左卡尼汀通过内质网应激ATF6通路抑制高糖诱导的HAECs凋亡

目的:探讨左卡尼汀对高糖诱导的人主动脉内皮细胞(HAECs)凋亡的影响及相关分子机制。方法:以高糖培养基培养HAECs并诱导其发生凋亡,同时以不同浓度(50、100和200μmol/L)的左卡尼汀对HAECs进行处理。以MTT法对细胞活力进行检测;Hoechst 33258染色及流式细胞术评估细胞凋亡情况;比色法对HAECs的caspase-3活性进行检测;Western blot法对细胞内质网应激信号通路蛋白及磷酸化水平进行分析。结果:高糖培养诱导HAECs产生凋亡并显著抑制细胞活力。高糖培养的HAECs中产生内质网应激,其蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、肌醇需酶1(IRE1)及活化转录因子6(ATF6)信号通路均被显著激活,能够通过下游caspase-4/3级联瀑布反应诱导细胞凋亡。然而,左卡尼汀能够显著减少高糖诱导的HAECs细胞凋亡,使细胞存活率升高,且呈现出浓度依赖性。左卡尼汀可显著降低高糖培养HAECs诱发的内质网应激,通过下调位点1蛋白酶(S1P)及位点2蛋白酶(S2P)表达降低其对ATF6剪切形成的促凋亡因子ATF6 p50的水平;而左卡尼汀并未对PERK及IRE1信号通路活性表现出抑制作用。结论:左卡尼汀能够抑制高糖对HAECs凋亡的诱导作用,其作用机制可能为抑制内质网应激相关的ATF6信号通路。     

ATF6调控生殖相关基因HSPA1L表达的分子机制

目的 探究内质网应激活化转录因子6(ATF6)对生殖相关基因热休克蛋白A1样蛋白(HSPA1L)表达的影响并初步阐明其调控分子机制。方法 在人胚肾细胞系HEK-293T中转染ATF6过表达质粒,RT-qPCR和Western blot验证过表达效率;利用雄性ATF6敲除小鼠睾丸组织转录物组测序信息,筛选ATF6下游5个生殖相关基因;双荧光素酶报告基因实验选择启动子活性较高的下游基因并检测过表达ATF6对其启动子活性的影响;通过gene-regulation预测ATF6和下游基因启动子可能的结合位点;RT-qPCR和Western blot检测在HEK-293T细胞中过表达ATF6对于下游基因表达的影响;利用凝胶迁移实验(EMSA)确定ATF6与下游基因启动子是否结合。结果 转染后HEK-293T细胞中ATF6的mRNA(P<0.001)和蛋白(P<0.05)表达水平明显升高。转录物组测序及双荧光素酶报告基因实验筛选出ATF6下游的生殖相关基因HSPA1L。ATF6能够促进HSPA1L的截短启动子活性(P<0.001)。过表达ATF6后,HSPA1L的表达量明显升高(P...     

慢性阻塞性肺疾病中转录因子ATF3/ATF4与Nrf2的表达及相互作用

目的: 研究活化转录因子3(ATF3)、活化转录因子4(ATF4)和红系衍生核因子相关因子2(Nrf2)在慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者体内的表达变化,探讨ATF3、ATF4与Nrf2蛋白之间的相互作用。方法: 肺组织标本取自40例肺肿瘤行肺叶切除者,于远离病灶处取材,诊断符合COPD者入选COPD组(20例),不符合者入选对照组(20例)。取两组患者的肺组织,原位杂交和免疫组化检测ATF3、ATF4和Nrf2 mRNA及蛋白表达水平。复制COPD大鼠模型,应用免疫共沉淀法(Co-IP)研究ATF3、ATF4与Nrf2蛋白之间的相互关系。结果: (1) COPD组患者第1秒用力呼气容积/用力肺活量(FEV₁/FVC)和第1秒用力呼气容积占预计值百分比(FEV₁%预计值)明显低于对照组(均P<0.01)。(2)COPD大鼠肺功能 (FEV_0.3、FEV_0.3/FVC和PEF)较对照组显著恶化(均 P<0.01)。(3)免疫组化显示COPD组ATF3、ATF4和Nrf2蛋白水平较对照组升高(均 P<0.01)。(4)原位杂交结果显示ATF3和ATF4 mRNA表达水平在COPD组显著高于对照组(均P<0.01),而Nrf2 mRNA在两组表达无明显差异(P>0.05)。(5) Co-IP结果显示在Nrf2抗体捕获的免疫沉淀中,ATF3和ATF4抗体均可杂交出明显的蛋白条带(P<0.05)。 结论: 氧化应激状况下ATF3和ATF4表达明显上调,通过与Nrf2之间的相互作用,可能转录调控Nrf2靶基因的表达,在COPD的氧化／抗氧化失衡中发挥生物学作用。     

RNA干扰ATF5基因下调NF-κB信号诱导脑胶质瘤细胞凋亡

目的:探讨RNA干扰转录激活因子5(ATF5)基因表达对脑胶质瘤细胞活力、凋亡率及NF-κB信号通路的影响。方法:将设计合成的ATF5特异性siRNA(siATF5组)和阴性对照siRNA(NC组)分别转染人脑胶质瘤U251细胞,采用NF-κB信号通路抑制剂PDTC处理细胞,MTT法、流式细胞术及Western blot法分别检测细胞活力、凋亡率及ATF5、血管内皮生长因子(VEGF)、环氧化酶2(COX-2)、 p-p65、p-IκB和Bax的蛋白水平。结果:转染siATF5的U251细胞中ATF5的蛋白表达显著低于空白对照组(P0.05)。与空白对照组比较,siATF5组细胞活力明显降低,凋亡率明显升高,VEGF、COX-2、 p-p65和p-IκB的蛋白水平明显降低,Bax的蛋白水平明显升高(P0.05)。与siATF5组相比,siATF5和PDTC同时处理的U251细胞活力显著降低,凋亡率显著升高(P0.05)。结论:下调ATF5基因表达可降低脑胶质瘤细胞的活力,诱导细胞凋亡,降低免疫抑制因子VEGF和COX-2表达,其机制可能与下调NF-κB信号通路有关。     

ATF4靶向AKT1对膝关节软骨细胞凋亡及软骨退变的影响

目的 探讨活化转录因子4(ATF4)靶向蛋白激酶B(AKT1)对膝关节软骨细胞凋亡及软骨退变的影响。方法 体外实验：(1)体外培养正常软骨细胞与骨关节炎（OA）软骨细胞,实时荧光定量PCR检测两组细胞内ATF4、AKT1的mRNA表达水平;(2)通过细胞转染法构建下调ATF4的OA软骨细胞;(3) MTT法及Annexin V/PI流式细胞术检测OA软骨细胞增殖及凋亡情况;(4)生物信息学预测ATF4靶向基因结合位点,双荧光素酶报告基因实验验证ATF4与AKT1的靶向关系;(5)共同转染构建ATF4下调及AKT1上调的OA软骨细胞,同样的方法检测其细胞增殖及凋亡情况。动物实验：取6个月月龄雄性Duncan豚鼠30只,随机均分为3组,A、B两组皮下均植入Alzet微量泵,ATF4组每天泵注含PBS稀释过的ATF4,PBS组泵注单纯PBS液,取豚鼠膝关节软骨,评估3组Mankin组织评分及膝关节软骨组织内IL-1及TNF-α水平。结果 与正常软骨细胞相比,OA软骨细胞ATF4 mRNA表达量均显著上升（P<0.05）,AKT1mRNA表达量均显著下降（P<0.05）。ATF4-...     

ATF4基因在小鼠动情周期中子宫内膜的表达

目的探讨转录激活因子4(ATF4)在小鼠动情周期中子宫内膜的表达规律。方法采用RT-PCR、免疫组织化学和Western blot法分别检测小鼠子宫内膜中ATF4 mRNA和蛋白在动情前期、动情期、动情间期和动情后期的表达规律。结果 ATF4 mRNA在动情期表达显著高于其他3期(P0.05);ATF4蛋白主要在腺上皮细胞和腔上皮细胞胞质表达,其表达规律与RT-PCR的结果基本一致。结论 ATF4在小鼠动情周期子宫内膜中呈动态表达,提示ATF4可能参与了动情周期子宫内膜变化的调控。     

内质网应激中活化转录因子6通路及相关调控因子对未折叠蛋白反应的调控

目的内质网应激在多种疾病的发病机制中起到关键作用,持续或强烈的内质网应激反应可诱导细胞凋亡。作为一种内质网跨膜蛋白,活化转录因子6(ATF6)可以感受内质网应激并传递信号诱导未折叠蛋白反应。我们主要对ATF6通路以及其调控凋亡的机制进行综述,重要概述了相关激活剂和抑制剂,希望能为一些神经退行性疾病的治疗提供参考。     

ATF4重组慢病毒抑制C2C12细胞增殖并促凋亡

目的 构建人活性转录因子4(ATF4)慢病毒,探讨C2C12细胞成骨分化过程中ATF4基因慢病毒修饰对其增殖和凋亡的影响.方法 构建ATF4重组慢病毒载体质粒,然后与2个包装质粒共转入293T细胞中包装成ATF4慢病毒(LV-ATF4);用病毒感染C2C12细胞,并用流式细胞仪(FCM)检测BMP2诱导C2C12细胞分化时对其增殖凋亡的影响,免疫印迹法检测凋亡相关蛋白的表达,电子显微镜观察凋亡细胞的形态学结构变化.结果 成功构建和包装了ATF4重组慢病毒.FCM检测结果表明,BMP2+ LV-ATF4处理组S期细胞(14.89％)低于BMP2+ LV-GFP组(30.64％) (P ＜0.05);BMP2+ LV-ATF4处理组细胞凋亡率(31.06％)高于BMP2+ LV-GFP组(11.39％)(P＜0.05);凋亡相关蛋白的表达与FCM结果一致.结论 在BMP2诱导C2C12细胞成骨分化时,LV-ATT4慢病毒可促进C2C12细胞的凋亡,抑制其增殖.     

ATF4对皮肤癌细胞增殖的影响及相关机制

目的：探讨沉默/过表达ATF4对人皮肤癌细胞增殖的影响及其相关作用机制。方法：Western blot技术检测不同类型皮肤癌细胞中ATF4的蛋白表达水平。构建ATF4沉默/过表达的A431皮肤癌细胞株,采用CCK-8法、克隆形成实验和流式细胞术检测A431细胞增殖能力的变化及细胞周期分布;Western blot技术检测细胞周期调控因子cyclin D1、cyclin E、P21和p-Rb/Rb的蛋白表达水平。结果：ATF4在3种不同类型的皮肤癌细胞中均呈高表达。CCK-8法和克隆形成实验结果显示沉默ATF4的A431细胞存活率和增殖能力均显著降低(P<0.05),而过表达ATF4可促进A431细胞的增殖;流式细胞仪检测结果显示沉默ATF4可明显抑制A431细胞从G0/G1期向S期转换,过表达ATF4则促进其G1/S转换。同时Western blot实验结果显示沉默ATF4后,cyclin D1、cyclin E和p-Rb的蛋白水平均显著降低,而P21的蛋白表达显著增加(P<0.05),过表达ATF4后则cyclin D1、cyclin E和p-Rb的蛋白水平显著增加,而P21的蛋白表达显著降低(P<0.05)。结论：ATF4能够促进人皮肤鳞状细胞癌细胞株A431的增殖,其潜在作用机制可能与促进细胞周期G1/S转换及影响相关周期调控因子的表达有关,提示AT F 4可作为治疗皮肤癌的一个潜在作用靶点。