致肾盂肾炎大肠埃希菌132基因组DNA消减文库的构建

目的:应用抑制性消减杂交技术,构建致肾盂肾炎大肠埃希菌132株(UPEC132)与已完成基因组测序的非致病性大肠埃希菌标准株MG1655的基因组DNA消减文库。方法:分别提取UPEC132与MG1655的基因组DNA,经RsaⅠ酶切成为大小200～800bp的片段,一部分与接头连接作为tester,和未与接头连接的酶切片段(driver)进行2次消减杂交及2次抑制性PCR后将产物与pMD18-T载体连接构建DNA消减文库,并转化给大肠埃希菌TOP10构建消减文库。结果:文库扩增后得到139个克隆,经PCR法快速测定,均得到200～800bp的插入片段。结论:所构建的基因组DNA消减文库为进一步筛选UPEC132中与致病相关基因奠定了基础。     

化脓性链球菌高毒力株特异基因文库的构建和分析

目的构建化脓性链球菌高毒力株特异基因文库,克隆和筛选化脓性链球菌高毒力株特异表达基因。方法采用抑制消减杂交技术(SSH),以从患者体内所分离链球菌为毒力菌株,分离特异表达基因,将其与T载体进行T/A连接构建文库,将连接产物转化感受态大肠杆菌TOP10进行文库扩增后,转化菌液涂布于LB固体平板,构建化脓性链球菌毒力株特异基因消减文库,用斑点杂交初步筛选消减文库后,将获得的阳性克隆进行测序和同源性分析。结果酶切产物为100～2 000bp,连接效率大于50%,消减组与非消减组差异明显,成功构建了化脓性链球菌毒力株特异基因消减文库,所得阳性克隆经斑点杂交筛选后测序,与Genebank数据库进行同源性比对,5个未知序列可能为新基因,7个与已知基因有高度的同源性。结论用SSH及T/A克隆技术成功构建了人源化脓性链球菌高毒力株基因文库,5个未知的新序列有待于进一步的研究。     

抑制差减杂交技术筛选幽门螺杆菌对甲硝唑耐药相关DNA片段

目的筛选幽门螺杆菌(Hp)临床分离菌株对甲硝唑耐药的相关DNA片段.方法从浙江大学医学院附属邵逸夫医院消化内科就诊患者胃粘膜活检标本中分离培养Hp.采用二倍平皿稀释法确定Hp菌株对甲硝唑的耐药性.分别选取敏感菌和耐药菌各1株,提取其基因组DNA,采用抑制差减杂交技术分别以其中1株作为被检菌,另1株作为参考菌进行基因组差异研究.结果73.8%(31/42)临床分离的Hp菌株对甲硝唑耐药.耐药株共检出10余个大小约在200～1000bp的特异性DNA片段.结论通过抑制差减杂交技术可筛选出耐药株和敏感株各自特异的DNA片段.     

应用抑制消减杂交技术构建耐多药结核杆菌差异表达基因消减cDNA文库

目的：构建结核杆菌耐多药株与敏感株的差异表达消减cDNA文库,进一步探索结核杆菌耐多药的分子机制。方法：以耐多药菌株cDNA为实验组（Tester）,敏感株cDNA为驱动组（Driver）应用抑制消减杂交（Suppression subtractive hybridiza－tion,SSH）技术结合T/A克隆技术构建结核杆菌耐多药株与敏感株的差异表达消减cDNA文库。结果：成功构建了耐多药结核菌株差异表达消减cDNA文库,获得113个差异表达cDNA片段。结论：研究表明SSH技术是筛选新功能基因的有效方法;多种已知或未知基因均参与了结核杆菌耐多药的调节,大规模筛选与克隆这些基因为进一步研究结核杆菌耐多药机制的产生奠定了必要的理论基础。     

应用抑制性消减杂交筛选志贺菌基因转移耐多药相关基因

目的:应用抑制性消减杂交技术初步筛选志贺菌基因转移耐多药相关基因。方法:以志贺菌基因转移耐多药株DNA为检测子,以其敏感株DNA为驱赶子,构建DNA消减文库,采用PCR鉴定及斑点杂交进行筛选,并随机挑取阳性克隆测序,所得结果在GenBank中进行同源性比较和分析。结果:成功构建了志贺菌基因转移耐多药株的特异性DNA消减杂交文库。选取部分阳性克隆进行杂交筛选,其中5个测序成功,与GenBank数据库进行初步比对,3个可能为新基因,2个为已知基因(Tn3926转座子部分的转座酶基因及23SrRNA核糖体核糖核酸)。结论:成功构建了志贺菌基因转移耐多药株的特异性DNA消减杂交文库并获得了其耐多药相关基因,提示转座子介导的耐药机制可能在志贺菌基因转移耐多药中起重要作用。     

传代培养前后内皮细胞差异表达基因消减cDNA文库的构建

目的:构建传代培养前后牛主动脉内皮细胞差异表达基因的消减cDNA文库,筛选动脉粥样硬化相关新基因构建文库. 方法:采用抑制消减杂交技术,以新鲜分离和传代培养的牛主动脉内皮细胞作为对比材料,分离传代培养主动脉内皮细胞中不表达或低表达基因的cDNA片段,将其与T载体进行T/A连接构建文库,将连接产物转化大肠杆菌进行文库扩增后,随机挑取64个白色克隆进行酶切鉴定. 结果:扩增消减cDNA文库获得760个克隆,随机挑取的64个阳性克隆经酶切后均有200～600 bp的插入片段. 结论:构建的传代培养前后内皮细胞差异表达基因消减cDNA文库,为进一步筛选早期发生改变的动脉粥样硬化相关基因奠定了工作基础.     

远缘链球菌6715耐氟菌株与亲代菌株的基因表达差异

目的比较远缘链球菌6715耐氟菌株与亲代菌株的基因表达差异。方法采用逐步诱导法诱导远缘链球菌6715产生耐氟突变株,分别提取耐氟突变株与亲代菌株菌细胞总RNA并分离纯化mRNA,经逆转录获得cDNA后进行抑制性消减杂交(SSH),比较分析两者的基因表达谱;差异片段通过克隆测序并经在线同源性分析(BLAST)获得片段的基因信息。结果经与GenBank的BLAST比对,确证存在两对差异片段,分属结构基因fruA和SMU.438 c。结论应用SSH技术成功构建远缘链球菌6715耐氟菌株与亲代菌株基因差异表达的cDNA消减文库,为深入研究其耐氟机制奠定了基础。     

远缘链球菌6715耐氟菌株与亲代菌株的基因表达差异

目的 比较远缘链球菌6715耐氟菌株与亲代菌株的基因表达差异.方法 采用逐步诱导法诱导远缘链球菌6715产生耐氟突变株,分别提取耐氟突变株与亲代菌株菌细胞总RNA并分离纯化mRNA,经逆转录获得cDNA后进行抑制性消减杂交(SSH),比较分析两者的基因表达谱;差异片段通过克隆测序并经在线同源性分析(BLAST)获得片段的基因信息.结果 经与GenBank的BLAST比对,确证存在两对差异片段,分属结构基因fruA和SMU.438c.结论 应用SSH技术成功构建远缘链球菌6715耐氟菌株与亲代菌株基因差异表达的cDNA消减文库,为深入研究其耐氟机制奠定了基础.     

人膀胱癌异质性表型相关基因的筛选与鉴定

目的 筛选和鉴定膀胱肿瘤异质性生物学表型相关的基因。方法 以已建立的两株同一来源、不同生物学表型的膀胱移行细胞癌细胞系为材料,采用抑制性削减杂交技术筛选差异表达的基因片段,构建cDNA文库;挑取克隆进行筛选,获得差异表达片段,测序并与Genbank比对,Northernblotting验证差异片段在两株细胞系的不同表达。结果 建立了两个消减文库,分别含有168和206个白色克隆,白色克隆含有约200～700bp的插入片段,对这些克隆进行筛选,获得35个差异表达基因片段,其中15个对应于细胞骨架蛋白、细胞代谢酶基因等已知基因,另外19个为未知功能基因,1个为新EST片段,注册Genbank（注册号为DR008207）。结论 抑制性消减杂交技术是筛选、克隆差异表达基因的有效手段;keratin7、Vimentin等细胞骨架蛋白的不同表达,与细胞形态的表型差异有关;DDH等代谢基因的不同。与细胞的药物敏感性差异相关;筛选到的新基因片段为进一步克隆其全长、研究基因功能提供了实验基础。     

高凝状态大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库的构建与初筛

目的构建高凝状态(prothrom botic states,PTS)大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库并进行初步筛选。方法从PTS模型大鼠和对照大鼠肝脏提取po ly A mRNA,分别以po ly A mRNA为模板,依次合成单链和双链cDNA,经酶切成400~600 bp大小的片段。以PTS大鼠cDNA作为T ester,对照大鼠cDNA为D river,进行抑制性消减杂交。将消减杂交第二次PCR产物cDNA克隆至pM D 18-T载体上,然后转化细菌,获得PTS大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库。用巢式PCR扩增法制备“正向”和“反向”消减cDNA探针;采用差异筛选方法,用这两种探针对PTS大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库进行筛选;将获得的阳性克隆cDNA进行序列分析;并与G enB ank DNA数据库中的DNA序列进行同源性分析。结果成功构建了PTS大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库,初步筛选发现两条PTS差异表达cDNA片段。结论成功构建了PTS大鼠肝脏差异表达基因正向消减cDNA文库。     

人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库的构建

目的 构建人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库。方法 采用抑制性消减杂交技术，以胃印戒细胞癌组织为检测子，正常胃黏膜组织为驱动子，分离胃印戒细胞癌组织特异性表达的基因片段，并与T载体连接，构建人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库。结果 成功构建高消减效率的人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库，获得200多个阳性克隆，随机挑取50个克隆鉴定均有长度为100～750bp插入片段。结论应用抑制性消减杂交技术构建人胃印戒细胞癌组织cDNA消减文库，为进一步筛选和克隆人胃印戒细胞癌组织特异性表达基因奠定基础。     

应用抑制性差减杂交技术构建铁皮石斛差减cDNA文库的探讨

【目的】探讨构建铁皮石斛抑制差减文库的方法,为克隆石斛碱生物合成相关功能基因奠定基础。【方法】采用抑制性差减杂交(SSH)技术,分别以4年生和1年生铁皮石斛叶片互补脱氧核糖核酸(cDNA)作为检测子(tester)与驱赶子(driver),将所获得差减cDNA片段克隆入质粒表达载体(Point^TMXa-1 T-Vector),转化大肠杆菌JM109,聚合酶链反应(PCR)扩增鉴定插入片段。【结果】成功地构建了与石斛碱生物合成相关的差减cDNA文库,获得的正、反向差减文库分别含560、220个重组子;插入片段的平均大小为550bp。【结论】所构建的差减cDNA文库适合进一步克隆分析石斛碱相关功能基因研究。     

人乙酰肝素酶基因增强子的初步筛选与鉴定

目的：初步筛选并鉴定出人乙酰肝素酶（ HPSE ）基因内具有增强子（ enhancer , enh ）活性的DNA片段。方法：增加Kpn I、Sal I酶切位点,将含有报告基因增强型绿色荧光蛋白（pEGFP）质粒载体pEGFP-N1改造为pEGFP-MU。选取HPSE基因5′端启动子上、下游的DNA序列并分为10个片段,分别命名为enhx （ x分别等于1、2、3……10）,每段长1200 bp,相邻两段间重复200 bp。分别扩增上述10个片段和猿猴病毒40（SV40）增强子序列,分别插入pEGFP-MU,以构建重组质粒pEGFP-MU-enhx和pEGFP-MU-SV40e,并用脂质体2000转染肝癌细胞BEL-7402、胃癌细胞SGC-7901,荧光显微镜和流式细胞仪分析上述候选序列对启动子（ CMV）转录活性的影响。结果：琼脂糖凝胶电泳和DNA测序结果显示,PCR克隆序列与GeneBank中序列完全一致。酶切电泳和测序结果显示,重组质粒pEGFP-MU-enhx和pEGFP-MU-SV40 e构建符合要求。瞬时细胞转染、荧光显微镜和流式细胞仪分析发现,重组质粒pEGFP-MU-enh6、pEGFP-MU-enh7和pEGFP-MU-enh8在人BEL-7402、SGC-7901细胞中表达增强,与阳性对照质粒pEGFP-MU-SV40e相似,其余重组质粒表达较弱。结论：成功克隆人HPSE基因10个增强子候选序列片段,并正确构建重组质粒pEGFP-MU-enhx;其中第6、7和8候选片段可能具有增强子活性。本研究为后续进一步筛选和鉴定有活性的增强子序列缩小了搜寻范围,并为将来利用HPSE增强子进行肿瘤基因治疗提供了实验依据。     

基层医院多重耐药革兰阴性杆菌血行感染对患者住院结局的影响

目的 探讨多重耐药（MDR）革兰阴性杆菌血行感染与患者住院结局的相关性.方法 回顾分析2011-01-2012-12共254例革兰阴性杆菌血行感染的患者,其中89例为MDR革兰阴性杆菌感染.通过对比感染MDR革兰阴性杆菌和感染非MDR革兰阴性杆菌患者的住院时间、住院费用、ICU住院时间等住院结局相关事件,分析MDR革兰阴性杆菌血行感染与患者住院结局的相关性.结果 （1）感染MDR革兰阴性杆菌患者约占所有患者的35.0％;（2）在感染MDR革兰阴性杆菌的患者中,入院前使用抗生素治疗、合并腹部手术患者比例较高（均P＜0.01）,不恰当使用初始经验性抗生素比例较高（P＜0.01）,入住ICU的比例更高（P＜0.05）;（3）感染MDR革兰阴性杆菌的患者具有较高的30d病死率和较长的ICU住院时间,且抗生素治疗费用明显高于感染非MDR患者（均P＜0.05）;（4）多因素回归分析显示,感染MDR革兰阴性杆菌是患者院内死亡（OR=1.88,95％Cl=1.43～8.33,P=0.022）、较高抗生素治疗费用的独立因素（OR=1.54,95％ Cl=1.11～4.55,P=0.034）.结论 院内感染MDR革兰阴性杆菌使住院患者的病死率升高,增加了患者的住院费用,对患者的住院结局具有不良影响.     

应用抑制消减杂交技术构建哮喘病人嗜酸细胞差异表达基因消减cDNA文库

目的构建哮喘病人治疗前后嗜酸细胞差异表达基因的消减cDNA文库。方法采用新近建立的抑制消减杂交方法,哮喘治疗前后的嗜酸细胞为试验和对比材料,分离哮喘病人嗜酸细胞中差异表达基因的cDNA片段,将其与T载体进行T／A连接构建文库,将连接产物用氯化钙转化法转化大肠杆菌进行文库扩增和蓝白斑筛选,随机挑取100个白色克隆用菌落PCR进行鉴定。结果扩增消减cDNA文库获得3000余个白色阳性克隆,随机挑取100个白色克隆用PCR进行扩增,90％的克隆中均有200～600bp的插入片段,这些片段可能是哮喘嗜酸细胞差异表达基因的cDNA片段。结论用SSH法及T／A克隆技术成功构建了哮喘病人治疗前后嗜酸细胞差异表达基因消减cDNA文库,该消减cDNA文库的建立为进一步筛选、克隆哮喘病人嗜酸细胞差异表达的新基因奠定了基础。     

靶向抑制肝癌耐药细胞多药耐药基因表达的实验研究

目的：构建含多药耐药基因MDR1的短发夹状RNA（shorthairp in RNA,shRNA）表达质粒,并观察其对肝癌耐药细胞Bel-7402/R的MDR1 mRNA的抑制作用。方法：利用分子克隆技术,将含MDR1的双链DNA,与经双酶切后的载体PGE-1连接,构建pshRNA-MDR1重组质粒,在脂质体的介导下转染肝癌耐药细胞株BEL-7402/R,RT-PCR分析MDR1mRNA的表达,流式细胞仪检测细胞P-gp的表达。结果：PCR和DNA测序证实了表达质粒构建成功,并能明显地抑制MDR1mRNA的表达;P-gp的表达阳性率降低了57.3%,P〈0.05。结论：构建的pshRNA-MDR1表达质粒能靶向抵制肝癌耐药细胞MDR1mRNA和P-gp的表达。     

耐青霉素肺炎链球菌的蛋白质组学研究

目的：观察耐青霉素肺炎链球菌异常蛋白表达,探讨其蛋白组学差异与耐青霉素的关系。方法采用次抑菌浓度法将肺炎链球菌国际标准菌株诱导为耐青霉素肺炎链球菌株;双向电泳分离肺炎链球菌标准株和诱导耐药株的全菌蛋白质;Image Master 2D Platinum 5.0软件对电泳图谱进行分析,寻找表达差异蛋白点;对差异蛋白点进行质谱分析。结果成功诱导耐青霉素肺炎链球菌,并建立肺炎链球菌标准株和耐药株的全菌蛋白双向电泳图谱。标准株和耐药株分别分离出约320,350个蛋白点,发现10个差异蛋白。与标准株比较,ABC转运器、触发因子、DNA聚合酶Ⅲ、氨基酸ABC转运和SP表面蛋白A表达量上调,分子伴侣、脂蛋白、果糖二磷酸醛缩酶、α-烯醇化酶和假想蛋白表达量下调。结论耐青霉素肺炎链球菌蛋白表达异常导致的蛋白组学改变可为深入探讨其耐药机制提供新的研究方向。