慢病毒介导的siRNA靶向干扰EIF4G1鼻咽癌稳定细胞株的建立

目的 检测人真核翻译起始因子4G1(EIF4G1)基因在8株鼻咽癌细胞中的差异表达,寻找最高表达的细胞株.构建EIF4G1基因的小干扰RNA(siRNA)表达载体,建立稳定干扰EIF4G1表达的鼻咽癌细胞株,测定干扰效率.方法 应用荧光定量PCR检测EIF4G1 mRNA在鼻咽癌细胞株5-8F、6-10B、C666-1、CNE1、CNE2、HNE1、HONE1、SUNE1表达水平.构建重组靶向EIF4G1 shRNA慢病毒表达质粒pLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA.用293FT细胞包装后产生的成熟慢病毒颗粒感染5-8F细胞.经杀稻瘟菌素筛选后,建立稳定表达siRNA的5-8F鼻咽癌细胞株.最后荧光定量PCR检测干扰效率.结果 在8个鼻咽癌细胞株中,EIF4G1显示在5-8F细胞株中表达最高.PCR和测序验证pLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA重组质粒构建成功;经293FT细胞病毒包装,感染5-8F细胞后,与阴性对照组和未十扰组相比可明显抑制EIF4G1 mRNA水平EIF4G1表达.结论 成功构建TpLenti6/BLOCK-iT-DEST/EIF4G1shRNA慢病毒重组质粒,建立了稳定靶向干扰EIF4G1表达的siRNA5-8F鼻咽癌细胞株.     

慢病毒介导的shRNA靶向干扰nestin鼻咽癌稳定细胞株的建立

摘要：目的检测nestin基因在8种鼻咽癌细胞中的表达差异,寻找高表达的细胞株。构建nestin基因的shRNA表达载体,
建立nestin稳定干扰的鼻咽癌细胞株。方法应用Real-time PCR和免疫荧光技术检测nestin在鼻咽癌细胞株中的表达水
平。构建带GFP的重组靶向nestin shRNA慢病毒表达质粒,筛选阳性克隆,测序鉴定。293T细胞包装病毒,收集病毒上
清,测定滴度。经Real-time PCR内源筛靶,选择最佳靶点。将重组慢病毒感染5-8F细胞,Western blotting 和Real-time
PCR检测nestin的表达。结果在8种鼻咽癌细胞株中,5-8F细胞中nestin表达较高。PCR和测序验证重组质粒构建成
功。慢病毒感染5-8F细胞后,与阴性对照组和空白组相比,nestin的mRNA和蛋白水平明显受到抑制。结论成功构建了
干扰nestin的慢病毒重组质粒,并建立了稳定靶向干扰nestin表达的5-8F鼻咽癌细胞株。
     

Cycl慢病毒干扰载体的构建及在鼻咽癌细胞中干扰效率检测

目的 检测Cycl在鼻咽癌中的表达.构建稳定干扰Cycl慢病毒载体及检测其在鼻咽癌细胞中的干扰效率.方法 应用基因芯片技术检测Cycl基因在鼻咽癌组织中的表达.Real-time PCR确证Cycl基因在鼻咽癌组织和细胞中高表达.构建重组靶向Cycl的shRNA慢病毒质粒pLentiU6/Cycl-shRNA.建立稳定干扰Cycl基因的鼻咽癌细胞系,荧光定量PCR检测干扰效率.结果 基因芯片检测显示,Cycl基因在鼻咽癌组织中高表达.qRT-PCR确证了墓因芯片结果的可靠性.在8个鼻咽癌细胞株中,Cyc1基因基本上都显示了高表达,其中最高的为鼻咽癌5-8F细胞.测序验证pLentiU6/Cycl-shRNA重组质粒构建成功.重组质粒能明显稳定地抑制Cycl基因在鼻咽癌细胞中的表达.结论 Cycl 基因在鼻咽癌中高表达.构建的靶向Cycl基因的慢病毒载体能明显抑制其表达.这为研究Cycl基因在鼻咽癌中的功能及分子机制奠定了基础.     

慢病毒介导的ebv-miR-BART7稳定过表达鼻咽癌细胞株CNE1的建立

目的构建ebv-miR-BART7慢病毒表达载体,建立其稳定表达的鼻咽癌细胞株CNE1-pLVTHM/BART7。方法构建慢病毒表达质粒pLVTHM/BART7。用293FT细胞包装后产生的成熟慢病毒颗粒感染CNE1细胞。经流式细胞仪筛选后,建立稳定表达ebv-miR-BART7鼻咽癌细胞株。最后用荧光定量PCR检测其表达水平。结果 PCR和测序验证pLVTHM/BART7重组质粒构建成功;经293FT细胞病毒包装,感染CNE1细胞后,与阴性对照组和未感染组相比,其表达水平明显升高。结论成功构建了pLVTHM/BART7慢病毒重组质粒,建立了稳定表达ebv-miR-BART7的鼻咽癌细胞株CNE1-pLVTHM/BART7,为研究ebv-miR-BART7在鼻咽癌发生发展过程中的基因调控和相应的作用机制提供了有用的细胞模型。     

siRNA靶向稳定干扰HDGF基因胃癌细胞株的建立

目的 构建针对肝癌衍生生长因子(HDGF)基因的siRNA表达载体,建立稳定干扰HDGF表达的胃癌细胞株. 方法 常规聚合酶链反应(PCR)检测HDGF基因在胃癌SGC-7901细胞株的表达情况.构建重组靶向HDGF shRNA慢病毒表达质粒pLentiU6/ HDGFshRNA,用脂质体转染的方法将载体导入胃癌细胞株.经杀稻瘟菌素筛选后,建立稳定表达siRNA的细胞株.荧光定量PCR检测干扰效率. 结果 在胃癌SGC-7901细胞株中,HDGF显示高表达.测序验证pLentiU6/HDGFshRNA重组质粒构建成功;在将干扰表达质粒稳定转染入胃癌细胞株后能明显抑制HDGF mRNA表达水平. 结论 成功构建了pLentiU6/HDGFshRNA慢病毒重组质粒,建立了稳定靶向干扰HDGF表达的siRNA胃癌细胞株.     

RNA干扰靶向DNMT1基因对乳腺癌MCF-7细胞和RASFF1A基因的影响

目的：RASSF1A基因在乳腺癌MCF-7细胞的表达及其对乳腺癌MCF-7细胞周期和凋亡的影响.方法：DNA重组技术合成针对人乳腺癌MCF-7细胞DNA甲基转移酶1（DNMT1）基因3条siRNA（siRNA1,siRNA2,siRNA3）,以脂质体2000做为载体将其转入人乳腺癌MCF-7细胞,采用RT-PCR法检测DNMT1mRNA的表达,选择特异性较高的siRNA并以此为标准建立10,30,50nmol/L,3个浓度梯度,采用WesternBlot检测RASSF1A基因的蛋白表达,选出最低且有效浓度已达到基因抑制的最适浓度.采用流式细胞仪检测siRNA抑制DNMT1前后细胞周期和凋亡率的变化.结果：siRNA成功转染了人乳腺癌MCF-7细胞,转染率达到80%;3对siRNA中siRNA2特异性较高;WesternBlot检测终浓度为30nmol/L的siRNA抑制效率较高;细胞周期大部分停滞在G0/G1期,抑制细胞增殖分裂,细胞凋亡率增加.结论：通过RNA干扰可以抑制DNMTI的表达,从而逆转由于启动子高甲基化沉默的抑癌基因RASSF1A的表达,最终抑制乳腺癌细胞的生长.为肿瘤基因治疗提供依据.     

UGT1A1基因突变与新生儿黄疸的研究进展

新生儿病理性黄疸中以未结合胆红素(nuconjugatedhyperbilirubiiemia)升高为主占绝大部分,而其病因除了常见的母婴血型不合溶血病,感染,红细胞酶缺陷,红细胞形态异常,红细胞增多症,体内出血等,临床仍有不少病例其病因不明确。近年来对UGT1A1进行了很多研究和探索,目前的研究主要关注于UGT1A1基因多态性与新生儿黄疸的关系。本文对国内外UGT1A1基因突变与新生儿黄疸的关来进行综述,为进一步研究和防治提供理论依据。     

UGT1A1＊28和UGT1A1＊6基因多态性与伊立替康不良反应的关系

目的探讨UGT1A1＊28和UGT1A1＊6基因多态性在中国人中的分布,并评价其与伊立替康不良反应之间的关系。方法收集2011年3月－2012年3月在我科住院治疗的158例恶性肿瘤患者的外周血,检测其UGT1A1＊28和UGT1A1＊6基因型,其中132例使用伊立替康方案化疗,比较不同基因型患者的不良反应差异。结果158例中,UGT1A1＊28野生型TA6／6者126例（79．7％）,杂合突变型TA6／7者30例（19．O％）,纯合突变型TA7／7者2例（1．3％）;64例进行UGT1A1＊6基因检测,G／G野生型40例（62．5％）,G／A杂合突变型23例（35．9％）,A／A纯合突变型1例（1．6％）。UGT1A1＊28基因突变可增加2～4级迟发性腹泻发生率（TA6／6者15．0％、TA6／7者34．8％、TA7／7者50．0％,P=0．000）;联合UGT1A1＊28和UGT1A1＊6基因型,野生型（TA6／6且G／G）患者发生2～4级迟发性腹泻和3～4级中性粒细胞减少的概率明显低于单点变异型和双点变异型（13．0％、22．2％、100．0％,P=0．004;8．7％、25．9％、66．7％,P=0．045）。结论UGT1A1＊28和UGT1A1＊6基因突变患者使用含伊立替康化疗方案时不良反应发生率较高。与单一检测一个位点相比,联合检测UGT1A1＊28和UGT1A1＊6基因型能更准确地预测伊立替康不良反应。     

稳定沉默GLI1基因的人胰腺癌细胞株的建立

目的建立稳定转染GLI1siRNA表达质粒的人胰腺癌细胞株,并鉴定其干扰效率。方法采用荧光定量PCR法(qRT-PCR)检测5株人胰腺癌细胞中GLI1基因的表达,筛选出GLI1基因表达量最高的细胞作为目标转染细胞。脂质体转染法将构建好的3个干扰质粒pGCsi-U6-GLI1siRNA-1、pGCsi-U6-GLI1siRNA-2、pGCsi-U6-GLI1siRNA-3分别转染入目标细胞,G418抗性筛选阳性克隆,荧光显微镜下观察转染效率。采用qRT-PCR法和蛋白质印迹法检测各组稳定转染细胞中GLI1mRNA及蛋白的表达水平,鉴定干扰效率。结果筛选出GLI1基因表达量最高的Panc-1细胞株作为目标转染细胞;3个干扰质粒均成功转染Panc-1细胞,G418筛选后获得稳定转染细胞Panc-1/GLI1siRNA-1、Panc-1/GLI1siRNA-2、Panc-1/GLI1siRNA-3,荧光显微镜下可见3个质粒的转染效率均在80%以上;qRT-PCR及蛋白质印迹检测证实Panc-1/GLI1siRNA-1、Panc-1/GLI1siRNA-2、Panc-1/GLI1siRNA-3细胞中GLI1mRNA和蛋白的表达水平均显著低于阴性对照质粒(Panc-1/siControl)转染细胞及空白对照细胞(P<0.05),其中Panc-1/GLI1siRNA-1细胞表达量最低。结论成功构建了稳定沉默GLI1基因表达的胰腺癌细胞株Panc-1/GLI1siRNA-1,为后续研究奠定了基础。     

靶向bcl-2基因短发卡RNA干扰真核质粒表达稳定株筛选和建立

目的构建针对bcl-2基因的短发卡RNA(shRNA)干扰真核质粒表达载体,转染到bcl-2基因高表达的胃癌细胞株SGC-7901中,并筛选出稳定低表达bcl-2基因的细胞株。方法针对bcl-2基因的mRNA序列设计、合成4对寡核苷酸序列,插入质粒载体pGPH1/GFP/Neo中,经脂质体介导转染SGC-7901细胞。RT-PCR检测bcl-2基因在mRNA水平的变化,MTT法检测bcl-2基因沉默后胃癌SGC-7901细胞的增殖情况。基因沉默效果最好的一组,经G418筛选以得到稳定表达株。结果与对照组相比,转染成功后的细胞bcl-2基因在mRNA水平均显著下降,细胞增殖速度明显降低(t=2.41,P<0.05);并筛选出稳定表达shRNA2质粒的阳性克隆。结论本研究成功利用针对bcl-2基因的shRNA质粒载体筛选出稳定低表达bcl-2基因的SGC-7901细胞,为胃癌的基因治疗研究奠定了基础。     

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A7基因多态性与膀胱癌易感性的关系

目的 探讨尿苷二磷酸匍萄糖醛酸转移酶1A7(UGT1A7)基因多态性与膀胱癌易感性的关系.方法 以病例对照研究方法,应用半巢式PCR(SN-PCR)和等位基因特异性PCR(AS-PCR)分别检测208例膀胱癌患者和205例非肿瘤患者的UGT1A7基因多态性,对各基因型和等位基因单独或联合吸烟行为进行统计学分析.结果 膀胱癌组变异纯合基因型[~*x/~*x(x=~*2,~*3,~*4)]的频率(20.7%)高于对照组(12.2%),差异有统计学意义[P<0.05,OR=2.16(1.18～3.96)].膀胱癌组携带变异等位基因~*3的频率(27.9%)高于对照组(20.5%),差异有统计学意义[P=0.009,OR=1.56(95%CI:1.12～2.18)].吸烟人群中,变异杂合基因型[~*1/~*x(x=~*2,~*3,~*4)]或变异纯合基因型者与野生型者相比,膀胱癌组和对照组间差异有统计学意义,OR(95%CI)值分别为2.16(1.07～4.36)、2.64(1.02～6.80).UGT1A7基因多态性与膀胱癌病理分级和临床分期均无相关性(均P>0.05).结论 UGT1A7基因多态性与膀胱癌易感性有关,该基因多态性与吸烟行为在膀胱癌的发生中存在交互作用.     

云南省迁延性新生儿黄疸与UGT1A1基因多态性的遗传关联性研究

目的探讨尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UGT1A1)基因编码序列(Gly71Arg)的突变及启动序列(非编码序列即TATA)核苷酸的多态性与云南省迁延性新生儿黄疸遗传关联性.方法 289例迁延性新生儿黄疸作为病例组,96例无黄疸新生儿作为对照组.采用常规方法提取DNA,用聚合酶链反应(PCR)方法扩增UGT1A1第1外显子,琼脂糖凝胶电泳鉴定产物,PCR产物进行DNA测序.结果病例组与对照组Gly71Arg等位基因突变率分别为33%及17%,病例组Gly71Arg基因频率显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01);病例组与对照组TATA等位基因突变率均为8%,等位基因频率在病例组及对照组间无统计学差异(P>0.05).结论云南省迁延性新生儿黄疸的发生与Gly71Arg突变密切相关,而与TATA的多态性无关.     

Effects of Shengjiangxiexin decoction on irinotecan-induced toxicity in patients with UGT1A1*28 and UGT1A1*6 polymorphisms

OBJECTIVE

To evaluate the efficacy of Shengjiangxiexin decoction (SXD), prepared with a formula from Traditional Chinese Medicine (TCM), in reducing irinotecan-induced hematological and gastrointestinal toxicities in patients with UDP-glucuronosyltransferase (UGT) 1A1*28 and UGT1A1*6 polymorphisms.

UGT2B17基因的缺失多态性与鼻咽癌危险性的关系

 【目的】 探讨UGT2B17基因的缺失多态性与鼻咽癌发病的相关关系&#65377;【方法】 利用基因特异性引物扩增的方法鉴定不同人群UGT2B17基因的缺失多态性,研究对象包括鼻咽癌高发区广东地区的170例鼻咽癌患者(96例血标本和74例组织标本)和96例健康对照(血标本),鼻咽癌低发区河南及山西的各96例健康对照(血标本),观察UGT2B17基因的缺失多态性在中国鼻咽癌高发区和低发区人群之间的差异,并通过在鼻咽癌高发区广东进行的病例对照研究,运用二分类logistic回归分析研究UGT2B17基因的缺失多态性与鼻咽癌危险性的相关关系&#65377;【结果】 ① UGT2B17基因的纯合缺失型(del/del)在中国不同地区人群中的分布频率均较高(广东健康人群,67.5%;广东鼻咽癌患者,62.9%;河南健康人群,58.2%;山西健康人群,66.3%),且相互之间没有显著性差异(P > 0.05),但其远远高于非洲和高加索人群(约10%)&#65377;② UGT2B17的各基因型和鼻咽癌之间的危险性分析结果显示UGT2B17基因的各基因型均不会增加鼻咽癌发病的危险性(del/ins:OR=1.693,95%CI=0.636～4.503;del/del:OR=1.132,95%CI=0.490～2.616; del/del+del/ins:OR=1.253,95%CI=0.551～2.847)&#65377;【结论】 ① UGT2B17基因的缺失多态性可能与种族密切相关, ② UGT2B17基因的缺失多态性与鼻咽癌的发病未见显著关联&#65377;     

新生儿高胆红素血症与UGT1A1基因相关性的研究进展

新生儿高胆红素血症(Neonatal Hyperbilirubinemia)是一种既普遍又复杂的新生儿疾病,绝大部分高胆红素血症的病因是有迹可循的,有一小部分是病因不明的。近年来,遗传因素在黄疸发病机制中的作用越来越受到重视,研究发现UGT1A1基因多态性与新生儿高胆红素血症的发生发展有着密切联系,UGT1A1基因多态性可导致UGT1A1酶生成减少或活性异常,最终导致高胆红素血症的发生。本文就新生儿高胆红素血症与UGT1A1基因的相关性作一综述。     

KAI-1和MMP-9在鼻咽癌组织的表达及相关性

目的探讨KAI—1和MMP-9在鼻咽癌组织的表达及其相关性。方法通过免疫组化s—P法检测KAI-1和MMP-9在23例慢性鼻咽炎、62例鼻咽癌组织（其中38例伴有颈部淋巴结转移）中的表达情况。结果KAI-1和MMP-9在鼻咽癌组织阳性率分别为56．5％、75．8％,两者在慢性鼻咽炎的阳性率分别为100％、13．0％,差异均有统计学意义（P〈0．05）;鼻咽癌转移组KAI-1的阳性表达明显低于非转移组,阳性率分别为39．5％、83.3％（P〈0．05）。鼻咽癌转移组MMP-9表达明显高于非转移组,阳性率分别为89．4％、54．2％,差异有统计学意义（P〈0．05）。鼻咽癌淋巴结转移组中KAI-1和MMP-9表达无相关（P〉O．05）。结论KAI-1和MMP-9在鼻咽癌组织中异常表达,联合检测有助于进一步阐明鼻咽癌的发生、发展机制。     

UGT1A1*6基因多态性与伊立替康毒性关系的meta分析

目的：通过整合相关文献进行meta分析以得出UGT1A1*6基因多态性与伊立替康毒性的关系,指导临床治疗。方法通过PubMed数据库及手工搜索相关文献,制定文章纳入排除标准,纳入文章进行质量评价,提取数据后,应用STATA12.0软件进行分析。结果共纳入12篇文章进行分析,UGT1A1*6突变型较野生型发生粒细胞缺乏的风险率显著提高（OR=2.37,95%CI 1.58~3.55,P=0.001）,其中纯合突变型和杂合突变型较野生型粒细胞缺乏发生风险率高,纯合突变型（OR=5.09,95%CI 2.74~9.45,P<0.001）较杂合突变型（OR=2.07,95%CI 1.37~3.13,P=0.001）风险率更高;而在腹泻方面,UGT1A1*6突变型较野生型发生腹泻的风险率高（OR=1.48,95%CI 0.86~2.55,P=0.153）,但无统计学差异,而其中纯合突变型腹泻发生风险率显著增高（OR=3.51,95%CI 1.33~9.25,P=0.011）,杂合突变型（OR=1.22,95%CI 0.68~2.22,P=0.503）腹泻发生风险率增高,但结果无统计学差异。结论 UGT1A1*6基因多态性可以预测伊立替康的毒性,尤其是粒细胞缺乏的发生率。     

一个中国Gilbert综合征家系的临床和遗传学特征分析

目的 通过对1个中国Gilbert综合征家系成员临床特征分析,结合致病基因尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1)基因已知突变位点鉴定,了解该病临床发病特点和分子遗传学基础.方法 在长期追踪先证者基础上,抽取先证者及其家系成员外周血,进行肝脏生化学、病原学和UGT1A1基因突变位点检测,排除相关疾病,PCR扩增启动子和外显子常见突变位点,产物直接测序鉴定基因型.结果 在该家系中,检测到3个突变位点:c.-3279T＞G、TA插入和Gly71Arg,并且C.-3279T＞G和TA插入存在连锁不平衡,其中4例患者中3例为杂合突变,1例为纯合突变,胆红素水平与UGT1A1基因型和表型相关.结论 c.-3279T＞G、TA插入和Gly71Arg突变可能与中国人群Gilbert综合征发生相关,该家系基本符合常染色体隐性遗传方式.     

UGT1 A10基因SNP rs10187694对吗替麦考酚酯代谢的影响

体外研究尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（UGT1A10 ）基因SNP rs10187694 多态位点G/A变异对吗替麦考酚酯（MMF）代谢的影响,明确该位点变异是否与MMF个体代谢差异有关。方法采用基因重组、定点突变技术,构建UGT1A10基因SNP rs10187694位点含有不同等位基因的重组过表达载体,POLO 3000 转染法将重组过表达载体转染入HEK293细胞,采用液相色谱- 质谱联用仪（LC/MS/MS）系统,检测霉酚酸（MPA）代谢产物7-O- 葡醛酸苷（MPAG）的生成量,以评估转染不同等位基因HEK293 细胞中酶的活性。结果成功 构建pIRES2-EGFP-prom（G）和pIRES2-EGFP-prom（A）重组过表达载体,并转染HEK293 细胞。LC/MS/MS系统检测结果显示,携带A 等位基因的突变型1 10代谢MMF 产生MPAG 的能力降低,其24 h MPAG的生成量为（226.00±14.57）nmol/L,而野生型的生成量为（269.00±14.07）nmol/L, UGT1A10突变型MPAG 的生成量是野生型的84.00%,两者比较,差异有统计学意义（ p<0.05）。结论1 10基因SNP rs10187694位点G/A突变可影响MMF代谢产物MPAG的生成,可能是造成不同个体MMF代谢差异的重要原因之一。     

血清白蛋白水平可预测UGT1A1基因分型伊立替康化疗的不良反应

目的: 探讨按UGT1A1基因多态性分型指导伊立替康治疗肿瘤用药后部分患者的不良反应原因,寻找新的辅助性分子分型标志物。方法：收集本院收治的269例含伊立替康化疗方案治疗的恶性肿瘤患者。在治疗前采用PCR毛细管电泳法分析每例患者UGT1A1的基因多态性,用常规试剂盒检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、血清肌酐及血清白蛋白等肝肾功能水平,按现有NCCN指南建议的基因分型标准确定伊立替康化疗方案,观察患者接受分型治疗后不良反应减轻程度,采用Wilcoxon秩和检验比较患者的不良反应与多个肝肾功能指标之间的可能关系。结果：根据UGT1A1*28基因型实施剂量差异化治疗后的269例中均获得预期效果,其中238例未观察到明显不良反应,但31例（11.5%）出现白细胞计数减少和腹泻等为特征的较严重的不良反应。发生严重的不良反应组治疗前血清白蛋白水平（34.9±3.0 g/L）显著低于无不良反应组（41.4±3.5） g/L （P <0.05）。ROC分析提示白蛋白水平具有良好的可预测伊立替康不良反应的能力（曲线下面积达到0.926 6）。两组之间AST水平差异虽具有统计学意义（OR=0.98, 95%CI：0.97~1.00,P<0.05）,但其ROC曲线下面积仅为0.679 7,预测价值一般。肿瘤的病理类型、性别、年龄、UGT1A1*28、UGT1A1*6基因型以及其他肝肾功能指标与不良反应的发生无明显统计学相关性（P>0.05）。结论：肿瘤患者治疗前的血清白蛋白水平较低与伊立替康导致的不良反应有密切关系,血清白蛋白水平可作为预测伊立替康产生不良反应的生物标志物。