合实验、Transwell 实验检测细胞的迁移、侵袭能力,用ELISA 法检测细胞培养上清中IL-6 的表达水平,用WB检测EMT相关蛋白的表达变化并探讨其可能的作用机制。结果：与SiHa/pCMV6 组相比,上调GBX2 表达后：（1）SiHa/GBX2 组细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭能力明显增强（均P<0.01）,G0/G1 期的细胞比例减少、S期与G2/M期的细胞比例增加（均P<0.01）;（2）SiHa/GBX2 组细胞EMT相关蛋白上皮钙黏蛋白表达水平下降,神经钙黏蛋白、波形蛋白和snail 表达水平上调（均P<0.01）;（3）SiHa/GBX2 组细胞培养上清中IL-6 的表达水平明显增高（P<0.01）;（4）SiHa/GBX2 组细胞STAT3 磷酸化水平增强,并能被STAT3 抑制剂S31-201 抑制（P<0.01）。结论：GBX2可能通过IL-6/STAT3 通路诱导宫颈癌SiHa 细胞EMT,从而促进宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。     

长链非编码RNA MEG3靶向Rac1抑制宫颈癌细胞增殖、迁移的实验研究

目的 检测长链非编码RNA MEG3在宫颈癌细胞中的表达，检测MEG3表达对HeLa细胞增殖、迁移的影响及可能分子机制。方法 采用荧光定量PCR（QPCR）检测正常宫颈上皮细胞HcerEpic和宫颈癌细胞系C-33A、C4-1、Caski、SiHa和HeLa中MEG3的表达； MEG3过表达质粒（MEG3）、阴性对照质粒（NC组）、MEG3+Rac1过表达质粒（MEG3+Rac1组）分别转染HeLa细胞，MTT法检测细胞增殖情况， Transwell实验检测细胞迁移能力，Western blotting检测PCNA、E-cadenin、N-cadenin、Vimentin、Rac1 蛋白表达。结果 QPCR结果显示，C-33A、C4-1、Caski、SiHa和HeLa细胞中MEG3表达水平分别为0.37±0.044、0.65±0.075、0.41±0.071、0.71±0.053和0.42±0.081，均低于HcerEpic细胞的1.02±0.064，差异具有统计学意义（P＜0.05）。MTT法结果显示MEG3组HeLa细胞增殖活力显著低于NC组； MEG3组的迁移细胞数为385±14，显著低于NC组的594±16（P＜0.05）；与NC组比较，MEG3组PCNA、N-cadenin和Vimentin表达下调，E-cadenin表达上调。与MEG3组比较，MEG3+Rac1组显著上调Rac1蛋白表达，上调HeLa细胞增殖活力，增加迁移细胞数。结论 LncRNA MEG3可能通过靶向Rac1信号通路抑制宫颈癌细胞增殖、迁移。     

siRNA敲减DNMT1表达对T-cadherin基因甲基化及结肠癌细胞生物学行为的影响

目的 肿瘤的发生、发展和侵袭转移是影响结肠癌治疗的重要原因,有研究发现DNA甲基化状态在肿瘤的发生、发展中起着重要作用,抑制T-cadherin表达可增强肿瘤细胞侵袭和迁移能力.本研究探讨siRNA敲减DNA甲基转移酶1(DNA methyl transferase 1,DNMT1)基因表达对结肠癌细胞T-cadherin基因甲基化及细胞生物学行为影响.方法 设计针对DNMT1的siRNA1、siRNA2和siRNA3重组质粒,分别转染HT-29、SW620和HCT116细胞系,采用实时荧光定量PCR检测DNMT1表达,以筛选敲减效率最高的DNMT1 siRNA和细胞系.用敲减效率最高的DNMT1 siRNA转染相应细胞系,采用甲基化特异性PCR检测T-cadherin甲基化水平,采用实时荧光定量PCR和蛋白印迹法检测T-cadherin表达.用敲减效率最高的DNMT1 siRNA转染相应细胞系,采用噻唑蓝比色法、流式细胞术、Transwell和细胞划痕实验检测细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移情况,观察敲减DNMT1对细胞生物学行为的影响;同时设置T-cadherin shRNA重组质粒转染组,观察同时敲减DNMT1和T-cadherin对细胞生物学行为的影响.结果 DNMT1 siRNA1重组质粒对HT-29细胞系DNMT1的敲减效果最好.DNMT1 siRNA1转染HT-29细胞后,DNMT1组T-cadherin基因甲基化水平明显低于空质粒组和空白组,DNMT1组与空质粒组(F=314.182)和空白组(F=283.625)差异有统计学意义,均P<0.001.DNMT1组和联合组DNMT1 mRNA表达量(0.27±0.08)和蛋白表达量(0.41±0.12)显著低于空质粒组和空白组.其中mRNA表达,DNMT1组与空质粒组(F=544.581)和空白组(F=525.811)组差异有统计学意义,均P<0.001;联合组与空质粒组(F=507.501)和空白组(F=494.958)也差异有统计学意义,均P<0.001.蛋白表达量,DNMT1组与空质粒组(F=217.550)和空白组(F=275.469)差异有统计学意义,均P<0.001:联合组与空质粒组(F=321.707)和空白组(F=407.225)也差异有统计学意义,均P<0.001:而DNMT1组和联合组比较mRNA(F=0.002,P=0.965)和蛋白表达量(F=0.811,P=0.394)均差异无统计学意义.DNMT1组T-cadherin mRNA表达量(1.17±0.34)和蛋白表达量(1.38±0.54)显著高于联合组、空质粒组和空白组.其中mRNA表达,DNMT1组与联合组(F=433.103)、空质粒组(F=313.768)、空白组(F=372.118)差异有统计学意义,均P<0.001.对于蛋白表达量,DN-MT1组与联合组(F=89.315)、空质粒组(F=156.745)、空白组(F=196.702)差异有统计学意义,均P<0.001.而联合组与空质粒组(F=1.310,P=0.262;F=0.144,P=0.714)和空白组(F=3.713,P=0.064;F=0.038,P=0.850)的mRNA和蛋白表达量比较差异无统计学意义.与联合组、空质粒组和空白组比较,DNMT1组第24、36、48、72 h的A值显著减小,F组别=14.479,P<0.001;F时间=37.755,P<0.001.DNMT1组与联合组(F=1004.194,P<0.001)、空质粒组(F=1190.815,P<0.001)、空白组(F=781.018,P<0.001)比较细胞总凋亡率显著升高;DNMT1组穿膜细胞数目为(61.3±10.7)个,与联合组(F=86.730,P<0.001)、空质粒组(F=282.962,P<0.001)、空白组(F=152.538,P<0.001)比较显著减少.DNMT1组细胞迁移距离为(235.8±6.3)μm,与联合组(F=2535.55,P<0.001)、空质粒组(F=9767.233,P<0.001)、空白组(F=8420.830,P<0.001)比较显著减少.而联合组与空质粒组和空白组比较,A值、细胞总凋亡率、穿膜细胞数目和细胞迁移距离均差异无统计学意义,P>0.05.结论 DNMT1 siRNA1可有效敲减HT-29细胞DNMT1表达,逆转T-cadherin高甲基化状态并上调其表达.敲减DNMT1可明显抑制HT-29细胞增殖,促进其凋亡,降低其侵袭和迁移能力;而同时敲减T-cadherin能够逆转此种现象,说明敲减DNMT1引起的细胞生物学行为改变可能是通过T-cadherin来实现的.     

lncRNA PVT1沉默对卵巢癌SKOV3细胞增殖、迁移及STAT3通路的影响

目的:研究沉默变异性浆细胞瘤异位1（plasmacytoma heterotopic 1,PVT1）基因对卵巢癌SKOV3细胞增殖、迁移、信号转导及转录活化因子（STATs）3通路的影响。方法:体外培养卵巢癌SKOV3细胞株,设计PVT1 siRNA序列,转染细胞,分为siRNA组、阴性对照组（NC）、空白对照组（BC）,利用qRT-PCR检测各组细胞PVT1相对表达量,利用MTT法检测细胞增殖情况,利用划痕实验检测细胞迁移能力,利用Transwell实验检测细胞侵袭能力,利用WB法检测STAT3通路相关蛋白表达情况。结果:转染后,siRNA3组细胞中PVT1表达水平较BC组与NC组显著降低（P＜0.05）;转染后,与BC组与NC组比较,siRNA3组细胞增殖率较BC组与NC组显著降低（P＜0.05）,迁移、侵袭细胞数显著降低（P＜0.05）,p-STAT3蛋白,MMP2、MMP9、CD44、PCNA蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。结论:沉默PVT1可能抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖、迁移与侵袭,其具体机制可能与STAT3信号通路有关。