条件培养对骨髓间质干细胞体外成骨潜能的影响

目的：骨髓间质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)有多种分化的潜能，但其分化并非是一个完全自发的过程，探讨使用条件培养基对MSCs体外成骨潜能的影响，为优化骨组织工程的种子细胞提供实验依据。方法：采用条件培养(A组)与完全培养(B组)基两种方法将兔骨髓间质干细胞进行体外培养后，对各组细胞进行形态学观察、组织学检测以及采用碱性磷酸酶(ALP)与骨钙素检测试剂盒进行定量分析，以判断两种培养基对骨髓间质干细胞体外成骨能力的影响。结果：在细胞传代培养中A组细胞增殖速度明显低于B组。A组细胞随培养时间的延长细胞呈多层生长，不发生接触抑制现象。而B组随时间的延长，细胞间逐渐出现接触抑制，细胞分裂停止，逐渐死亡。ALP含量A组为(8．17&;#177;0．61)U／L，B组为(5．07&;#177;0．49)U／L。骨钙素含量A组为(25．38&;#177;1．06)μg／L，B组为(14．37&;#177;1．71)μg／L，A，B两组比较差异均有显著性意义(P&;lt;0．05)。结论：体外培养的MSCs具有一定的成骨能力，使用含有地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的条件培养基可以大大提高其成骨能力。     

胎儿骨髓间质干细胞的获得和诱导成软骨培养

目的:研究胎儿骨髓间质干细胞(MSCs)体外分离、培养、扩增并向软骨细胞表型转化,探究新的组织工程化软骨种子细胞的来源。方法:从引产胎儿(家属自愿捐献)髂骨获得骨髓,体外培养从骨髓中获得的MSCs,以流式细胞仪检测细胞表面抗原。将传代后的MSCs在诱导培养液中培养,检测软骨细胞的特异性标志物。结果:从胎儿骨髓得到的细胞表达MSCs的表面标志物,并可在体外培养、扩增,诱导后细胞变为多伪足的多边形细胞,扫描电镜见细胞表面有丰富的交联,透射电镜观察见大量粗面内质网、高尔基体、线粒体。甲苯胺蓝染色见细胞内有异染性基质(免疫组化和RT-PCR检测COLⅡ表达阳性。结论:胎儿MSCs可作为软骨组织工程的较理想的种子细胞。     

兔骨髓基质干细胞成骨诱导及复合培养的生长状况

目的：研究体外培养的兔骨髓基质干细胞的成骨诱导及复合培养生长状况。方法：体外培养兔骨髓基质干细胞，向成骨细胞方向诱导分化，并接种于三维多孔羟基磷灰石材料上，观察其体外生长状况。结果：体外培养条件下，骨髓基质干细胞容易存活，可向成骨细胞转化，并能在支架材料上贴附生长。结论：骨髓基质干细胞可在体外培养条件下大量增殖，向成骨细胞转化，并能在三维多孔羟基磷灰石材料上贴附生长。     

兔骨髓基质干细胞成骨诱导及复合培养的生长状况

目的:研究体外培养的兔骨髓基质干细胞的成骨诱导及复合培养生长状况。方法:体外培养兔骨髓基质干细胞,向成骨细胞方向诱导分化,并接种于三维多孔羟基磷灰石材料上,观察其体外生长状况。结果:体外培养条件下,骨髓基质干细胞容易存活,可向成骨细胞转化,并能在支架材料上贴附生长。结论:骨髓基质干细胞可在体外培养条件下大量增殖,向成骨细胞转化,并能在三维多孔羟基磷灰石材料上贴附生长。     

辛伐他汀对幼鼠骨发育及骨髓基质干细胞成骨分化的影响

背景:辛伐他汀作为常用降脂类药物,表现出一定的促成骨分化和骨形成作用,但目前的研究结果尚有争论,尤其对幼鼠骨发育的影响并无报道.目的:课题创新性设计观察辛伐他汀对幼鼠骨小梁骨形成相关因子表达以及骨髓基质干细胞成骨分化的影响.方法:1周龄雄性SD大鼠20只,随机分为实验组和对照组,每组10只.实验组皮下注射辛伐他汀[5 mg/(kg·d)]2周,对照组给与安慰剂2周.采用免疫组织化学方法检测胫骨上端骨小梁成骨相关因子骨形态发生蛋白2、基质金属蛋白酶13、血管内皮生长因子等因子的表达情况;取双侧股骨骨髓基质干细胞向成骨方向诱导培养.培养14 d分别进行碱性磷酸酶染色,21 d采用Real-time PCR法检测骨形态发生蛋白2、RUNX2、Osterix、MSX2、DLX3、DLX5等成骨过程中相关因子mRNA的表达,28 d进行von Kossa染色.结果与结论:①实验组和对照组胫骨上端骨小梁骨形态发生蛋白2、基质金属蛋白酶13、血管内皮生长因子等因子的表达差异无显著性意义.②两组碱性磷酸酶染色阳性细胞(胞浆蓝黑色)比例均在30％左右,差异无显著性意义(P＞0．05).③骨髓基质干细胞向成骨细胞诱导分化过程中相关因子骨形态发生蛋白2、RUNX2、Osterix、DLX3、DLX5、MSX2 mRNA表达水平差异无显著性意义.④von Kossa染色可见大小不等染为棕黑色的钙化点,其大小和密度两组比较差异无显著性意义.结果表明,皮下注射辛伐他汀[5 mg/(kg·d)]2周不能显著影响幼鼠骨小梁骨形成相关因子表达以及骨髓基质干细胞成骨分化.     

中药生肌液对体外培养兔骨髓间充质干细胞成骨活性的影响

背景：在临床工作中，外用中药生肌膏能治疗感染开放性骨折引起的骨缺损。其机制可能为生肌膏中作者前期实验从生肌膏的原料生药中提取了生肌液，并证实不同浓度的生肌液对骨髓间充质干细胞的增殖活性影响不同。有效成分促进骨髓间充质干细胞的增殖，并诱导其向成骨细胞转化。目的：观察生肌液对体外培养的兔骨髓间充质干细胞成骨活性的影响。设计：单一样本实验。单位：天津市天津医院骨科研究所。材料：实验于2004—10／2005—12在天津市天津医院骨科研究所细胞工程室完成。骨髓间充质干细胞取自5只3月龄的雄性健康日本大耳白兔。浓度为5×10^2g／L生肌液从生肌象皮膏（由天津市中药饮片厂提供。原料生药当归、生地、龟板、象皮、血余）提取。方法：将25，8．3，5g／L的生肌液作用于兔骨髓间充质干细胞，以不含生肌液的基础培养液为空白对照，以含地塞米松10^-8mol／L，维生素C0．05g／L，β-甘油磷酸钠10mmol／L的基础培养液为标准对照。将不同干预条件下传代后的骨髓间充质干细胞接种在培养板中培养二三周，采用荧光倒置显微镜下观察钙结节形成情况，采用四环素标记及胶原Ⅰ免疫组织化学染色观察细胞的表达情况，取细胞培养液测定胞外及胞内碱性磷酸酶、骨钙素、乳酸脱氢酶含量，将细胞内外碱性磷酸酶、骨钙素、乳酸脱氢酶数量各自加和，计算碱性磷酸酶，乳酸脱氢酶、骨钙素，乳酸脱氢酶值。主要观察指标：培养2，3周兔骨髓间充质干细胞钙结节形成、四环素标记及胶原Ⅰ免疫组织化学染色结果及碱性磷酸酶，乳酸脱氢酶、骨钙素，乳酸脱氢酶值。结果：①细胞钙结节观察结果：除了标准对照细胞外，不同浓度生肌液条件下细胞随培养时间延长，胞体先后出现拉长，聚集生长，随后中心细胞增殖、重叠，细胞之间界限模糊，逐渐形成多个散在的细胞结节，钙沉积逐渐出现，最终形成钙化结节。②四环素标记及胶原Ⅰ免疫组织化学染色：除了基础培养液组外，各实验组四环素标记呈阳性的细胞及钙结节在荧光激发下呈黄绿色，空白对照细胞为阴性；除了标准对照细胞外，不同浓度生肌液条件下细胞胶原Ⅰ免疫组织化学染色呈阳性，棕黄色深染颗粒位于细胞胞浆中。③碱性磷酸酶，乳酸脱氢酶、骨钙素，乳酸脱氢酶检测结果：条件培养后2，3周，25g／L生肌液作用下细胞碱性磷酸酶，乳酸脱氢酶、骨钙素，乳酸脱氢酶比值高于其他条件下两种含量比值，差异具有统计学意义（P〈0．05）。结论：生肌液对体外培养的兔骨髓间充质干细胞的诱导成骨作用肯定，且高浓度时诱导成骨作用较强。     

人血小板裂解液对骨髓间质干细胞成骨成脂分化的影响

目的探讨人血小板裂解液(HPL)体外培养人骨髓间质干细胞(MSCs)及其对MSCs成骨和成脂分化能力的影响。方法采用贴壁法分离培养3株人骨髓来源MSCs,每株细胞在培养时平行分为2个实验组,分别用含10%胎牛血清的低糖培养基和含7.5%HPL的低糖培养基培养,均培养MSCs至第5代,分别用成骨及成脂诱导液对每组MSCs做成骨、成脂分化诱导,诱导成功后分别用茜素红、油红O对成骨和成脂分化结果染色鉴定,并进一步对成骨、成脂诱导结果做定量分析:成骨分化染色后洗脱茜素红在562nm波长下测定OD值并对每个培养孔细胞做蛋白定量,以茜素红OD值与蛋白定量值的比值作为成骨分化的定量值;成脂分化染色后用异丙醇洗脱油红O,在510nm波长下测定OD值,以之作为成脂分化的定量值。对所得的结果做统计学分析。结果对第5代的MSCs做成骨诱导12d后,光镜下可见致密结节形成,茜素红染色及定量鉴定结果显示2种培养液培养的MSCs均能成功向成骨细胞分化,而7.5%HPL培养的MSCs成骨能力比10%FBS培养的MSCs强,定量鉴定结果分别为16.548±4.397、4.151±5.631(P<0.05)。成脂诱导12d后,细胞内有明显脂滴形成,油红O染色及定量分析结果显示MSCs成功向脂肪细胞分化,但7.5%HPL培养的MSCs成脂能力与10%FBS培养的MSCs相比较弱,定量鉴定结果分别为0.239±0.030、0.497±0.105(P<0.05)。结论 HPL可以促进MSCs成骨分化,抑制其成脂分化。     

人骨髓间质干细胞向成骨细胞分化的形态学研究

目的:研究人骨髓间质干细胞(hMSCs)体外培养并向成骨细胞表型转化过程中的形态学改变。方法:在成骨特定诱导培养液中培hMSCs。在相差显微镜和电子显微镜下观察细胞形态,苏木精-伊红染色观察形态,组织化学法检测碱性磷酸酶(ATP)、Ca结节染色,免疫组化检测Ⅰ型胶原(COLⅠ)、骨钙素(OC)表达。结果:诱导培养的hMSCs形态由成纤维样梭形向多边形转变,透射电镜观察见大量扩张的粗面内质网、高尔基体、线粒体和钙盐沉积,扫描电镜见细胞表面有大量钙盐颗粒。诱导培养后7,14,21d可见ALP染色、COLⅠ免疫组化染色阳性,诱导培养后14,21d可见OC免疫组化染色、Ca结节染色阳性。结论:hMSCs在特定培养液诱导下可表现为典型的成骨细胞形态,可作为骨组织工程的种子细胞。     

脉冲电磁场对小鼠骨髓间充质干细胞体外成骨分化的影响

背景:间充质干细胞的增殖分化缺乏可调控性,结合适当载体后不能高效增殖分化是阻碍其进入临床的瓶颈.脉冲电磁场若能有效调控干细胞向骨源细胞分化将具有重要的临床价值.目的:观察脉冲电磁场刺激后,小鼠骨髓间充质干细胞体外成骨分化情况.设计、时间及地点:细胞学体外对照观察,于2004-0512007-10在华中科技大学同济医学院附属普爱医院骨科实验室完成.材料:BALB/C小鼠20只,由同济医学院实验动物中心提供.脉冲电磁场发生器由海军工程大学电机系设计与制造.方法:无菌分离小鼠双侧股骨,Percoll密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞,再用贴壁筛选法纯化扩增.取生长良好的第3代细胞,调整细胞密度为2×10~7L~(-1)接种于6孔板,分成4组:空白对照组加入完全培养基组;脉冲电磁场组给予50 Hz、正弦波形、强度1 mT的脉冲电磁场辐射,2次/d,30 min/次,间隔12 h,共10 d;成骨诱导组加入含地塞米松、甘油磷酸钠、VitC的完全诱导培养基;脉冲电磁场+成骨诱导组给予相同的脉冲电磁场辐射后加入完全诱导培养基.主要观察指标:骨髓间充质干细胞的分化情况.结果:碱性磷酸酶染色结果显示,干预10 d后,空白对照组为阴性;脉冲电磁场组呈弱阳性:成骨诱导组呈阳性;脉冲电磁场+成骨诱导组呈强阳性.与空白对照组比较,成骨诱导组、脉冲电磁场+成骨诱导组I型胶原免疫组化染色吸光度值均明显升高(P<0.05,P<0.01).结论:50 Hz、正弦波形、强度1 mT脉冲电磁场干预一定时间后,能够增强小鼠骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶及I型胶原的表达,促进其分化成骨.     

纳米羟基磷灰石对人骨髓基质干细胞体外成骨活性的影响

目的：观察人骨髓基质干细胞在纳米羟基磷灰石材料上的生长、分化特点以及成骨细胞形态. 方法：实验于2004-03/2005-07在中南大学湘雅医院医学实验室完成.①实验方法：采用密度梯度离心的方法分离人骨髓基质干细胞,加入含体积分数为0.1的新生牛血清的低糖DMEM完全培养基中作原代培养,细胞长至90%汇合时传代,取培养第3代细胞接种于纳米羟基磷灰石（卫生部肝胆肠研究中心纳米课题组提供）表面,并加入含1 mmol/L地塞米松、50 mg/L维生素C、10 mmol/L β-甘油磷酸钠的培养基中诱导分化、培养.②观察指标：复合培养第2,4,6,8天后采用MTT法检测细胞增殖情况;复合培养7 d后行钙-钴法成骨细胞染色观察细胞分化情况;培养8 d后应用扫描电子显微镜观察细胞在材料上的生长情况. 结果：MTT法检测出的吸光值随着培养时间的增加而增大（P＜0.05）;经加入特定的成骨诱导体系培养7 d后,附着于材料的骨髓基质干细胞具有典型的成骨细胞形态,经钙-钴法染色后细胞胞浆中可见灰黑色颗粒或块状沉淀的阳性反应,细胞形态也多呈多角形或短矩形;培养8 d后扫描电镜可观察到材料孔隙内有细胞长入. 结论：人骨髓基质干细胞在纳米羟基磷灰石材料上生长良好,提示纳米羟基磷灰石适于骨髓基质干细胞的生长、分化,可作为骨组织工程的细胞外支架材料.     

脐血间充质干细胞体外培养方法的改良及其成骨分化能力

目的:采用两种改良方法体外分离培养脐血间充质干细胞,并观察其成骨分化能力。方法:实验于2006-05/09在上海交通大学医学院附属第九人民医院骨与关节中心细胞实验室完成。①所用28份脐血标本由复旦大学医学院附属妇产科医院提供,取自足月健康顺产新生儿,产妇和家属均书面同意,实验经医学伦理委员会批准。②采集28份脐血标本,50～90mL/份,枸橼酸抗凝。采集后12h内密度梯度离心法分离出单个核细胞,接种于100mm×20mm培养皿中,细胞浓度为1×1010L-1,置于含体积分数为0.1胎牛血清的α-MEM培养液中原代培养,5～7d后半量换液,后每隔3～4d全量换液一次。③细胞贴壁后,分两组予以改良培养。改良1组10份,当培养皿底圆形巨核细胞融合、梭形成纤维样细胞脱落时将细胞悬液移入新的培养皿中培养;改良2组18份,待培养皿底圆形巨核细胞渐渐占据优势时,将培养基更换为含体积分数为0.15小牛血清的α-MEM,当圆形巨核细胞大部脱落后换回含体积分数为0.1胎牛血清的α-MEM培养基。成纤维样细胞融合至80%～90%时胰酶消化,按1∶2或1∶3传代培养。④显微镜下观察脐血间充质干细胞的形态。取第5代脐血间充质干细胞,采用流式细胞仪测定细胞免疫表型,以碱性磷酸酶法检测成骨分化能力。结果:①28份脐血间充质干细胞中,共20份原代培养中出现贴壁细胞(改良1组6份,改良2组14份),其中13份培养出能融合且可稳定传代的成纤维样细胞(改良1组4份,改良2组9份),成功率46.4%。②原代培养5～7d后贴壁细胞呈梭形成纤维样细胞和圆形巨核细胞。改良1组与2组于原代培养5周可见成纤维样细胞集落,细胞形态与骨髓间充质干细胞相似,呈较均一的长梭形,传至22代形态无明显变化。③可强烈表达CD29、CD105等间充质干细胞表面标志,而不表达CD34、CD45和CD106等造血干细胞和内皮细胞标志。④成骨诱导1周,脐血间充质干细胞可分化为成骨细胞,碱性磷酸酶染色呈阳性。结论:脐血中存在的单个核细胞经过改良培养后,可提高脐血间充质干细胞的培养成功率。脐血间充质干细胞具有与其他来源的单个核细胞类似的表型及成骨分化潜能,且易于体外扩增、传代稳定。     

损伤肝脏条件培养液体外诱导小鼠骨髓单个核细胞分化为肝细胞的研究

目的探索小鼠骨髓单个核细胞（BMMNCs）体外诱导分化为肝细胞的可行性及方法。方法将四氯化碳注射的小鼠肝脏进行培养，收集上清液，用于诱导BMMNCs分化。观察细胞分化中的形态变化；在1、7、14、21d时，逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）和免疫荧光反应检测甲胎蛋白（AFP）、细胞角蛋白18（CK18）、CK19、肝细胞核因子3β（HNF3β）、酪胺酸胺基转移酶（TAT）和白蛋白（ALB）基因的表达，过碘酸Schiff氏剂反应（PAS）检测细胞糖原合成。结果诱导组细胞呈肝细胞样变化；RT—PCR检测，第7天可见AFP、CK19基因表达，第14天AFP表达增强，第21天减弱；第14天可见ALB、CK18、HNF3β基因表达，且持续到第21天；第21天TAT表达。免疫荧光反应结果显示，第21天ALB、CK18、CK19、AFP表达呈阳性；同时PAS糖原合成反应也出现阳性。结论BMMNCs在损伤肝脏条件培养液诱导下可跨越分化为肝细胞，该方法的建立对分化机制研究有重要意义。     

梯度血清递减体外培养人脐带间充质干细胞

背景：人脐带间充质干细胞的扩增与培养条件密切相关,而含体积分数10%-20%胎牛血清的培养基可促进细胞生长。目的：建立梯度血清递减扩增培养脐带间充质干细胞的培养技术。方法：采用胶原酶Ⅱ消化分离获得脐带间充质干细胞悬液,并通过贴壁培养进行纯化,细胞贴壁后采用梯度血清递减方法,即第1代80%含血清培养基,20%无血清培养基;第2代50%含血清培养基,50%无血清培养基;第3代20%含血清培养基,80%无血清培养基;第4代100%无血清培养基。另一种传代中始终采用含体积分数10%胎牛血清的α-MEM完全培养液。用流式细胞仪检测细胞的表面标记,进行成骨诱导试验,同时与经典的含10%胎牛血清的α-MEM培养体系进行比较。结果与结论：梯度血清递减培养法与经典α-MEM培养体系所获得的细胞在扩增能力、细胞形态、免疫表型等方面相似。细胞在两种培养体系中均能保持良好的分化潜能。但梯度血清浓度法培养间充质干细胞可使用更少量胎牛血清,提高临床应用安全性。     

人骨髓间充质干细胞的体外培养、鉴定及成骨分化

背景：国内外对骨髓间充质干细胞的体外成骨诱导分化研究手段、测定指标均不够全面。目的：建立并完善一整套人骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定方法,探讨其体外成骨分化能力。方法：采用密度梯度离心法分离培养人骨髓间充质干细胞,流式细胞仪鉴定细胞表面表型。传至第3代时更换成骨诱导培养基进行成骨分化诱导。结果与结论：人骨髓间充质干细胞生长旺盛,传代后增殖旺盛,第3代骨髓间充质干细胞表面表型CD44、CD73、CD90表达阳性,CD34表达阴性。诱导后的成骨细胞碱性磷酸酶活性增加,Gomori、Vonkossa、茜素红染色均阳性。RT-PCR检测诱导后细胞有Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶、骨钙素、骨唾液酸蛋白、骨桥蛋白及骨连接蛋白基因的表达,证明了人骨髓间充质干细胞成功向成骨方向分化。表明实验建立了一整套稳定、成熟的骨髓间充质干细胞分离、培养、扩增方案。     

脑脊液体外培养骨髓间充质干细胞

背景：细胞移植是脊髓损伤的一种有效治疗手段,但目前尚缺乏脑脊液对细胞影响的实验依据。目的：动态观察体外脑脊液培养骨髓间充质干细胞的变化。方法：采用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,并传代扩增。选择生长良好的第3,4代细胞接种于脑脊液中,通过细胞免疫化学染色法鉴定脑脊液对细胞表型的影响。取生长良好的第5代细胞,分别用含小牛血清的L-DMEM和脑脊液培养。结果与结论：运用密度梯度离心结合贴壁培养法能成功有效地分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,表型鉴定结果为CD90、CD106、CD71、CD29阳性,CD45阴性。脑脊液培养后细胞仍为骨髓间充质干细胞形态,并可见少量小圆细胞,表现为神经样细胞,表形鉴定结果为CD90、CD106、CD71、CD29阳性,CD45阴性,神经元特异性烯醇化酶呈弱阳性（〈1%）。细胞具有相似的S形生长曲线,生长曲线基本相似。提示骨髓间充质干细胞在脑脊液培养基中可继续生长和增殖,无诱导分化作用,且细胞对生长环境有高度的适应性。     

脑脊液体外培养骨髓间充质干细胞

背景:细胞移植是脊髓损伤的一种有效治疗手段,但目前尚缺乏脑脊液对细胞影响的实验依据.目的:动态观察体外脑脊液培养骨髓间充质干细胞的变化.方法:采用密度梯度离心结合贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,并传代扩增.选择生长良好的第3,4代细胞接种于脑脊液中,通过细胞免疫化学染色法鉴定脑脊液对细胞表型的影响.取生长良好的第5代细胞,分别用含小牛血清的L-DMEM和脑脊液培养.结果与结论:运用密度梯度离心结合贴壁培养法能成功有效地分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,表型鉴定结果为CD90、CD106、CD71、CD29阳性,CD45阴性.脑脊液培养后细胞仍为骨髓间充质干细胞形态,并可见少量小圆细胞,表现为神经样细胞,表形鉴定结果为CD90、CD106、CD71、CD29阳性,CD45阴性,神经元特异性烯醇化酶呈弱阳性(<1%).细胞具有相似的S形生长曲线,生长曲线基本相似.提示骨髓间充质干细胞在脑脊液培养基中可继续生长和增殖,无诱导分化作用,且细胞对生长环境有高度的适应性.     

体外分离骨髓间充质干细胞在诱导条件下的成骨能力特征

背景：利用骨髓间充质干细胞的多方向分化潜能，选择合适的生物材料和适当的生长因子联合应用，可达到修复组织缺损的目的。 目的：观察兔骨髓间充质干细胞的生长特点及其在诱导条件下的成骨能力。设计：单一样本实验。 单位：右江民族医学院组织胚胎学教研室、右江民族医学院附属医院。 材料：实验于2004—06在右江民族医学院组织胚胎学教研室完成。新西兰大白兔，雄性，体质量2．0-2．5kg。 方法：抽取兔骨髓组织，梯度离心后，保留贴壁细胞传代，稳定传代后改用诱导成骨培养液（50mL／L胎牛血清的Dulbecco改良培养基含10mmol／L β-甘油磷酸钠，10nmol／L地塞米松，50mg／L维生素C）进行培养，隔日换培养液1次。通过倒置显微镜观察、碱性磷酸酶染色、骨连接素、骨桥素免疫细胞化学染色等方法观测骨髓间充质干细胞的成骨特性。 主要观察指标：①骨髓间充质干细胞的形态学观察。②骨髓间充质干细胞的成骨特性。 结果：①骨髓间充质干细胞的形态学观察：原代兔骨髓间充质干细胞七八天即可长满，并可稳定传代，传代细胞五六天即可传代。②骨髓间充质干细胞的成骨特性：碱性磷酸酶免疫组化染色可见胞浆中出现大量棕褐色颗粒，对照染色细胞胞浆未见着色；骨连接素、骨桥素免疫组织化学检测可见胞核染成淡蓝色，胞浆内出现大量的棕黄色颗粒，呈明显强阳性，对照染色中胞浆内没有出现黄色颗粒。 结论：兔骨髓间充质干细胞用地塞米松．维生素C和β-甘油磷酸钠培养液联合诱导培养后，符合成骨细胞的形态特征和生物学特性，具有成骨活性，可在短期内为体外构建组织工程化骨提供白体种子细胞。     

体外分离骨髓间充质干细胞在诱导条件下的成骨能力特征

背景:利用骨髓间充质干细胞的多方向分化潜能,选择合适的生物材料和适当的生长因子联合应用,可达到修复组织缺损的目的。目的:观察兔骨髓间充质干细胞的生长特点及其在诱导条件下的成骨能力。设计:单一样本实验。单位:右江民族医学院组织胚胎学教研室、右江民族医学院附属医院。材料:实验于2004-06在右江民族医学院组织胚胎学教研室完成。新西兰大白兔,雄性,体质量2.0～2.5kg。方法:抽取兔骨髓组织,梯度离心后,保留贴壁细胞传代,稳定传代后改用诱导成骨培养液(50mL/L胎牛血清的Dulbecco改良培养基含10mmol/Lβ-甘油磷酸钠,10nmol/L地塞米松,50mg/L维生素C)进行培养,隔日换培养液1次。通过倒置显微镜观察、碱性磷酸酶染色、骨连接素、骨桥素免疫细胞化学染色等方法观测骨髓间充质干细胞的成骨特性。主要观察指标:①骨髓间充质干细胞的形态学观察。②骨髓间充质干细胞的成骨特性。结果:①骨髓间充质干细胞的形态学观察:原代兔骨髓间充质干细胞七八天即可长满,并可稳定传代,传代细胞五六天即可传代。②骨髓间充质干细胞的成骨特性:碱性磷酸酶免疫组化染色可见胞浆中出现大量棕褐色颗粒,对照染色细胞胞浆未见着色;骨连接素、骨桥素免疫组织化学检测可见胞核染成淡蓝色,胞浆内出现大量的棕黄色颗粒,呈明显强阳性,对照染色中胞浆内没有出现黄色颗粒。结论:兔骨髓间充质干细胞用地塞米松、维生素C和β-甘油磷酸钠培养液联合诱导培养后,符合成骨细胞的形态特征和生物学特性,具有成骨活性,可在短期内为体外构建组织工程化骨提供自体种子细胞。     

成人脂肪间充质干细胞体外长期培养后的成骨分化潜能

背景:获得足够数量的种子细胞需要在体外进行长期传代扩增,目前涉及体外长期培养对成人脂肪间充质干细胞的基本生物学性状及成骨分化潜能影响的报道甚少.目的:观察体外长期培养对成人脂肪间充质干细胞的基本生物学性状及其成骨分化潜能的影响.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-01/06在解放军兰州军区兰州总医院骨科研究所完成.材料:成人腹部皮下脂肪组织来源于骨盆骨折患者,由解放军兰州军区兰州总医院创伤骨科提供.方法:Ⅰ型胶原酶消化法从成人脂肪组织中分离培养脂肪间充质干细胞,体外传代扩增.收集第2,5,10,15,20代细胞,加入成骨培养液进行成骨诱导分化.主要观察指标:脂肪间充质干细胞的超微结构、表面分子标志表达、生长曲线、成骨潜能.不同代数脂肪间充质干细胞成骨诱导后骨钙素及Ⅰ型胶原的吸光度值比较.结果:脂肪间充质干细胞成骨诱导第7天,由长梭形变为椭圆形、多角形,岛状分布,胞浆中出现黑色颗粒.细胞表面有较多伪足,有一两个核仁,有分叶,具备正常细胞器结构.表达CD44(96.31%),不表达CD34(1.15%).第2,5,10,15,20代脂肪间充质干细胞的生长曲线无明显差异,均呈反"S"形.上述各代细胞诱导7 d后开始表达碱性磷酸酶,且随诱导时间的延长阳性细胞数增多,至诱导28 d出现圆形不透明结节,诱导14 d骨钙素、Ⅰ型胶原均呈阳性表达.随传代次数的增加,骨钙素及Ⅰ型胶原的吸光度值均有所减低,至第20代时差异显著(P<0.05).结论:成人脂肪间充质干细胞经体外长期培养后,其一般生物学性状可保持稳定,但成骨分化潜能有所下降.     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外成骨诱导

背景：骨髓间充质干细胞作为良好的种子细胞,将其复合于生物支架治疗骨缺损取得了良好的进展,是当今研究的一大热点。目的：观察大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导向成骨样细胞分化的效果。方法：采用贴壁筛选法分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,取生长状态良好的第3代骨髓间充质干细胞,分为2组,对照组细胞仅用DMEM/F12培养基培养;实验组以含成骨诱导剂的DMEM/F12培养基培养。结果与结论：全骨髓贴壁法培养的原代骨髓间充质干细胞呈梭形或多角形贴壁生长;经成骨诱导剂诱导后骨髓间充质干细胞呈圆形或卵圆形贴壁生长,碱性磷酸酶活性明显强于对照组（P〈0.01）;茜素红染色出现阳性的钙化结节;Western blotting检测Ⅰ型胶原蛋白表达较对照组有明显增加（P〈0.01）;骨钙素ELISA定量分析较对照组明显升高（P〈0.01）。提示全骨髓贴壁法培养骨髓间充质干细胞方法简单、实用,所培养的骨髓间充质干细胞在成骨诱导后表现了成骨细胞的形态学和生物学特性。