人颗粒溶素基因真核表达载体的构建及在肝癌细胞中表达的实验研究

目的： 构建人颗粒溶素（GNLY） 全长编码序列的真核表达载体,转染肿瘤细胞,观察GNLY在细胞内的表达及其对细胞增殖的抑制作用. 方法：用RT-PCR技术获取人GNLY 全长编码序列cDNA,克隆至pGEM-T 载体进行测序,再将克隆片段插入质粒pcDNA3.1（＋）中,构建真核表达载体pcDNA3.1（＋）/GNLY,用阳离子聚合物转染试剂转染肝癌细胞系SMMC-7721,检测目的基因mRNA的表达,WST-8法检测细胞增殖活性. 结果：获得人GNLY全长编码序列cDNA ,并成功构建真核表达载体pcDNA3.1（＋）/GNLY;转染SMMC-7721细胞后,检测出目的基因mRNA的表达;重组质粒转染组与空质粒对照组细胞增殖活性有非常显著性差异（P〈0.01和P〈0.001）,并且随着转染基因浓度的增加,细胞增殖活性逐渐降低,2.0μg/ml pcDNA3.1（＋）/GNLY转染组细胞增殖活性下降至0.329. 结论：pcDNA3.1（＋）/GNLY真核表达载体构建成功,GNLY基因转染对SMMC-7721细胞能产生细胞毒性效应,对肝癌细胞具有一定的杀伤作用.     

人CIDE3基因克隆和真核表达载体构建及促凋亡作用的研究

目的：克隆人诱导细胞死亡的DFF45样效应因子3（CIDE3）全长基因,构建真核表达质粒pcDNA3.1（＋）-CIDE3,并检测其促凋亡作用.方法：①提取人腹部皮下白色脂肪组织的总RNA,经RT-PCR获得CIDE3全长基因,克隆入真核表达载体pcDNA3.1（＋）,构建重组质粒pcDNA3.1（＋）-CIDE3,并进行序列测定.②用脂质体法将pcDNA3.1（＋）-CIDE3转染人宫颈癌细胞系HeLa细胞,通过TUNEL法检测细胞凋亡情况.结果：①经RT-PCR扩增得到特异性717 bp的目的片段,构建的重组质粒pcDNA3.1（＋）-CIDE3经序列测定,结果与Genbank发表的序列完全一致.②转染Hela细胞后,经Tunel染色法检测发现,转染pcDNA3.1（＋）-CIDE3后有大约25%的细胞发生了凋亡,与转染空质粒pcDNA3.1（＋）（＜5%）及未转染质粒的细胞相比,其凋亡细胞明显增多.结论：成功克隆了人CIDE3全长基因,构建了真核表达质粒pcDNA3.1（＋）-CIDE3,并验证了CIDE3基因可诱导细胞发生凋亡的生物学作用,为进一步研究CIDE3的生物学功能奠定了坚实基础.     

MEK1表达载体的构建及其对肝癌细胞ERK通路活性的影响

目的构建pcDNA3.1（＋）-MEK1真核表达载体,体外转染人肝癌MHCC97H细胞,观察MEK1在肝癌细胞中的表达及其对ERK通路活性的影响。方法应用RT-PCR扩增出MEK1基因插入pcDNA3.1（＋）中,形成重组载体pcDNA3.1（＋）-MEK1。经测序确认后,利用LipofectamineTM 2000将重组载体转染MHCC97H肝癌细胞,使用含G418的培养基进行筛选;将肝癌细胞分为不转染组、转染空载体组和转染重组载体组,运用Western-blot方法检测MEK1、p-MEK1、ERK1／2、p-ERK1／2在各组细胞中的表达并绘制各组细胞的生长曲线对比其增殖能力。结果重组载体pcDNA3.1（＋）-MEK1酶切鉴定电泳奈带大小正确,测序结果经Blast比对与人MEK1基因开放性读码框100％吻合;重组载体载体转染肝癌细胞后MEK1表达水平较不转染及转染空载体载体组细胞显著升高,且磷酸化的MEK1及ERK1／2水平也明显升高,转染重组载体载体的肝癌细胞增殖能力得到显著增强。结论成功构建了真核表达载体pcDNA3.1（＋）-MEK1,过表达MEK1蛋白可提高肝癌细胞MAPK／ERK通路活性。     

人乳头瘤病毒16型E2蛋白真核载体的构建与表达

目的构建人乳头瘤病毒16型（HPV16）E2蛋白真核载体,为研究其基因疫苗免疫活性奠定实验基础。方法 PCR扩增HPV16 E2基因片段,将其连接到真核表达载体pcDNA3.1（＋）,双酶切及测序鉴定。将质粒pcDNA3.1（＋）与pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2分别转染HeLa细胞,RT-PCR鉴定E2基因在HeLa细胞中的表达。结果 HPV16 E2基因片段插入到pcDNA3.1（＋）相同酶切位点,即构建了真核表达载体pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2;转染pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2的细胞,检测到HPV16 E2 mRNA。结论构建的真核表达载体pcDNA3.1（＋）/HPV16 E2能在HeLa细胞内有效表达。     

AKR1B10基因过表达载体的构建及其在乳腺癌MCF-7细胞中的表达

目的：构建AKR1B10基因真核表达载体pcDNA3.1(+)-AKR1B10,观察其在乳腺癌MCF-7细胞中的表达,为研究AKR1B10基因与乳腺癌的关系提供实验依据。方法：构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-AKR1B10,将载体瞬时转染乳腺癌MCF-7细胞,利用RT-PCR与Western blotting方法检测未转染的MCF-7细胞、转染pcDNA3.1(+)-AKR1B10的MCF-7细胞和转染空质粒pcDNA3.1(+)的MCF-7细胞中AKR1B10基因的表达。结果：成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-AKR1B10。RT-PCR结果显示,将未转染的MCF-7细胞中AKR1B10基因表达量设定为1,转染质粒的MCF-7细胞中AKR1B10基因表达量为1.79,转染空质粒的MCF-7细胞表达量为0.98,转染表达载体细胞AKR1B10基因表达量与转染空质粒的细胞和未转染的细胞比较,差异有统计学意义（P＜0.05）;Western blotting结果显示,与未转染的MCF-7细胞和转染空质粒的细胞比较,转染表达载体pcDNA3.1(+)-AKR1B10的MCF-7细胞中AKR1B10基因表达量增多。结论：成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-AKR1B10,AKR1B10基因在转染表达载体的MCF-7细胞中高表达。     

过表达Plk-1对gemcitabine诱导的胰腺癌细胞化疗敏感性的影响

目的观察Plk-1基因过表达对gemcitabine诱导胰腺癌细胞AsPC-1化疗敏感性的影响。方法①将携带有人外源性Plk-1基因的真核表达质粒转染AsPC-1细胞系设为处理组,转染空载体设为对照组,无处理组设为空白组,转染24 h后,提取细胞总RNA和总蛋白,利用RT-PCR法及Western blot鉴定AsPC-1细胞内Plk-1基因和蛋白表达水平。②采用流式细胞术检测转染组细胞凋亡的改变。③不同浓度gemcitabine作用于转染细胞,MTT法测定转染48 h后细胞增殖能力。结果①测序结果表明成功的从AsPC-1细胞总RNA中扩增Plk-1基因。RT-PCR结果表明：未转染组AsPC-1细胞组、转染空载体pcDNA3.1组及pcDNA3.1/Plk-1组24 h各组细胞内Plk-1 mRNA相对量分别为（2.14±0.16）、（2.18±0.15）、（2.58±0.18）,转染pcDNA3.1/Plk-1组与其他各组相比,差异有高度统计学意义（P〈0.01）。Western blot结果显示：未转染组AsPC-1细胞组、转染空载体pcDNA3.1及pcDNA3.1/Plk-1组24 h各组细胞内Plk-1基因的蛋白表达水平为（0.989±0.018）、（1.022±0.021）、（1.243±0.143）,转染pcDNA3.1/Plk-1组与其他各组相比,差异有高度统计学意义（P〈0.01）。②在gemcitabine作用下,pcDNA3.1/Plk-1转染组细胞凋亡率明显低于未转染组及空载体转染组,差异有高度统计学意义（P〈0.01）。③AsPC-1/Plk-1转染组细胞的生长抑制率亦明显高于未转染组及空载体转染组,差异有高度统计学意义（P〈0.01）。结论胞浆过表达Plk-1活性分子可明显降低gemcitabine诱导的AsPC-1细胞凋亡,增强其对化疗药物的耐受性。     

人KIAA1173基因的克隆、转染及生物学特性的实验研究

目的建立表达KIAA1173基因的鼻咽癌6-10B细胞模型,并观察转染细胞的生物学活性.方法从新鲜肌肉组织中提取总RNA,采取逆转录PCR得到人KIAA1173基因cDNA.获得的人KIAA1173基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1（＋）,进行酶切和序列鉴定.将重组质粒pcDNA3.1（＋）-KIAA1173和空载体利用阳离子脂质体介导转入鼻咽癌6-10B细胞,经G418筛选阳性克隆.用RT-PCR、原位杂交及免疫细胞化学等方法检测KIAA1173基因在6-10B细胞中的稳定表达情况,并通过MTT法、肿瘤细胞侵袭实验及裸鼠体内成瘤性实验方法,检测KIAA1173基因对鼻咽癌细胞的增殖、侵袭及成瘤能力的影响.以空白质粒转染组作为对照.结果在mRNA和蛋白水平证实,转染细胞内有KIAA1173基因的高表达,表明细胞可表达人KIAA1173基因.6-10B在转染了pcDNA3.1（＋）-KIAA1173后,较转染空载体pcDNA3.1（＋）,肿瘤细胞的增殖能力、侵袭能力及裸鼠体内成瘤能力明显降低（P＜0.05）.结论结果提示KIAA1173基因可能是一鼻咽癌肿瘤抑制基因.获得生物学活性稳定的KIAA1173基因高表达的鼻咽癌细胞模型,为进一步研究奠定了基础.     

VEGF真核表达载体构建及其转染骨髓间充质干细胞的表达

目的 构建大鼠血管内皮细胞生长因子164（vascular endothelial growth factor,VEGF164）真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF164,观察大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)转染pcDNA3.1(-)/VEGF164基因后,外源性基因VEGF在蛋白水平的表达,为其在治疗肺组织损伤中的应用奠定基础。方法 应用DNA重组技术构建VEGF164真核表达载体并鉴定。采用脂质体介导的转染方法将pcDNA3.1(-)/VEGF164转染大鼠MSCs,并设立空质粒对照组（转染pcDNA3.1空载体）、脂质体对照组,用细胞免疫组化和Western blot检测大鼠MSCs 中VEGF164蛋白的表达情况。结果 重组质粒pcDNA3.1(-)/VEGF164测序结果与基因库(GENEBANK)中序列一致。细胞免疫组化检测显示pcDNA3.1(-)/VEGF164转染组MSCs中可见散在黄色颗粒,而空质粒对照组和脂质体对照组均未见明显黄色颗粒出现。Western blot检测pcDNA3.1(-)/VEGF164转染MSCs 72h后, 细胞裂解产物中VEGF含量明显高于空质粒对照组和脂质体对照组。结论 成功构建了大鼠VEGF164真核表达载体,实现VEGF164基因在大鼠MSCs的成功转染,并有外源性基因及蛋白的表达,具有促进肺组织损伤修复的应用前景。     

VEGF真核表达载体构建及其转染骨髓间充质干细胞并鉴定

目的 构建大鼠血管内皮细胞生长因子164（vascular endothelial growth factor,VEGF164）真核表达载体pcDNA3.1(-)/VEGF164,观察大鼠骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)转染pcDNA3.1(-)/VEGF164基因后,外源性基因VEGF在蛋白水平的表达,为其在治疗肺组织损伤中的应用奠定基础。方法 应用DNA重组技术构建VEGF164真核表达载体并鉴定。采用脂质体介导的转染方法将pcDNA3.1(-)/VEGF164转染大鼠MSCs,并设立空质粒对照组（转染pcDNA3.1空载体）、脂质体对照组,用细胞免疫组化和Western blot检测大鼠MSCs 中VEGF164蛋白的表达情况。结果 重组质粒pcDNA3.1(-)/VEGF164测序结果与基因库(GENEBANK)中序列一致。细胞免疫组化检测显示pcDNA3.1(-)/VEGF164转染组MSCs中可见散在黄色颗粒,而空质粒对照组和脂质体对照组均未见明显黄色颗粒出现。Western blot检测pcDNA3.1(-)/VEGF164转染MSCs 72h后, 细胞裂解产物中VEGF含量明显高于空质粒对照组和脂质体对照组。结论 成功构建了大鼠VEGF164真核表达载体,实现VEGF164基因在大鼠MSCs的成功转染,并有外源性基因及蛋白的表达,具有促进肺组织损伤修复的应用前景。     

大鼠SLC7a8基因的克隆及真核表达载体的构建

目的：克隆大鼠左旋氨基酸转运体（SLC7a8）基因cDNA的读码框（CDS）,构建携带SLC7a8基因的重组真核表达载体,为进一步研究其在自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats,SHR）中的功能作准备。方法：从非高血压大鼠（wistar-kyoto,WKY）肾脏组织提取总RNA,通过RT-PCR得到总cDNA,PCR法扩增,产物连接pGEM-T Easy载体测序分析正确后,再以PCR方法扩增,将其连接入真核表达质粒pcDNA3.1（＋）。以PCR、双酶切和测序鉴定正确后,将重组载体pcDNA3.1（＋）-SLC7a8用脂质体包裹转染大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）,RT-PCR法及Western blotting法分别检测转染后SLC7a8 mRNA及蛋白表达水平。结果：成功克隆了大鼠SLC7a8基因cDNA,重组真核表达载体pcDNA3.1（＋）-SLC7a8构建成功,且证实转染后肾小管上皮细胞的SLC7a8 mRNA及蛋白表达均明显高于空白对照组（P〈0.05）及空质粒组（P〈0.05）。结论：成功克隆了SLC7a8基因,并构建了真核表达载体pcDNA3.1（＋）-SLC7a8,能够在NRK-52E细胞中获得有效过表达,这为进一步探讨SLC7a8基因的生物学功能奠定了基础。     

小鼠β防御素2、3融合基因载体构建及其抗流感病毒作用

目的构建mBD2与mBD3融合基因的真核表达载体,检测其在MDCK细胞中的表达情况,并探讨其抗病毒特性。方法利用PCR方法分别扩增mBD2与mBD3基因片段,通过重叠延伸PCR技术（SOE—PCR）将mBD2与mBD3通过一段多肽接头Gly4Ser连接为融合基因mBD2与mBD3。将该融合基因插入真核表达载体pcDNA3．1（＋）获得重组质粒pcDNA3．1（＋）／mBD2-mBD3,经酶切、PCR及测序鉴定正确后,用脂质体转染MDCK细胞,通过免疫荧光检测融合蛋白表达情况,最后采用CCID50测定并分析抗流感病毒作用。结果经鉴定后证实,构建真核表达质粒pcDNA3．1（＋）／mBD2-mBD3正确,该重组质粒能在MDCK细胞中稳定表达,CCID50实验结果说明有较好的抗流感活性。结论本研究成功构建mBD2-mBD3融合基因的真核表达质粒,并证实其融合蛋白能在MDCK细胞中稳定表达,该结果为进一步研究防御素抗病毒机制奠定了坚实的基础。     

人乳头瘤病毒16型E5蛋白真核载体的构建及表达

目的构建人乳头瘤病毒115型（HPV16）E5蛋白真核表达载体pcDNA3．1（＋）／HPV16E5,分析E5在HeLa细胞及BALB／c小鼠肌肉组织中的表达。方法设计HPV16E5基因引物,PCR扩增E5基因。经Bam-HI、EcoR1酶切后将其连接入pcDNA3．1（＋）,PCR及双酶切筛选阳性克隆并测序。将构建的pcDNA3．1（＋）／HPV16E5转染HeLa细胞,利用RT—PCR测定HPV16E5mRNA表达。将6只BALB／c小鼠分为3组,分别取100mgpcDNA3．1（＋）／HPV16E5、100mgpcDNA3．1（＋）、100mLPBS经肌肉注射小鼠,2周1次,共4次;末次接种后第14天取小鼠股四头肌制成石蜡切片,免疫组织化学法检测E5蛋白在小鼠肌肉组织中的表达。结果PCR扩增得到252bpHPV16E5基因片段,DNA测序结果显示E5基因片段正确地连入pcDNA3．1（＋）。构建的pcDNA3．1（＋）／HPV16E5在HeLa细胞表达大小为252bp的HPV16E5mRNA。小鼠股四头肌细胞膜被染成棕黄色。结论构建的真核表达载体pcDNA3．1（＋）／HPV16E5能在HeLa细胞及小鼠肌肉组织中表达HPV16E5蛋白。     

丙型肝炎病毒NS3基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构基因NS3的真核表达载体,并分析其在HeLa细胞中的表达。方法:以HCV全长cDNA质粒为模板进行PCR扩增,获得全长NS3基因,将其插入克隆载体pMD18-T中,鉴定后与真核表达载体pcDNA3.1(+)重组,用脂质体介导法转染HeLa细胞,间接免疫荧光法及Western blot鉴定转染后HCVNS3蛋白的表达。结果:PCR扩增的NS3序列正确,构建的真核表达载体成功转染HeLa细胞,表达的NS3蛋白相对分子量为70kD。结论:成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)/NS3,并在HeLa细胞中获得表达。     

Rap2c基因真核表达质粒的构建与表达

目的：为了探讨Rap2c基因与肺癌发生的关系,克隆人Ras家族小G蛋白Rap2c的cDNA,构建其真核表达质粒并在人肺癌细胞株A549和H1299中表达。方法人骨肉瘤细胞株U2OS提取细胞总RNA,经逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）逆转录成cDNA,PCR扩增Rap2c,酶切后插入pcDNA3．1（＋）构建真核表达质粒 pcD-NA3．1（＋）-Rap2c,采用酶切及测序鉴定。重组质粒转染A 549和H 1299细胞,Western blot 检测其目的基因表达。结果双酶切及测序结果显示重组质粒pcDNA3．1（＋）-Rap2c成功构建,Werstern blot 检测到 A549和H 1299细胞有相应蛋白表达。结论成功构建人Rap2c基因真核表达质粒,为后续研究奠定了基础。     

pcDNA3.1(+)-NRP1真核表达载体的构建与鉴定

[目的]从人角质形成细胞系HaCaT中克隆NRP1(Neuropilin-1)基因全长cDNA,构建含NRP1基因的重组真核表达载体,为下一步的NRP1基因功能研究奠定基础。[方法]采用RT-PCR法从人角质形成细胞系HaCaT中扩增NRP1基因全长cDNA,扩增产物通过TA克隆连接到pMD18-T载体进行测序鉴定,然后通过双酶切将全长cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),最后得到pcDNA3.1(+)-NRP1重组质粒。[结果]成功克隆NRP1基因全长cDNA,并成功构建了pcDNA3.1(+)-NRP1真核表达载体。[结论]pcDNA3.1(+)-NRP1真核表达载体的成功构建可以为NRP1基因功能的进一步研究及其临床基因治疗奠定实验基础。     

mBD1-mBD3融合基因真核表达载体构建及体外抗流感病毒初步研究

目的构建小鼠β防御素1和β-防御素3（mBD1,mBD3）融合基因的真核表达载体,研究mBD1-mBD3融合蛋白的抗流感病毒作用。方法通过RT-PCR和重建PCR方法构建mBD1-mBD3融合基因;经EcoRI和Xho工双酶切后插入相同酶切的pcDNA3．1（＋）,构建成重组质粒pcDNA3．1（＋）／mBD1-mBD3,对重组质粒进行PCR、酶切和测序鉴定;将构建好的真核表达载体转染MDCK细胞,G418筛选稳定表达株,RT—PCR和免疫荧光染色法鉴定胞内mBDl-mBD3的表达。用流感病毒感染稳定表达细胞株,TCID50测定并分析抗流感病毒作用。结果成功克隆到mBD1-mBD3基因,并构建了真核表达载体pcDNA3．1（＋）／mBD1—mBD3。RT—PCR和间接免疫荧光证实重组质粒可以在细胞内表达。实验组的TCID50显著高于对照组,初步显示出mBD1-mBD3的抗流感病毒作用。结论本研究成功构建了pcDNA3．1（＋）／mBD1-mBD3真核表达载体,且能在MDCK细胞中稳定表达,表达产物具有-定的抗流感病毒作用。为进-步深入研究mBDI-mBD3的生物学特性及其抗流感病毒作用机制奠定了基础。     

小鼠β-防御素6与甲型流感病毒M2e基因融合表达及其免疫特性研究

目的构建小鼠β防御素6（mBD6）与甲型流感病毒M2蛋白胞外功能区（M2e）真核表达质粒,并研究其在真核细胞中的表达与免疫特性。方法通过重叠延伸PCR法（overlap-PCR）将M2e与mBD6通过一段多肽接头Gly4Ser融合成为mBD6-M2e。将其插入载体pcDNA3．1（＋）,构建成pcDNA3．1（＋）／mBD6-M2e。鉴定正确后,转染MDCK细胞,免疫荧光、MTT检测mBD6-M2e表达和分泌。免疫小鼠,半定量PCR检测脾细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α、CCR7表达。结果融舍基因mBD6-M2e真核表达载体pcDNA3．1（＋）／mBD6-M2e构建成功,在MDCK细胞膜上成功表达融和蛋白,转染细胞的培养上清刺激淋巴细胞增殖。免疫小鼠细胞因子表达改变。结论融合基因mBD6-M2e真核表达载体成功构建,为研究防御素在流感病毒核酸疫苗中的佐剂作用奠定了基础。     

过表达热休克因子1突变体对RAW264.7细胞的影响

目的建立稳定转染热休克因子1(HSF1)显性正性和显性负性突变体的细胞株,并探讨HSF1突变体过表达对细胞生长的影响。方法用脂质体将真核表达质粒pcDNA3.1(+)-HSF1+和pcDNA3.1(+)-HSF1-分别转染RAW264.7细胞株,G418筛选阳性单克隆,Western blot鉴定高表达的克隆,流式细胞术检测稳定转染HSF1突变体的细胞与转空载体细胞的生长及凋亡情况。结果建立了稳定表达HSF1显性正性或显性负性突变体的细胞株,并发现转染HSF1突变体细胞能影响正常细胞增殖,但不引起细胞凋亡。结论HSF1突变体能影响RAW264.7细胞正常生长周期。     

结核分枝杆菌PPE68基因真核表达载体的构建、表达和鉴定

目的：建立结核分枝杆菌PPE68蛋白基因重组质粒的真核表达载体,为以后对PPE重组蛋白的免疫原性分析奠定基础。方法：提取结核分枝杆菌总DNA,PCR法扩增出PPE68编码基因,通过线性T克隆载体pGEM—T连接,亚克隆至真核表达载体pcDNA3．1（＋）后,转染至I-IeLa细胞中表达,Westernblot鉴定表达产物。结果：PCR产物、pGEM-T—PPE68及pcDNA3．1（＋）一PPE68分别经双酶切后均获得同一大小基因片段,表达产物经Westernblot鉴定相对分子质量约为40000。结论：成功构建了结核分枝杆菌PPE68基因真核表达载体,并获得了表达产物。