结核分枝杆菌ESAT6基因克隆与表达质粒构建

目的 克隆结核分枝杆菌(MTB)分泌蛋白ESAT6基因，并构建重组表达质粒。方法 根据Genbank中ESAT6基因序列，针对其编码区合成引物，采用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出ESAT6基因，并连接到T载体，然后定向克隆到原核表达质粒pGEX-4T-2，阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。结果 经双内切酶消化所切下的片段，大小与预计相符；测序结果证实基因序列正确，符合表达框架。结论 成功构建了重组原核表达质粒pGEX-ESAT6。     

结核分枝杆菌ESAT6基因克隆与表达质粒构建

目的　克隆结核分枝杆菌 (MTB)分泌蛋白ESAT6基因 ,并构建重组表达质粒。方法　根据Genbank中ESAT6基因序列 ,针对其编码区合成引物 ,采用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出ESAT6基因 ,并连接到T载体 ,然后定向克隆到原核表达质粒pGEX 4T 2 ,阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。结果　经双内切酶消化所切下的片段 ,大小与预计相符 ;测序结果证实基因序列正确 ,符合表达框架。结论　成功构建了重组原核表达质粒 pGEX ESAT6。     

结核分枝杆菌Ag85B基因克隆及表达质粒构建

目的 克隆并构建编码结棱分枝杆菌Ag85B分泌蛋白的重组表达质粒。方法 采用聚合酶链反应(PCR)方法从结棱分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出Ag85B基因(978bp)，并克隆到T栽体，然后用双内切酶消化后，与同样酶消化的pGEX-4T-2连接，转入大肠杆菌E．coli DH5α，阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。结果 酶切鉴定所切下的片段大小与预计相符，测序结果与文献报道一致，证实符合表达框架。结论成功地克隆并构建了Ag85B基因的重组表达质粒pGEX-Ag85BV。     

应用MPT64检测建立结核分枝杆菌药敏新方法的初步探索

目的初步探索应用MPT64检测建立一种结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）药敏新方法的可行性,确定药敏方法的实验条件和实验程序。方法通过检测MTB标准株和临床株的MPT64分泌,验证MPT64检测用于药敏结果指示的有效性;对不同方式制备的菌悬液进行MPT64检测,确定药敏方法的接种程序。结果指示有效性试验中,MTB标准株和60株MTB临床株的菌悬液MPT64检测均阳性;药敏接种程序确定试验中,直接挑取菌落方式配制的各种浓度MTB菌悬液（分别为1、0.1、0.01和0.001 mg/ml）MPT64检测均阳性,而生理盐水洗涤方式配制的各种浓度MTB菌悬液（分别为1、0.1、0.01和0.001mg/ml）MPT64检测均阴性。结论 MPT64检测能有效指示MTB的生长;洗涤方式制备菌悬液可避免MTB原代菌株产生的MPT64被带入培养基中,从而能够更真实地反映无药和含药培养基中MTB的生长情况。     

应用MPT64检测建立结核分枝杆菌药敏新方法的初步探索

目的 初步探索应用MPT64检测建立一种结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)药敏新方法的可行性,确定药敏方法的实验条件和实验程序.方法通过检测MTB标准株和临床株的MPT64分泌,验证MPT64检测用于药敏结果指示的有效性;对不同方式制备的菌悬液进行MPT64检测,确定药敏方法的...     

结核分枝杆菌Ag85B基因克隆及表达质粒构建

目的　克隆并构建编码结核分枝杆菌Ag85B分泌蛋白的重组表达质粒。方法　采用聚合酶链反应 (PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出Ag85B基因 (978bp) ,并克隆到T载体 ,然后用双内切酶消化后 ,与同样酶消化的pGEX 4T 2连接 ,转入大肠杆菌E .coliDH5α,阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。结果　酶切鉴定所切下的片段大小与预计相符 ,测序结果与文献报道一致 ,证实符合表达框架。结论　成功地克隆并构建了Ag85B基因的重组表达质粒 pGEX Ag85BV。     

结核分枝杆菌ESAT-6基因的克隆与表达

目的　对结核分枝杆菌的ESAT - 6基因进行克隆、鉴定与表达 ,为结核病的诊断、重组疫苗的应用打下基础。方法 　 以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板 ,用聚合酶链反应 (PCR)对ESAT - 6基因进行扩增 ,将扩增的产物连接于测序载体 pGEM T上 ,经测序反应确定无误后 ,再将PCR产物与原核表达载体pET4 2b(+)构建表达ESAT - 6的重组质粒 ,将重组质粒先转化入大肠杆菌DH5α内并提取质粒 ,经酶切鉴定后 ,再转化入表达宿主大肠杆菌BL2 1菌株内 ,对转化菌株进行诱导后 ,破菌 ,进行SDS -PAGE电泳。结果 　电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白 ,其表达的蛋白质相对分子质量为 990 0。结论 　 目的基因克隆到菌株内 ,重组结核分枝杆菌ESAT - 6的成功表达为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测等奠定了基础     

结核分枝杆菌三种基因重组质粒的构建及原核表达

目的构建结核分枝杆菌ESAT-6、CFP10、phoS2/pET28a表达重组质粒,并原核表达重组蛋白。方法将目的基因亚克隆到pET-28a表达载体,转化入大肠埃希菌BL21（DE3）plysS,诱导表达重组蛋白ESAT-6、CFP10、phoS2。结果成功构建基因工程菌株ESAT-6、CFP10、phoS2/pET-28a/BL21（DE3）plysS,表达重组蛋白ESAT-6、phoS2,因以包涵体形式存在,无法纯化。结论成功构建结核分枝杆菌ESAT-6、CFP10、phoS2/pET28a重组质粒,分别表达分子量约10×103、31×103的ESAT-6、phoS2重组蛋白,但无法纯化,CFP10不表达。     

DcR3基因克隆、重组质粒构建及表达鉴定分析

目的研究DcR3a基因克隆、重组质粒构建及表达鉴定。方法采用PCR技术克隆DcR3cDNA编码序列，构建真核表达载体，然后检测重组DeR3／pAAV—IRES—hrGFP质粒在真核细胞中的表达。结果DcR3蛋白的表达正确。我们进一步用激光共聚焦显微技术成功检测到重组DeR3／pAAV—IRES—hrGFP质粒在真核细胞中的表达，并证明质粒中GFP与DcR3在真核细胞中的表达具有一致性。结论可以将重组质粒转染的真核细胞中GFP的表达作为DcR3表达的标志。     

Mfn2基因克隆及pEGFPmfn2真核表达质粒的构建

目的利用基因工程技术克隆线粒体融合蛋白2(mitofusin-2,mfn2)基因并构建一种无细胞毒性、不激活原癌基因的真核表达的pEGFPmfn2质粒载体。方法采用高效Trizol试剂快速提取大鼠血管平滑肌细胞株A7r5总RNA,经RT-PCR获得mfn2cDNA,扩增、纯化、回收mfn2基因片段并将质粒pEGFP-N1和mfn2基因片段分别双酶切,前者纯化回收大片段,后者纯化回收2.2 kb片段,再将回收的pEGFP-N1大片段与mfn2基因片段(2.2 kb)重组。对重组pEGFPmfn2质粒进行PCR和双酶切鉴定并测序。结果成功地从A7r5中克隆了mfn2基因,并构建了以pEGFP-N1为载体的真核表达质粒。结论含mfn2基因新型表达质粒构建的成功将为研究mfn2功能、进一步研究该基因异常表达与心血管疾病发生的关系奠定基础。     

结核分枝杆菌Rv3407基因的克隆及重组质粒的构建

结核病（TB）是由结核分枝杆菌（MTB）所致的以呼吸系统感染为主的慢性传染病。目前全球约有1／3的人口感染MTB,我国是世界上结核病负担最重的22个国家之一,近年来,由于卡介苗（BCG）保护性不完善、多重耐药MTB的出现、与人类免疫缺陷病毒（HIV）的协同感染以及人口流动等原因使TB疫情日益严重,我国新生儿感染率为美国的8倍。     

结核分枝杆菌ESAT-6基因的克隆与表达

目的 对结核分枝杆菌的ESAT-6基因进行克隆、鉴定与表达，为结核病的诊断、重组疫苗的应用打下基础。方法 以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板，用聚合酶链反应(PCR)对ESAT-6基因进行扩增，将扩增的产物连接于测序载体pGEM-T上，经测序反应确定无误后，再将PCR产物与原核表达载体pET42b( )构建表达ESAT-6的重组质粒，将重组质粒先转化人大肠杆菌DH5a内并提取质粒，经酶切鉴定后，再转化入表达宿主大肠杆菌BL21菌株内，对转化菌株进行诱导后，破菌，进行SDS-PAGE电泳。结果 电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白，其表达的蛋白质相对分子质量为9900。结论 目的基因克隆到菌株内，重组结核分枝杆菌ESAT-6的成功表达为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测等奠定了基础。     

T载体克隆在病毒样颗粒表达载体构建中的应用

目的提高带某些限制酶切位点聚合酶链反应(PCR)扩增产物克隆入表达载体的效率。方法将带Hind Ⅲ酶切位点的PCR扩增产物与T载体连接，转化BL21-DE3 E．Coli，提取质粒后，用Hind Ⅲ酶切，电泳分离并提取纯化的目的片段。然后，与经过相同的限制性酶酶切的表达载体pNCCL1连接。结果经T载体克隆酶切构建的内含严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS—CoV)核酸的病毒样颗粒表达载体，方法简单快速，每次均可获得成功。而采用直接酶切扩增产物的构建方法，未获得成功构建的表达载体。结论T载体克隆可用于对直接酶切效果不好(如Hind Ⅲ)的PCR扩增片段的表达载体的连接构建，方法简便高效。     

结核分枝杆菌CFP10和MPT48及TB8.4融合蛋白的表达与临床应用

目的 构建结核分枝杆菌CFP10、MPT48和TB8.4融合蛋白,评价其用于结核病血清学检测的价值.方法 选取2008年上海市肺科医院肺结核患者150例,非结核肺部疾病患者70例,健康体检者103名,采集血清标本共323份.构建结核分枝杆菌CFP10、MPT48和TB8.4融合表达载体.融合蛋白经免疫印迹分析后,采用酶联免疫吸附试验检测血清标本,运用Medcale11.5对结果进行统计学分析.结果 成功构建重组质粒pET21a-cfp10-mpt48-tb8.4,获得95％以上纯度的融合蛋白.免疫印迹法发现融合蛋白与血清抗体发生免疫反应.融合蛋白检测血清抗体敏感度56.7％(85/150),特异度90.8％(157/173),其中非结核病患者特异度为85.7％ (60/70),健康体检者特异度为94.2％(97/103).结论 CFP10-MPT48-TB8.4融合蛋白所具有的免疫反应性,有可能成为结核病血清学诊断的候选抗原.     

心脏转录因子Nkx2．5真核表达质粒的构建

目的构建人类心脏特殊转录因子Nkx2．5的真核表达质粒,为进一步探讨Nkx2．5在心脏发育及先天性心脏病发病过程中的作用奠定基础。方法以质粒pCMV6-XL5-Nkx25为模板,并设计上下游引物扩增Nkx2．5编码区序列,将真核表达载体pCMV-HA和Nkx25的PCR产物分别在双酶切后用,T4连接酶连接,构建重组质粒pCMV-HA-Nkx2．5,转化至大肠杆菌,提取质粒后经PCR、双酶切及测序鉴定。结果成功设计引物扩增出Nkx2．5基因编码区约1000bp的目的片段。PCR和酶切鉴定结果显示,构建的重组真核表达质粒中含有正确的Nkx2．5基因序列。结论成功构建了含有Nkx2．5的真核表达重组质粒,为后续研究奠定基础。     

结核分枝杆菌抗原Rv2654c、Rv1985c和Rv3868的克隆表达及血清诊断学初步评价

目的 评价结核分枝杆菌蛋白抗原Rv2654c、Rv1985c和Rv3868的血清诊断价值和潜在应用前景。方法 以结核分枝杆菌H37Rv标准株全基因组DNA为模板扩增得到Rv2654c、Rv1985c和Rv3868基因的完整序列, 并与表达载体pET-32a构建重组质粒。原核表达Rv2654c、Rv1985c和Rv3868蛋白, 利用亲和层析的方法进行纯化。采用棋盘滴定的方法, 确定各抗原的酶联免疫吸附试验(ELISA)最佳反应条件, 并应用190份血清进行血清IgG抗体检测, 结合受试者工作特征曲线(ROC)对其诊断效能进行分析和评价。通过ROC计算各抗原组合的诊断效能, 确定最佳组合方案。结果 成功构建了重组蛋白, 对重组后的片段进行测序, 经BLAST比对与目的基因完全一致, 且能够稳定表达。对经纯化后的3种蛋白进行ELISA检测, 经统计学分析, Rv2654c、Rv1985c和Rv3868抗原的诊断效能分别达到73.16%、56.84%和71.05%。结合ROC得到最佳的抗原组合方案为Rv2654c+Rv3868, 其敏感性、特异性和诊断效能分别达到78.95%、72.63%和75.79%。结论 结核分枝杆菌重组抗原Rv2654c、Rv1985c和Rv3868具有作为结核病诊断抗原的潜力, 可以作为结核病免疫学快速诊断的候选蛋白。抗原组合Rv2654c+Rv3868具有较高的诊断效能, 有较好的潜在应用价值。     

结核分枝杆菌Ag85A在大肠埃希菌中的表达与纯化

目的 在大肠埃希菌中表达、纯化结核分枝杆菌Ag85A蛋白,探讨Ag85A蛋白作为候选疫苗用于结核免疫预防和治疗的可行性.方法 扩增人结核分枝杆菌Ag85A基因序列,将结核分枝杆菌Ag85A的全长cDNA插入到原核表达载体pGEX-4T-1中,构建成Ag85A重组质粒.将重组质粒转入大肠埃希菌BL21并以IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western-blot鉴定大肠埃希菌表达的重组蛋白.结果 成功克隆了结核分枝杆菌Ag85A,获得了pGEX4T-Ag85A重组子,Ag85A在大肠埃希菌中实现了稳定表达,表达的蛋白条带大小约32 kD,与预期结果 相符.结论 成功地对结核分枝杆菌免疫保护性抗原Ag85A进行了基因克隆与表达,为进一步研究其在结核病新型疫苗研制中的应用奠定了基础.     

人端粒酶反转录酶936-1132氨基真核表达载体的构建及在293T细胞中表达

背景:人端粒酶反转录酶是端粒酶的重要组成之一,可使端粒酶表现活性从而拮抗端粒缩短或细胞衰老。目的:构建人端粒酶反转录酶C端936-1132氨基真核表达载体,并在人胚肾细胞293T表达,为其在细胞内定位研究奠定基础。方法:以人端粒酶反转录酶cDNA为模板,PCR扩增出带有酶切位点其C端936-1132氨基序列片段,并与真核表达载体pcDNA3.1-HisA连接,构建出重组质粒pcDNA3.1-HisA-hTERT aa936-1132,将重组质粒转染入人胚肾细胞293T中,使蛋白表达,并对蛋白进行免疫印迹鉴定。结果与结论:经双酶切和基因测序等方法证实,人端粒酶反转录酶C端936-1132氨基重组质粒pcDNA3.1-HisA-hTERT aa936-1132构建成功,经免疫印迹鉴定可检出融合蛋白。     

重组pcDNA4 His/Max人骨形态发生蛋白9真核表达载体的构建与鉴定

背景:腺病毒临床应用存在安全隐患,利用真核表达载体表达蛋白为解决安全性问题提供了一种方法。目的:将人骨形态发生蛋白9的cDNA构建于pcDNA4 His/Max,得到重组真核表达载体pcDNA4 His/Max人骨形态发生蛋白9。方法:将已有的Padtrack-cmv-人骨形态发生蛋白9进行PCR扩增,电泳回收人骨形态发生蛋白9片段,将pcDNA4 His/Max用NotⅠ和KpnⅠ双酶切,得到pcDNA4His/Max酶切片段,连接人骨形态发生蛋白9和pcDNA4 His/Max片段得到重组质粒pcDNA4 His/Max人骨形态发生蛋白9,将该载体用DH5α转化,阳性克隆扩增及纯化、序列分析鉴定。结果与结论:通过PCR及序列分析证明pcDNA4 His/Max人骨形态发生蛋白9真核表达载体的人骨形态发生蛋白9基因长度为1.3kb,与报道的人骨形态发生蛋白9全长序列一致,无突变。结果证实,实验成功构建了pcDNA4 His/Max人骨形态发生蛋白9真核表达载体。     

血管内皮生长因子反义基因真核表达载体构建的研究

微血管的生成与肿瘤的生长、发展与转移密不可分,抑制血管生成已成为近年来抗肿瘤治疗研究的重要课题和热点问题.结肠癌是临床常见的恶性肿瘤之一,严重威胁人类健康,探索治疗结肠癌新技术、新方法具有重要的临床价值.本实验将血管内皮生长因子反义基因成功克隆构建了真核表达载体,为下一步结肠癌细胞体外培养干预实验和临床抗肿瘤应用试验做好了前期工作.