结核分枝杆菌对人急性白血病单核细胞株THP-1凋亡和死亡水平的影响

目的 通过对不同毒力的结核分枝杆菌感染细胞后的细胞凋亡和死亡程度的检测,以期发现结核分枝杆菌和细胞相互作用的新的方向和观点,以及对结核病免疫学发病机制的新认识.方法 选用不同毒力的结核分枝杆菌H37Ra、H37Rv及北京基因型敏感菌株(BJTB)分别感染人的巨噬细胞THP-1细胞株,模拟细胞体外感染的过程.以流式细胞仪检测细胞凋亡水平,免疫荧光检测细胞的凋亡蛋白的分布,末端脱氧核糖核酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记染色检测细胞晚期凋亡的变化,台盼兰染色检测细胞死亡水平的变化.结果 H37Ra引起THP-1细胞的凋亡水平最高,H37Rv次之,BJTB引起的凋亡水平最低.BJTB引起的死亡水平最高,H37Rv次之,H37Ra最低.结论 毒力不同的结核分枝杆菌刺激细胞后和细胞的相互作用不同,毒力越高引起的凋亡水平越低,毒力越低引起的凋亡水平越高;对死亡水平的影响是毒力越高的结核分枝杆菌引起的死亡水平越高,毒力越低引起的死亡水平越低.     

结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因的克隆与序列分析

目的：克隆结核分枝杆菌减毒株H37Ra培养滤液蛋白10（CFP10）基因,并对其进行序列分析。方法：自结核菌H37Ra株抽提基因组DNA为模板,以已知结核菌H37Ra株CFPIO基因设计引物。通过聚合酶链反应（PCR）技术扩增出结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因,将其克隆至pTG19-T载体后,经PCR和双酶切鉴定后进行DNA序列测定,并以BLAST在线软件进行序列比对分析。结果：PCR产物电泳显示扩增片段约为300bp,测序获得的片段开放编码框由303bp组成,与H37Rv株CFP10基因同源性为100％,推导出编码氨基酸序列同源性为100％。结论：成功克隆结核分枝杆菌H37Ra株CFP10基因,其基因序列与H37Rv株CFPIO基因序列无差异。     

结核分枝杆菌H37 Ra菌株ESAT6基因的克隆及序列分析

目的:从结核分枝杆菌H37Ra菌株克隆早期分泌性抗原靶6(ESAT6)基因并进行序列分析。方法:以结核分枝杆菌H37Ra菌株基因组DNA为模版,用PCR方法扩增ESAT6基因,将扩增产物连接到克隆载体pTG19-T中,并用PCR、单双酶切和测序进行鉴定,以BLAST软件进行序列比对分析。结果:从结核分枝杆菌H37Ra株成功克隆了ESAT6基因,测序表明该片段由288 bp组成,与GenBank所报告的H37Rv基因相比同源性为100%。结论:成功克隆了H37Ra株ESAT6编码基因,其序列与H37Rv标准株ESAT6编码基因完全一致。     

快速检测结核分枝杆菌γpoB基因突变的研究

目的 :应用PCR SSCP技术直接快速检测痰标本中结核分枝杆菌γpoB基因突变 ,评价此方法用于结核分枝杆菌利福平 (RFP)耐药性的意义。方法 :以结核分枝杆菌H37Rv为对照、5 0例耐RFP(单耐和多耐 )结核分枝杆菌临床分离株、12例RFP敏感菌株、35例耐RFP肺结核患者痰标本 ,采用PCR SSCP检测痰标本和菌株中结核杆菌γpoB基因突变。结果 :5 0例耐RFP菌株中有 45例PCR SSCP条带与结核分枝杆菌H37Rv条带有明显差别 ,与药敏试验结果做对比 ,PCR SSCP检测敏感性为 90 % ,特异性为 10 0 % ;12例敏感菌株与H37Rv条带一致 ,35份肺结核病人痰标本 ,2 1份痰PCR扩增阳性 ,15份SSCP图谱与H37Rv图谱有差别 ,而用PCR SSCP 2 8份图谱与H37Rv有差别 ,阳性率为 80 %。结论 :PCR SSCP检测结核分枝杆菌γpoB基因突变快速、简便、易行 ,有望用于结核分枝杆菌RFP耐药性的快速测定 ,并将成为直接检测临床标本中结核分枝杆菌耐RFP快速方法     

间隔区寡核苷酸DNA微阵列分型在结核分枝杆菌检测中的应用

目的 探讨间隔区寡核苷酸DNA微阵列法在结核分枝杆菌基因分型检测中的应用价值.方法 将结核分枝杆菌标准菌株(H37Rv)、卡介苗(BCG)菌株和97株临床结核分枝杆菌株的聚合酶链反应产物分别进行传统Spoligotyping和间隔区寡核苷酸DNA微阵列分型,比较2种方法的一致性,并用H37Rv菌株检测间隔区寡核苷酸DN...     

结核分枝杆菌基因组单核苷酸多态性研究进展

目前,随着结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tuberculosis)H37Rv、CDC1551、H37Ra、F11和KZN1435等菌株全基因组测序工作的完成,以及新一代核酸测序技术的飞速发展,使得结核分枝杆菌研究进入新阶段,即可以从基因组水平对其进行更深入的研究[1~3]。近年来,有许多从基因水平研究结核分     

北京基因型结核分枝杆菌感染THP-1细胞系表达谱的研究

目的通过分析不同结核分枝杆菌感染巨噬细胞后表达谱的改变,探讨结核病(tuberculosis,TB),尤其是北京基因型结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis M.tb)感染的结核病免疫发病机制。方法具有IS6110 DNARFLP和Spoligotyping基因分型结果的265株北京基因型结核分枝杆菌(简称M.tb Beijing genotype)鉴定自2000年中国结核病流行病学抽样调查(简称2000年流调),采用平均连锁方法计算北京基因型结核分枝杆菌中心菌。结核分枝杆菌(M.tb H37Rv)、牛分枝杆菌(M.bovis)标准菌株和M.tb Beijing genotype感染THP-1细胞,采用基因芯片分析其表达谱的改变。结果输入MAS系统,行进一步的分析。结果依据计算原则,相似系数最大为0.514,其对应菌株为结核分枝杆菌北京基因型中心菌株。分枝杆菌感染THP-1细胞后相应的芯片结果具有可靠性和可分析性。M.tb H37Rv、M.bovis、M.tb Beijing genotype感染THP-1细胞的共同表达293个基因。共同表达基因的GO和pathway分析,发现一些不为人特别关注,但对结核免疫有一定作用的信号通路,例如B细胞受体信号通路。M.tb H37Rv、M.tb Beijing genotype感染THP-1细胞差异表达基因包括:tnf,tnfrsf9,pim-1,icam-1和cd48。结论 2000年结核病流调以中国人口为整体,采用分层整群随机抽样。因此获得的M.tb Beijing genotype中心菌株具有中国代表性。293个基因可作为筛选用于菌阴结核病诊断的候选靶标。对这些差异表达基因涉及的信号通路,例如:JAK-STAT信号通路和自然杀伤细胞介导的细胞毒性以及TNF的深入分析,将对理解M.tb Beijing genotype免疫毒性特征有益。     

乙酰丙酸-十二烷基硫酸钠对大肠埃希菌、耻垢分枝杆菌、结核分枝杆菌的杀灭作用研究

目的 研究消毒剂乙酰丙酸-十二烷基硫酸钠(levulinic acid,sodium dodecyl sulfate,LVA-SDS)对大肠埃希菌、耻垢分枝杆菌、结核分枝杆菌标准株H37Rv的杀灭作用.方法 按照2002年版卫生部《消毒技术规范》要求,同时参照美国临床和实验室标准协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI) M07-A9的试验方法,在96微孔板上采用微量培养法和悬液定量杀菌试验,分别检测LVA-SDS的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)和最低杀菌浓度(minimal bactericidal concentration,MBC)以及不同浓度的LVA-SDS对大肠埃希菌、耻垢分枝杆菌、结核分枝杆菌标准株H37Rv的杀灭作用.结果 LVA对大肠埃希菌作用后的MIC值、MBC值均为0.3％LVA,对耻垢分枝杆菌作用后均为0.6％LVA,对结核分枝杆菌标准株H37Rv作用后均为0.075％LVA.LVA-SDS对大肠埃希菌作用后的MIC值、MBC值均为0.3％LVA+0.03％ SDS,而对耻垢分枝杆菌作用后均为0.6％LVA+0.06％SDS,对结核分枝杆菌标准株H37Rv作用后均为0.075％LVA+0.0075％ SDS.一定浓度范围的LVA-SDS随着时间(1～10 min)的延长,对大肠埃希菌、耻垢分枝杆菌的杀灭作用逐渐增强.5％LVA+0.5％SDS作用3 min对大肠埃希菌、耻垢分枝杆菌的杀灭率均达到100％.结论 LVA-SDS对大肠埃希菌、耻垢分枝杆菌、结核分枝杆菌标准株H37Rv均有较好的杀灭作用,具有较强的实际应用前景.     

结核杆菌基因组RD1区毒力蛋白分泌相关基因Rv3871的克隆、表达及生物信息学分析

目的对结核分枝杆菌H37Rv毒株RD1毒力分泌系统Rv3871基因进行克隆和蛋白表达,运用生物信息学分析该基因在结核杆菌毒力蛋白分泌过程中的作用。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,以PCR扩增出完整的Rv3871基因,将其插入原核表达载体pET32a（＋）,对其核苷酸序列进行测定。利用生物信息学软件对结核杆菌Rv3871进行结构功能分析并与多种分枝杆菌进行同源性比对。结果经分子克隆的Rv3871酶切片段与预期大小符合,基因序列与Genbank报道一致,SDS-PAGE检测到相对分子质量为84000的特异性表达蛋白,生物信息学分析发现两个FtsK/SpoEⅢ样结构域,同源性比对则发现在致病性分枝杆菌与卡介苗等非致病菌Rv3971基因对应区域的结构完整程度有较为显著的差别。结论本研究通过对结核分枝杆菌RV3871基因进行分子克隆,特异蛋白表达和基因序列测定,提供了该基因的结构功能特征,并通过生物信息学与同源性对比分析,发现Rv3871基因在致病和非致病分枝杆菌毒力分泌作用中的结构和功能差异,为结核病发病机制阐明及其治疗药靶的筛选提供理论和实验依据。     

乙酰丙酸－十二烷基硫酸钠对结核分枝杆菌的杀灭作用及其安全性毒理学评价

目的 研究消毒剂乙酰丙酸－十二烷基硫酸钠（levulinic acid plus sodium dodecyl sulfate,LVA-SDS）对结核分枝杆菌标准株H37Rv、耐多药结核分枝杆菌临床分离株的杀灭作用;并对LVA-SDS进行安全性毒理学评价。方法 按照2002年版卫生部《消毒技术规范》要求,采用悬液定量杀菌试验和动物实验方法,分别评估LVA-SDS对结核分枝杆菌标准株H37Rv、耐多药结核分枝杆菌临床分离株菌悬液的杀灭作用以及LVA-SDS实际使用时的安全性。结果 20%（体积分数） LVA+2%（质量分数）SDS消毒剂与1 mg/mL的菌悬液作用30 min,对菌悬液内结核分枝杆菌标准株H37Rv或耐多药结核分枝杆菌临床分离株的平均杀灭对数值均>5.00。小鼠急性经口毒性试验结果为半数致死量（median lethal dose, LD₅₀）>5 000 mg/kg,蓄积系数K>5,皮肤刺激反应无红斑和水肿形成,皮肤刺激指数<0.5。结论 LVA-SDS对结核分枝杆菌标准株H37Rv、耐多药结核分枝杆菌临床分离株均有较好的杀灭作用;LVA-SDS属实际无毒级、轻度蓄积毒性作用且对皮肤无刺激性。因此,LVA-SDS是一种安全的、对结核分枝杆菌杀灭作用较好的消毒剂,具有较强的实际应用价值。