RhoC-shRNA对子宫内膜癌细胞RL-952增殖和侵袭能力的作用

目的探讨RhoC-shRNA对子宫内膜癌细胞RL-952生物学行为的影响。方法首先重组RhoC-shRNA表达载体,并以脂质体转染法将之稳定转染入子宫内膜癌细胞RL-952。免疫印迹检测转染RhoC-shR-NA后,观察RL-952细胞中RhoC蛋白表达的变化。继续观察转染前后子宫内膜癌RL-952细胞增殖和侵袭能力的变化。结果测序结果表明成功构建RhoC-shRNA表达载体。将其转染子宫内膜癌细胞后,RhoC蛋白表达水平受到抑制,抑制了肿瘤细胞的增殖、降低肿瘤细胞侵袭力。结论干扰RhoC蛋白的表达可抑制子宫内膜癌细胞RL-952增殖和侵袭能力,本研究为子宫内膜癌的治疗提供了新的思路。     

C-erbB2基因 siRNA 质粒的构建、鉴定及转染

目的 构建人C-erbB2干扰载体pGenesil-erbB2,并稳定转染入CerbB-2高表达的人结肠癌细胞株HT-29细胞,观察其对人结肠癌HT-29细胞从转录后水平对Her-2蛋白表达的影响.方法 利用免疫组化方法筛选出CerbB-2高表达细胞株HT-29,以人C-erbB2cDNA基因为靶标设计RNA干扰片段和阴性对照片段,退火形成双链并克隆进入载体pGenesil-erbB,进行鉴定及测序.并稳定转染至HT-29细胞.结果 测序证明人C-erbB2 siRNA表达载体质粒pGenesil-erbB构建成功,pGenesil-erbB稳定转染入人结肠癌HT-29细胞,采用Western blot实验证明pGenesil-erbB可显著抑制Her-2蛋白的表达.结论 成功构建了人CerhB2干扰载体质粒pGenesil-erbB.稳定转染至结肠癌HT-29细胞株,并能抑制HT-29细胞的Her-2蛋向的表达,为靶向CerbB2的siRNA对结肠癌的放射增敏研究奠定了基础.     

mPEG-CS纳米粒介导livin与survivin小干扰RNA杀伤结肠癌细胞

目的 以mPEG-CS纳米粒作为livin基因和survivin基因的干扰RNA的载体,转染人结肠癌细胞HT-29,观察livin和survivin沉默对结肠癌细胞增殖及凋亡的影响.方法 利用离子交联法,制备粒径约60nm的mPEG-CS纳米粒.利用静电吸附法,以纳米粒混悬液与基因溶液配比为3∶1的条件,构建mPEG-CS-livin shRNA纳米粒、mPEG-CS-survivin shRNA纳米粒以及mPEG-CS-(livin shRNA+surviving shRNA)纳米粒,之后,分别转染进人结肠癌HT-29细胞中.利用RT-PCR和Western Blot分别检测livin、survivin基因和蛋白的表达变化;利用MTT法检测livin、survivin基因表达下调对HT-29细胞增殖的抑制效率;利用Hoechst染色检测livin、survivin基因沉默对HT-29细胞凋亡的诱导.结果 各干扰组均能在mRNA和蛋白水平上有效抑制HT-29细胞中livin、survivin的表达.MTT和Hoechst染色结果显示,联合干扰livin和survivin基因可有效抑制人结肠癌HT-29细胞的增殖,并促进细胞凋亡,且效果均强于单独干扰livin或survivin基因.结论 mPEG-CS纳米粒介导的livin和survivin双基因干扰能有效降低人结肠癌HT-29细胞中livin和survivin基因的表达,抑制HT-29细胞的增殖,并促进HT-29细胞的凋亡,其效果强于单独干扰livin或survivin基因.双基因联合干扰具有协同增强效应.     

纳米基因载体介导RNA干扰沉默Survivin基因对大肠癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨纳米基因载体介导RNA干扰沉默Survivin基因对大肠癌细胞HT-29增殖和凋亡的影响.方法 用壳聚糖-聚乙二醇纳米粒介导的Survivin shRNA(基因纳米复合物)转染结肠癌细胞株HT-29,并以携带相同shRNA的脂质体载体,以及阴性对照shRNA为对照,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测转染后的HT-29细胞中Survivin mRNA的变化,用噻唑蓝(MTT)法检测细胞凋亡率.结果 和脂质体载体比较,转染基因纳米复合物后,HT-29细胞中Survivin mRNA拷贝数及蛋白表达显著降低,其细胞死亡率和凋亡率显著提高(P<0.05).结论 壳聚糖-聚乙二醇纳米粒里介导的Survivin shRNA较之脂质体载体具有更高的干扰效率,且能长期、高效地诱导结肠癌细胞凋亡并抑制其增殖.     

miR-195表达调控对大肠癌细胞HT-29增殖和凋亡的影响及其机制探讨

目的:探讨miR-195对大肠癌细胞HT-29增殖和凋亡的影响及可能的机制。方法:应用脂质体转染的方法,将miR-195 mimics转染入HT-29细胞,q RT-PCR检测转染后miR-195的表达,分别采用CCK-8法及流式细胞术检测细胞增殖和凋亡情况,qRT-PCR和Western blot检测转染后VEGFA mRNA和蛋白表达变化。结果:与NC组比较,miR-195 mimics转染组明显上调HT-29细胞miR-195的表达,抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,下调VEGFA mRNA及蛋白表达,两组比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论:上调HT-29细胞的miR-195表达,可明显抑制细胞增殖、促进细胞凋亡,其机制可能与抑制其靶基因VEGFA表达相关。     

RhoC-siRNA表达载体对肝癌细胞生长速度及侵袭力的影响

目的 构建RhoC-siRNA表达载体,研究其对肝癌细胞生物学行为的影响.方法 构建RhoC-siRNA表达载体,以脂质体转染法将之稳定转染入SK-Hep1肝癌细胞株,Western blot法鉴定转染细胞中RhoC蛋白表达的抑制情况,观察转染前后肝癌细胞形态、生长曲线、黏附、运动及体外侵袭能力的改变.结果 酶切及测序证实RhoC-siRNA真核表达载体构建成功,将之转染入肝癌细胞后,细胞中RhoC蛋白表达水平降低达60%,细胞形态及生长速度无明显改变,但细胞黏附、运动能力及体外侵袭能力均降低.结论 RhoC-siRNA表达载体对肝癌细胞的形态及生长曲线无显著影响,但可抑制其体外侵袭转移能力,可为肝癌的生物学治疗提供新的方法.     

β1整合素反义寡核苷酸对人结肠癌细胞黏附和侵袭抑制作用

目的 研究β1整合素反义寡核苷酸(ASODN)对人结肠癌HT-29细胞侵袭的抑制作用.方法 以脂质体为载体将硫代磷酸修饰的β1整合素ASODN及无义寡核苷酸(NSODN)转染人结肠癌HT-29细胞,通过RT-PCR及Western-Blot试验,分别测定ASODN组、NSODN组和空白对照组β1整合素mRNA和蛋白的表达,MTT法和Transwell小室法分别测定其黏附力和侵袭力.结果 与NSODN组和空白对照组相比较,ASODN 组中β1整合素 mRNA 和蛋白表达强度明显降低;ASODN组和NSODN组转染的人结肠癌HT-29细胞侵袭力均下降,但前者下降较为明显.结论β1整合素ASODN转染HT-29细胞后,通过降低其β1整合素mRNA和蛋白表达水平,从而抑制其对细胞外基质的侵袭.     

鞘氨醇激酶-1调控ERK和NF- κB通路促进HT-29细胞的增殖和侵袭

目的 探讨鞘氨醇激酶-1(Sphk1)对结肠癌HT-29细胞的增殖、凋亡和侵袭转移的影响及其作用机制.方法 采用(12-)十四酸佛波酯(-13-)乙酸盐(PMA)诱导人结肠癌HT-29细胞Sphk1的活化和表达,N,N-二甲基鞘氨醇(DMS)抑制Sphk1的活化和表达;采用MTT法测定细胞的增殖,流式细胞术分析细胞的凋亡,γ-32P-ATP掺入法检测Sphk1的活性,Western杂交检测蛋白的表达,Transwell小室模型观察细胞迁移和侵袭能力的变化,ELISA法检测细胞基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMp-9和尿激酶纤维蛋白溶酶原激活剂(uPA)的分泌.结果 PMA和DMS能分别有效地诱导和抑制HT-29细胞Sphk1活性和蛋白的表达;同时,PMA能促进细胞的增殖、迁移和侵袭,并抑制细胞的凋亡;DMS则抑制细胞的增殖、迁移和侵袭,并促进细胞的凋亡.诱导Sphk1的活化以及表达可促进细胞ERK、p-ERK和NF-kBp65的蛋白表达以及MMP-2、MMp-9和uPA的分泌,而抑制Sphk1则抑制ERK、p-ERK和NF-kBp65的蛋白表达以及MMP-2、MMP-9和uPA的分泌.结论 Sphk1可能是通过激活ERK和NF-k B通路,上调MMP-2、MMP-9和uPA的分泌,从而促进结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭,并抑制细胞的凋亡.     

锌α2糖脂蛋白通过调节ATP水平影响大肠癌HT-29细胞的侵袭能力

目的:锌α2糖脂蛋白(zinc-alpha-2-glycoprotein 1,ZAG)是新近发现的具有复杂功能的蛋白,ZAG参与受精?脂代谢及免疫调节等多种细胞生物学行为,本研究探讨ZAG在大肠癌演进过程中的作用?方法:本研究构建ZAG干扰质粒,并转染入HT-29结肠癌细胞株,免疫印迹与逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测转染前后ZAG表达的变化;检测转染前后细胞三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)含量的变化,以了解ZAG对细胞代谢的影响;利用小室实验检测转染前后HT-29细胞侵袭能力的变化?结果:ZAG干扰质粒成功转染入HT-29细胞并筛选出稳定转染细胞株;转染后的HT-29细胞ATP水平上调,且转染后的HT-29侵袭能力增强?结论:研究结果提示ZAG可能通过调节ATP水平增强大肠癌HT-29细胞的侵袭能力,为大肠癌治疗提供了有价值的新靶点?     

桑寄生提取物对人结肠癌HT-29细胞侵袭迁移的影响及作用机制

目的探讨桑寄生提取物对人结肠癌HT-29细胞侵袭迁移的影响及作用机制。方法不同浓度（0、0.5、1、2、4、8g/ml）的桑寄生提取物处理HT-29细胞24、48或72h后,分别采用细胞计数试剂盒法、侵袭小室法、划痕实验、免疫印迹试验检测不同浓度桑寄生提取物对HT-29细胞增殖、侵袭、迁移能力以及细胞侵袭迁移相关蛋白、PI3K/AKT信号通路相关蛋白的影响。结果桑寄生提取物可明显抑制HT-29细胞增殖,呈浓度和时间依赖性;与空白对照组（0g/ml）相比,桑寄生提取物能降低HT-29细胞侵袭、迁移能力,呈剂量依赖性;能下调细胞侵袭迁移相关蛋白[基质金属蛋白酶2（MMP-2）、MMP-9、血管内皮生长因子（VEGF）]及p-AKT、p-PI3K蛋白表达。结论桑寄生提取物能抑制人结肠癌HT-29细胞的增殖、侵袭及迁移,其作用机制可能与抑制PI3K/AKT信号通路有关。     

蟾蜍毒素诱导结肠腺癌细胞HT-29凋亡中对相关蛋白的影响

目的 探讨蟾蜍毒素诱导结肠癌细胞株HT-29凋亡及其机制.方法 MTI检测蟾蜍毒素对结肠腺癌细胞HT-29增殖抑制;瑞氏-吉姆萨染色观察细胞形态学变化;流式细胞术分析细胞凋亡;Western-Blot检测livin、Bcl-2、Bax及Capase-3蛋白的表达.结果 蟾蜍毒素抑制HT-29细胞增殖,呈时间、剂量依赖关系;蟾蜍毒素诱导HT-29细胞凋亡,形态学观察到典型的凋亡小体;流式细胞仪检测到明显亚二倍体凋亡峰;蟾蜍毒素诱导细胞凋亡过程中下调livin、Bcl-2蛋白表达,上调Bax蛋白表达,并活化Caspase-3蛋白.结论 蟾蜍毒素诱导HT-29细胞凋亡可能与下调livin、Bcl-2蛋白、上调Bax蛋白表达并活化Caspase-3有关.     

环氧合酶-2小分子干扰RNA对人结肠癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 研究环氧合酶-2(COX-2)小分子干扰RNA(siRNA)对COX-2高表达的人结肠癌细胞的增殖和凋亡的影响.方法 筛选出最佳的靶向COX-2 siRNA转染人结肠癌HT-29细胞,采用逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)Western印迹分别从mRNA和蛋白水平检测抑制效果,四甲基偶氮唑蓝(MTT)和Hoechst染色检测COX-2表达被抑制后细胞增殖和凋亡的情况.结果 COX-2 siRNA能在mRNA和蛋白水平下调人结肠癌细胞株HT-29中COX-2基因的表达(P＜0.05),以转染72 h时最显著.COX-2表达被抑制后,转染后72 h时HT-29细胞生长受到明显抑制(P＜0.05),凋亡细胞显著增加.结论 COX-2与结肠癌细胞的生长和凋亡密切相关,抑制结肠癌细胞中COX-2表达可抑制结肠癌细胞生长,促进结肠癌细胞凋亡.     

红霉素对钾离子通道HERG高表达癌细胞的增殖抑制及其与化疗药物的协同作用

目的研究红霉素对钾离子通道HERG高表达癌细胞的增殖抑制及其与化疗药物的协同作用。方法采用Western印迹、四甲基偶氮唑蓝（MTT）法、流式细胞术、细胞黏附实验以及明胶酶谱法观察红霉素对肿瘤细胞的作用。结果HERG钾通道在人结肠癌HT-29细胞和小鼠结肠癌C26细胞中均有表达,和HERG钾通道高表达对照神经母细胞瘤SH-SY5Y相比,在HT-29细胞中表达量较高。红霉素对HT-29细胞和C26细胞的增殖具有不同程度的抑制作用,呈浓度依赖性。红霉素能将HT-29细胞阻滞于G2／M期,并引起明显的Sub G1峰。红霉素对HT-29细胞黏附于Ⅰ型胶原具有明显的抑制作用,存在明显的剂量-效应关系。红霉素能抑制肿瘤细胞释放明胶酶MMP-2。红霉素与长春新碱协同抑制小鼠C26细胞的增殖。长春新碱单用以及长春新碱与红霉素（50μmol／L）联用的IC50分别为62．65nmol／L和4．68nmol／L。红霉素与紫杉醇、羟基喜树碱联用亦显示协同作用。结论红霉素在能抑制钾离子通道HERG高表达癌细胞HT-29的增殖,并能诱导肿瘤细胞凋亡。红霉素与长春新碱等化疗药物显示协同作用。     

FHIT基因转染对人结肠癌细胞系SW480增殖和侵袭力的影响

目的 探讨真核表达质粒pRc/CMV2-FHIT对结肠癌细胞株SW480增殖和侵袭活性的影响。方法 将携有FHIT基因的重组真核表达质粒pRc/CMV2-FHIT转化大肠杆菌DH5α并扩增,抽提纯化质粒并进行酶切鉴定,pRc/CMV2-FHIT体外转染SW480细胞（SW480-FHIT）,筛选稳定转染的细胞并扩增培养,以转染了空质粒pRc/CMV2的SW480细胞（SW480-pRc/CMV2）和正常SW480细胞为对照,用RT-PCR检测FHIT的表达情况,并用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT法）和细胞侵袭实验分别检测FHIT基因转染前、后SW480细胞增殖和侵袭活性的变化。结果 pRc/CMV2-FHIT的酶切鉴定证实含有目的基因FHIT;SW480-FHIT细胞的RT-PCR产物经凝胶电泳有明显的阳性条带,而对照组则无;MTT实验结果显示重组质粒转染组SW480细胞的增殖明显受到抑制;Transwell体外侵袭实验显示转染pRc/CMV2-FHIT能明显抑制SW480细胞的体外侵袭力(P<0.01)。结论 应用基因转染技术重表达FHIT基因能有效抑制细胞的生长、增殖及侵袭活性,为以FHIT为靶向的结肠癌基因治疗提供了新的思路和手段。     

罗格列酮体外抗结肠癌作用的实验研究

目的探讨罗格列酮（Rosiglitazone,ROZ）体外抑制结肠癌生长的作用。方法体外培养人结肠癌细胞HT-29,不同浓度ROZ（10、20、40、80μmol／L）干预。MTT法测定细胞增殖,透射电镜、TUNEL法及流式细胞术观察细胞凋亡情况,免疫组织化学法检测各组细胞中Bax及Bcl-2的表达。结果MTT法显示ROZ抑制HT-29细胞生长,且具有时间和浓度依赖性,透射电镜、TUNEL法及流式细胞术可观察到ROZ具有诱导结肠癌细胞凋亡的作用,免疫组化法显示经ROZ处理后的结肠癌细胞Bax蛋白表达增强,Bcl-2蛋白表达减弱。结论ROZ体外具有抑制结肠癌细胞生长的作用,与其诱导细胞凋亡有关,可能通过增强Bax的表达及减弱Bcl-2的表达实现。     

三氧化二砷在体外抑制结肠癌细胞的研究

目的 在体外观察三氧化二砷(As2O3)对结肠癌细胞系HT-29的抑制作用,并探讨其作用机制,为其是否能作为结肠肿瘤的化疗药物提供理论基础.方法 将不同浓度As2O3作用于HT-29细胞不同时间后,用MTT检测细胞抑制率,光镜及透射电镜观察细胞形态学和超微结构的变化,通过流式细胞仪及共聚焦显微镜分析凋亡及自噬.结果 4.0μmol/L As2O3作用72h可明显抑制HT-29细胞增殖及诱发其凋亡,且抑制率与药物作用时间及浓度成正比.在凋亡早期细胞形态学变化在光镜下可见细胞缩小变圆,在电镜上可见细胞质浓缩、核固缩及自噬溶酶体.4.0μmol/L As2O3作用72h后HT-29细胞凋亡率为25%.结论 As2O3能明显抑制结肠癌细胞系HT-29的增殖,其作用机制与引起凋亡及自噬密切相关.     

人类新血小板反应素R-spondin 3的细胞定位及其对肿瘤细胞功能的影响

目的观察人类新血小板反应素R-spondin 3(Rspo 3)的细胞定位,并探讨其在肿瘤发生发展中的可能作用。方法利用荧光显微成像法观察EGFP-Rspo 3在HEK293细胞中的分布。将重组质粒pcDNA-Rspo 3转染结肠癌细胞HT-29、LoVo,采用流式细胞术观察Rspo 3基因过表达对肿瘤细胞周期与凋亡的影响;采用Matrigel、Transwell实验分别检测Rspo 3基因过表达对肿瘤细胞黏附及侵袭能力的影响。结果荧光显微成像法观察发现,EGFP-Rspo 3融合蛋白在细胞核表达,呈弥散点状分布。流式细胞术观察发现,Rspo 3基因过表达对肿瘤细胞生长周期没有明显影响;Rspo 3基因过表达不影响低恶性的HT-29细胞凋亡,但诱导高恶性的LoVo细胞凋亡(P<0.01)。Rspo 3基因过表达增强肿瘤细胞黏附性(P<0.01),降低肿瘤细胞的侵袭力(P<0.01),对肿瘤细胞移行有一定抑制作用。结论 Rspo 3有核定位功能,能诱导部分肿瘤细胞凋亡并抑制其转移扩散。     

二烯丙基二硫诱导HT-29细胞差异表达cDNA文库的构建

目的:构建二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)诱导人结肠癌HT-29细胞差异表达cDNA文库,以期寻找、克隆DADS特异性作用靶点基因。方法:用120μmol/L的DADS处理人结肠癌HT-29细胞,从DADS处理组及对照组HT-29细胞中提取poly A+RNA,应用高效、灵敏的抑制性消减杂交(SSH)技术构建DADS诱导人结肠癌细胞差异表达cDNA消减文库,再转染大肠杆菌进行文库扩增。结果:成功构建具有高消减效率的DADS诱导人结肠癌细胞差异表达cDNA文库,文库扩增得到了500个克隆,随机挑取100个制备质粒,酶切分析均得到150~1 300 bp大小插入片段,这些片段可能就是载有高度特异性的目的片段。结论:建立了DADS诱导人结肠癌细胞差异表达cDNA文库,为进一步寻找、克隆DADS特异性作用靶点基因奠定了基础。     

短发夹状干扰RNA沉默信号传导和转录激活子3基因表达对大肠癌细胞的影响

目的构建携带信号传导和转录激活子3（STAT3）基因短发夹状干扰RNA（shRNA）的真核表达载体,观察干扰STAT3表达对大肠癌细胞HT-29细胞增殖的影响。方法从GenBank STAT3mRNA上寻找到3条符合特征的靶序列,合成靶序列的DNA寡核苷酸链,合成双链DNA,并和BamHⅠ和HindⅢ酶切后的pRNAT-U6.1/Neo载体质粒连接产生重组质粒,行PCR和测序鉴定。重组质粒瞬时转染大肠癌HT-29细胞,实时定量PCR、Western blot检测STAT3的表达。筛选出最佳重组质粒,转染大肠癌细胞后,MTT检测细胞的增殖情况,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果成功构建了携带有STAT3基因的shRNA的重组质粒,PCR和测序证实重组质粒构建正确。3种重组质粒对大肠癌HT-29细胞STAT3的表达有明显的抑制作用。筛选出的最佳重组质粒转染大肠癌细胞后,细胞增殖能力明显减弱;细胞周期分析显示,G0/G1期细胞占（74.80±1.85）%,S期细胞占（15.72±2.26）%,与对照组差异显著（P〈0.01）。结论干扰STAT3基因的表达可以有效抑制大肠癌HT-29细胞的生长。     

尼美舒利对人结肠癌细胞生长及细胞周期分布的影响

目的探讨尼美舒利对体外培养的结肠癌细胞生长及细胞周期分布的影响。方法以人结肠癌细胞株HT-29、HCT-116为对象,用体外药物敏感实验（MTT）法检测尼美舒利对肿瘤细胞的增殖抑制效应,流式细胞术检测肿瘤细胞周期分布变化情况。结果（1）尼美舒利对人结肠癌细胞株生长的抑制作用呈时间、剂量依赖性效应,且对HT-29细胞作用强于HCT-116细胞;（2）尼美舒利可改变结肠癌细胞株细胞周期的分布,明显降低增殖指数。结论尼美舒利可通过抑制COX2酶活性而抑制肿瘤细胞的分裂和增殖,诱导其凋亡,干预结肠癌的发展。