原发性肝细胞癌中cyclin D1基因表达与P16 及CDK4蛋白表达的关系

目的研究cyclin D1基因在原发性肝细胞癌中的表达,并探讨其与P16及CDK4蛋白表达的关系.方法用原位杂交检测cyclin D1基因mRNA表达,免疫组化检测Cyclin D1蛋白表达.结果 6例(14.3%)HCC可检测到cyclin D1基因过表达,5例属Ⅲ-Ⅳ级,1例属Ⅱ级.6例HCC均有CDK4蛋白表达,其中3例为P16蛋白阳性.结论①cyclin D1表达增加只在小部分恶性程度高的HCC中起作用,可能与肿瘤侵袭有关.②在HCC中,cyclin D1基因过表达和(或)P16蛋白丢失均起重要作用.     

P21对胃癌细胞MGC-803的增殖抑制及对POLD1基因表达的调控

目的:研究P21对POLD1基因的调控通路,以探索阻断癌细胞恶性增殖的机制.方法:实验主要分3组:阴性对照组(转染空载体pXJ41-neo的803-pXJ细胞)、空白对照组(胃癌细胞MGC-803)、实验组(转染P21重组真核表达质粒pXJ41-p21的803-p21细胞).MTT实验分析细胞增殖变化,流式细胞仪检测细胞凋亡水平,实时荧光定量PCR技术检测基因表达水平的变化,Westernblot分析蛋白表达差异.结果:MTT实验显示,与空白对照和阴性对照组相比,实验组细胞增殖受到明显抑制,凋亡率(%)增高(11.36±0.51vs7.39±0.17,7.69±0.47,F=85.338,均P<0.05).实验组P21mRNA表达水平显著提高(2.15±0.23vs1.05±0.11,1.00±0.00,F=59.054,均P<0.05),POLD1则显著下调(0.45±0.07vs1.09±0.13,1.00±0.00,F=49.907,均P<0.05);P21、P125蛋白表达变化与基因变化相一致.cyclinE、Rb1基因表达均上调,CDK2基因表达下调,c-myc基因表达则变化不大.结论:P21抑制了...     

原发性肝细胞癌中cyclinD1基因表达的研究

目的　研究ｃｙｃｌｉｎＤ１ 基因在原发性肝细胞癌中的表达，并探讨与ｐ１６ 及ＣＤＫ４ 蛋白表达的关系。方法　用原位杂交检测ｃｙｃｌｉｎＤ１ 基因ｍＲＮＡ 表达，免疫组化检测ｃｙｃｌｉｎＤ１ 蛋白表达。结果　４ 例（１４－３ ％ ） ＨＣＣ 可检测到ｃｙｃｌｉｎＤ１ 基因过表达。均属ⅢⅣ级，４ 例ＨＣＣ 均有ＣＤＫ４ 蛋白表达，其中２ 例为ｐ１６ 蛋白阳性。结论　１）ｃｙｃｌｉｎＤ１ 表达增加只在小部分恶性程度高的ＨＣＣ 中起作用，可能与肿瘤侵袭有关。２） 在ＨＣＣ 中，ｃｙｃｌｉｎＤ１ 基因过表达和／ 或ｐ１６ 蛋白丢失均起重要作用     

XIAP通过调节CDK4／CDK6／cyclinD1复合物表达促进肝癌细胞增殖

目的研究肝癌细胞中XIAP与cDK4／cDK6／cyclinD1复合物之间的调控关系及在肝癌细胞增殖中的作用。方法前期研究用PathwayArray进行肝癌组织异常表达蛋白筛选,后期XIAP特异性抑制剂embelin处理Huh7细胞进行增殖、周期分析。Westernblot验证XIAP与cDK4／cDK6／cyclinD1复合物之间的调控关系。结果PathwayArray提示XIAP与CDK4、CDK6、cyclinD1之间存在联合表达。embelin引起Huh7细胞G1期阻滞、S期分布减少,抑制细胞增殖。XIAP可以调节Huh7细胞G1期蛋白CDK4、CDK6、cyclinD1表达。结论XIAP通过调节肝癌细胞G1期蛋白CDK4／CDK6／eyelinD1复合物的表达,促使细胞进入G1周期,从而促进其增殖。     

XIAP和CDK4/cyclinD1复合物联合表达对肝癌预后评估的价值

目的 探讨XIAP和CDK4/cyclin D1复合物联合表达对肝癌预后评估的价值.方法 对59例肝癌手术后组织石蜡标本,进行XIAP、CDK4、cyclin D1蛋白分子的免疫组化染色和预后分析.结果 XIAP、CDK4、cyclin D1高表达患者与XIAP、CDK4、cyclin D1低表达患者相比,生存率较低....     

肝细胞肝癌中SALL4蛋白表达及其临床病理意义

目的探讨婆罗双树样基因4(SALL4)在肝细胞癌(HCC)发生和进展中的作用。方法应用蛋白免疫印迹方法检测30例HCC患者手术切除的癌组织和癌旁组织中SALL4蛋白表达情况。结果 90%肝癌组织中SALL4的蛋白表达显著高于癌旁组织;肝癌组织中SALL4蛋白表达水平与性别、年龄、肿瘤大小、乙肝、病理分级、肿瘤包膜和门脉癌栓差异均无显著性,而与甲胎蛋白(AFP)有关。结论 SALL4蛋白高表达可能增加肝癌细胞的增殖,促进肝癌的进展。     

食管鳞癌中TGF-β1、CDK 4与临床病理因素关系的研究

目的研究食管鳞癌TGF-β1、CDK4蛋白水平及其在增殖、侵袭、转移中的作用.方法用免疫组化方法研究TGF-β1和CDK4蛋白表达,显微镜下计数阳性细胞指数(LI),进行分析.结果(1)TGF-β1与CDK 4表达正常食管黏膜阳性率与食管鳞癌组织相比两指标差异均有显著性;LI后者高于前者.(2)TGF-β1和CDK 4在食管鳞癌组织中的表达与年龄、性别、不同分化级别无明显关系(P＞0.05),而与淋巴结转移、食管外膜浸润临床分期有关(P＜0.05).(3)TGF-β1和CDK4两者表达呈正相关,Speaman相关系数=0.6122,P＜0.0001.结论(1)食管鳞癌中存在TGF-β1的高表达,其检测有辅助诊断价值,表达水平检测有助于判断肿瘤转移、浸润和后继治疗;其表达水平与组织分级无关,提示TGF-β1在促进肿瘤局部侵袭转移中的重大作用,有助于理解临床上一些肿瘤生物学行为与组织分级不符的现象.(2)CDK4在食管鳞癌中表达,促进了肿瘤发展、侵袭转移,是食管癌发生发展中的重要事件.(3)CDK 4升高可能在某一阶段,在促使肿瘤细胞对TGF-β1介导的生长抑制和促进凋亡作用产生逃逸现象中起一定作用.     

蛙皮素对人胃黏膜上皮永生细胞系cyclin D1/CDK4的影响

目的 研究蛙皮素对正常胃黏膜上皮细胞的促生长作用及其与细胞调控因子之间的关系。方法 应用人胃黏膜上皮永生细胞株GES－1,经蛙皮素及受体拮抗剂不同处理后,以MTT为指标研究对细胞增殖的影响;流式细胞仪观察对细胞cyclin D1表达的影响;利用Western印迹和增强化学发光法观察CDK4蛋白表达的变化;利用Sepharose微珠免疫沉淀方法检测对CDK4活性的影响。结果 蛙皮素在浓度为10^-7mol/L时对GES－1细胞有明显的促生长作用,对cyclin D1表达有促进作用;蛙皮素受体拮抗剂均抑制这些作用;同时还发现蛙皮素可使人胃黏膜上皮永生细胞系细胞的CDK4蛋白表达及其激酶活性增加。结论 蛙皮素促进人胃黏膜上皮细胞生长是通过使细胞周期调控因子cyclin D1和CDK4蛋白表达升高,CDK4激酶活性增加,促进细胞周期的进展而实现的。     

p16,CDK4和Rb在人肝细胞癌中的表达

目的分析ｐ１６基因、细胞周期蛋白依赖性激酶（ＣＤＫ４）和视网膜母细胞瘤基因（Ｒｂ）在人肝细胞癌中表达的改变。方法用免疫组织化学方法对４０例肝细胞癌和癌分组织作检测。结果肝癌组织中的ｐ１６蛋白、ＣＤＫ４和Ｒｂ蛋白的异常表达分别为９４．４４％（３４／３６）、４０．００％（１６／４０）和４５．７１％（１６／３５）。ｐ１６蛋白阴性或弱阳性而ｐＲｂ呈强阳性者１３例（１３／３４,３８．２３％）,两者的表达呈负相关关系二和Ｒｂ均异常者１５例（１５／３４,４４．１１％）,表明Ｒｂ表达的调节除ｐ１６外,还有其他的途径。ＣＤＫ４过度表达的１４例中大多伴Ｐ１６的改变（１３／１４,９２．８５％）,５０．００％能影响Ｒｂ蛋白的表达,同时伴ｐ１６和Ｒｂ异常者为４６．１５％。三者的异常表达与肝癌的恶性程度无相关关系。结论细胞调节因子Ｐ１６基因、ＣＤＫ４和Ｒｂ的表达异常,均参与肝细胞癌的发生。以ｐ１６蛋白表达的改变最为明显。     

Galectin-4蛋白在肝细胞癌中特异性高表达

目的探讨Galectin-4蛋白在肝细胞癌(HCC)中的表达及其意义。方法应用免疫组织化学En Vision法检测Galectin-4在300例HCC和41例3种肝脏良性肿瘤中的染色特点及表达情况。结果 Galectin-4主要在HCC细胞质着色,在3种良性肿瘤不着色或极少着色。HCC和3种肝脏良性肿瘤中Galectin-4的阳性表达率分别为82.7%(248/300)和0.0%(0/41)(P=0.000),Galectin-4与血清AFP联合检测HCC的阳性率达95%。Galectin-4的表达与HCC肿瘤分期相关,与其他临床病理学参数无关。结论 Galectin-4蛋白在HCC组织中特异性高表达,对HCC的诊断和鉴别诊断具有较高的价值。Galectin-4高表达可能提示HCC较好的肿瘤分期。     

Flavopiridol通过调节CDK4/CDK6/cyclinD1复合物表达抑制肝癌细胞增殖

目的研究flavopiridol对肝癌细胞Huh7增殖、凋亡和细胞周期的影响。方法Flavopiridol处理Huh7细胞后,检测细胞增殖和凋亡,进行细胞周期分析。Westernblot检测flavopiridol对cDK4／cDK6／cyclinD1复合物表达的影响。结果Flavopiridol可显著抑制Huh7细胞增殖;Flavopiridol可剂量依赖性导致Huh7细胞发生凋亡,空白对照组凋亡细胞2．65％,550nmol／L剂量处理组凋亡细胞14．17％;Flavopiridol可剂量依赖性引起Huh7细胞G1期阻滞,空白对照组G1期细胞51．06％,550nmol／L剂量处理组G1期细胞57．53％;Flavopiridol可抑制Huh7细胞Gl期相关的蛋白细胞周期素依赖激酶（CDK）4,CDK6,细胞周期素D1（cyclinD1）的表达。结论Flavopiridol通过抑制肝癌细胞G1期cDK4／cDK6／cyclinD1蛋白复合物表达,引起细胞G1期阻滞并发生凋亡,从而抑制细胞增殖。     

人STIM1基因真核表达载体的构建及其在肝细胞中的表达

目的: 构建人STIM1基因真核表达载体, 并观察其在人肝细胞株(HL-7702)中的表达.方法: 提取HL-7702细胞总RNA, RT-PCR扩增,经纯化回收后将片段克隆至pGM-T载体, 酶切琼脂糖凝胶电泳分析鉴定并测序, 最后用重组质粒转染HL-7702细胞, 通过PCR-电泳和Western blot法检测STIM1基因的表达.结果: PCR扩增的片段长度为342 bp, 测序结果以及重组质粒pGM-T-STIM1的酶切琼脂糖凝胶电泳鉴定结果均证明STIM1基因成功克隆到真核表达载体中. PCR-电泳和Westernb l o t实验结果分别显示转染重组质粒后的HL-7702细胞在基因与蛋白水平表达STIM1均有所增强.结论: 成功构建了人STIM1基因的真核表达载体pGM-T-STIM1, 并在人肝细胞株HL-7702中稳定表达, 为研究STIM1蛋白在人肝细胞内Ca2+浓度调控方面及其对人肝细胞分泌功能的影响奠定了良好的实验基础.     

POLD1基因在原发性肝癌中的表达及其意义

目的:探讨DNA聚合酶δ催化亚基基因(DNA polymerase delta catalytic subunit gene 1,POLD1)及其编码蛋白p125在原发性肝癌中的表达及意义.方法:选用原发性肝癌患者手术切除标本20例,分别采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法和Western blot法检测POLD1...     

野生型p53对肝癌细胞POLD1基因表达及细胞恶性表型的影响

目的:探讨野生型p53对人肝癌细胞SMMC-7721细胞增殖和细胞恶性表型影响的一种可能机制,方法:设计并构建p53特异性小干扰shRNA绿色荧光真核表达质粒(p53-siRNA)和表达EGFP-p53融合蛋白的p53绿色荧光真核增强表达质粒(pEGFP-p53),通过脂质体Lipofection-2000介导转染,将...     

低表达Smad4对肝癌细胞SMMC-7721上皮间质转化的影响

目的:探讨低表达Smad4调控上皮间质转化影响肝癌细胞(hepatocellular carcinoma cells,HCC)侵袭转移的相关机制.方法:采用Western blot法观察低表达Smad4对β-catenin和Vimentin总蛋白表达水平的影响;逆转录PCR法测定低表达Smad4后,β-catenin和VimentinmRNA表达的变化;细胞免疫荧光法检测Smad4、β-catenin和Vimentin在肝癌细胞SMMC-7721及其转染组中的定位及荧光表达强度.结果:低表达Smad4后,相较于CON组和RNAi-NC组,在转染组RNAi-Smad4-2和RNAi-Smad4-12细胞中,β-cateninmRNA和相应总蛋白的表达水平明显增加(P<0.05),并促使其发生了核转位的改变;另一方面,在RNAi-Smad4-2和RNAi-Smad4-12两转染组细胞中,Vimentin的蛋白表达水平和相应胞浆荧光的表达强度比对照组明显下调(P<0.05),相应mRNA的表达水平在肝癌SMMC-7721细胞及其转染组无显著差异.结论:低表达Smad4可调控上皮间质转化相关标志物β-catenin和Vimentin的表达,发挥抑制肝癌SMMC-7721细胞上皮间质转化的作用.     

短发夹状RNA对人肝癌细胞环氧合酶-2的抑制作用

目的:构建针对人环氧合酶-2(COX-2)基因编码区的短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体质粒,观察其在不同时间点对人不同肝癌细胞株COX-2表达的影响.方法:以人COX-2mRNA编码区作为RNA干扰靶点,构建shRNA真核表达载体质粒WBH1和WBH2,应用阳离子脂质体分别转染人肝癌细胞株HepG2和Bel7402,利用逆转录聚合酶链反应和Westernblot法分别观察两株细胞转染后24,48,72,和96hCOX-2mRNA和蛋白的表达变化,检测抑制效果.结果:质粒在HepG2细胞和Bel7402细胞中的转染率分别约为60%和54%.WBH1导入细胞24,48,72和96h后,逆转录聚合酶链反应检测COX-2mRNA表达抑制率,HepG2细胞分别为18.5%,88.6%,52.8%和42.4%(P<0.01).Bel7402细胞分别为9%,45.1%,70.1%和56.3%(P<0.01).Westernblot法检测蛋白表达抑制率,HepG2细胞分别为10.3%,80.5%,45.3%和39.0%(P<0.01);Bel7402细胞分别为8.3%,40.2%,66.4%和35.6%(P<0.01).质粒WBH2对COX-2的表达无影响(P>0.05).结论:针对人COX-2的shRNA能高效特异的抑制不同肝癌细胞株的COX-2表达.HepG2细胞和Bel7402细胞分别以48h和72h抑制效果最明显.56.3%(P<0.01).Westernblot法检测蛋白表达抑制率,HepG2细胞分别为10.3%,80.5%,45.3%和39.0%(P<0.01);Bel7402细胞分别为8.3%,40.2%,66.4%和35.6%(P<0.01).质粒WBH2对COX-2的表达无影响(P>0.05).结论:针对人COX-2的shRNA能高效特异的抑制不同肝癌细胞株的COX-2表达.HepG2细胞和Bel7402细胞分别以48h和72h抑制效果最明显.     

CDK4基因突变及其胰蛋白酶-抗胰蛋白酶失衡在胃癌发生中的作用

目的探讨胃癌患者中细胞周期蛋白依赖激酶基因(cell cycle-dependent protein kinase 4,CDK4)突变及其胃癌组织CDK4表达和血清胰蛋白酶-抗胰蛋白酶的失衡情况。方法应用PCR法扩增25例胃癌患者及62名健康体检者的CDK4基因外显子、启动子和侧翼序列,产物纯化后直接测序,分析不同基因型胃癌患者的临床特征,取患者的癌组织、癌旁组织和远离癌的正常组织做CDK4免疫组化,同时应用ELISA法检测同一时期患者及其对照的血清胰蛋白酶和α-抗胰蛋白酶水平,分析其差异性。结果在胃癌患者中发现CDK4基因3号外显子存在高频突变,其中5例患者为c.110 TA突变,突变造成p.M37T;免疫组化显示,癌组织高表达CDK4,癌旁组织呈弱表达,远离癌的正常组织呈阴性;胃癌患者的血清胰蛋白酶浓度(33.98±11.24)ng/ml显著高于正常对照组(15.96±18.23)ng/ml,而血清抗胰蛋白酶浓度与正常对照组相比,差异无统计学意义(P0.05)。结论 CDK4基因突变及其高表达与胃癌发生密切相关,机体内胰蛋白酶-抗胰蛋白酶的失衡可能是胃癌发病的重要原因。     

小鼠IL-4真核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠白介素-4(murine interleukin-4,mIL-4)的真核表达载体,并研究其在293T细胞中的表达。方法 RT-PCR扩增小鼠IL-4基因后,克隆到真核表达载体pcDNA3.0上,利用电泳和测序鉴定重组质粒的大小、序列。脂质体转染法将重组质粒pcDNA3.0-mIL-4转入293T细胞中,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测其表达。结果经酶切和测序鉴定重组质粒pcDNA3.0-mIL-4构建成功,并在293T细胞中成功表达。结论 pcDNA3.0-mIL-4可在真核细胞中成功表达,为进一步研究其在炎症性肠病(IBD)动物模型中的生物学功能提供了条件。