四聚体技术检测人外周血巨细胞病毒抗原特异性OTL

为深入了解抗病毒免疫机制,探索人在健康状态及巨细胞病毒（CMV）急性感染时抗原特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）数量的动态变化.以CMV抗原肽、HLA-A＊0201重链和轻链制备CMV四聚体;分离并检测12名健康被检者外周血单个核细胞（PBMC）中CMV抗原特异CTL数量;PBMC体外培养建立CTL细胞系,于末次刺激的不同时相进行四聚体染色,流式细胞仪（FACS）检测抗原特异CTL数量.结果发现9名被检者PBMC中均检出抗原特异CTL;细胞系中CMV特异性CTL数量急剧增多,细胞系与PBMC相比,差异有显著的统计学意义（P＜0.001）;研究结果提示,9名被检者感染过CMV,血液中存在少量免疫记忆性T细胞,当再次遭遇同一抗原后发生克隆扩增.     

人工抗原提呈细胞的制备和应用的研究

目的 制备人工抗原提呈细胞（artificial antigen presenting cell,aAPC）并用它从HLA-A2阳性健康个体外周血单个核细胞（PBMC）中诱导和扩增特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）.方法 将HLA-A2-EBV四聚体分子和抗CD28抗体分子吸附固定在细胞大小的聚苯乙烯乳胶微球（5μm）表面制成aAPC;采用流式细胞仪表型分析;aAPC和HLA-A2阳性个体人外周血单核细胞进行混合淋巴细胞反应;用HLA-A＊0201-EBV四聚体染色法检测特异性CTL的频率;应用细胞内细胞因子染色法检测特异性CTL功能性细胞因子IFN-γ的分泌;采用LDH释放法检测特异性CTL的特异杀伤活性.结果 流式细胞仪分析显示微球表面吸附有HLA-A2-EBV四聚体分子和抗CD28抗体分子;四聚体检测及细胞内细胞因子染色法检测与经典细胞毒试验结果一致,结果表明aAPC在体外可诱导抗原特异性CTL的生成.结论 aAPC制备成功,并在体外有效地诱导抗原特异性CTL的生成.     

乙肝病毒蛋白抗原表位特异性CTL体外扩增条件优化

目的 优化乙肝蛋白抗原表位特异性CTL体外扩增条件.方法 选择急性自限性HBV感染者外周血,分离PBMC,体外用乙肝蛋白抗原表位多肽特异性刺激,特定天数后收集细胞,用CD8抗体与MHC-I类分子HBV抗原肽四聚体进行染色流式检测,检测扩增后乙肝蛋白抗原表位特异性CTL在CD8阳性细胞群中所占的频率.结果 1)在不同多肽浓度刺激下,当浓度在20 us/mL时,所测得特异性CTL占PBMC中CD8+T细胞的频率达到最高峰;2)固定刺激多肽浓度,在不同的刺激天数获得的特异性CTL频率第10天时最高;3)在不同的细胞因子培养条件中,当加入的细胞因子IL-2,IL-7,IL-15组合时所获得的特异性CTL频率最高.结论 在刺激肽浓度为20 μg/mL,并加入适量的细胞因子(IL-2,IL-7,IL-15),刺激10天的条件下,所获得的乙肝蛋白抗原特异性CTL频率最高.     

sH-2K~d-HBc四聚体的构建及其初步的检测应用

目的:sH-2Kd-HBc复合物四聚体的构建与检测,为进一步检测抗原特异性T细胞,探讨免疫发病机制奠定基础。方法:将四个生物素化的可溶性复合物单体与荧光标记的亲和素结合形成四聚体。采用HBcAg真核表达质粒(pcDNA3-C)通过不同的途径免疫小鼠,获得针对核心抗原的特异性CTL,与制备的四聚体共孵育,结合流式细胞仪术进行检测。结果:三种免疫方法所得到的细胞中,抗原特异性CTL频数较对照组都有明显提高(0.24%,0.26%,0.36%vs 0.07%,P≤0.05)。显示制备的四聚体能与抗原特异性T细胞结合,具有检测功能。三种不同的免疫途径所引起的抗原特异性的体液免疫应答和细胞免疫应答强度各有不同。与传统的肌肉注射组相比,基因枪免疫组的体液免疫应答水平较弱而细胞免疫应答水平较强。高压水注射(HDI)组的体液免疫应答和细胞免疫应答水平都要明显高于肌肉注射组结论:获得了功能性的sH-2Kd-HBc复合物四聚体,为进一步检测抗原特异性T细胞奠定基础。     

四聚体技术检测原发性胆汁性肝硬化患者血循环中抗原特异性T细胞

目的定量检测原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者体内抗原特异性T淋巴细胞含量,探讨其在PBC发病机制中的作用。方法采用四聚体技术检测15例HLA-A0201阳性(A2 )PBC患者外周血单个核细胞(PBMC)经抗原肽诱导生长的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)中PDC-E2159~167aa与PDC-E2165~174aa特异性CD8 T细胞频率,以A0201阴性(A2-)PBC患者与A2 的其他慢性肝病和健康自愿者为对照组。结果在A2 PBC患者PDC-E2159~167aa与PDC-E2165~174aa诱导的CTL中可检测到其相应的四聚体/CD8 细胞,平均频率分别为0.42%±0.24%(0.17%~1.08%)、0.27%±0.17%(0.05%~0.56%),各对照组的四聚体阳性细胞频率均低于0.1%,差异非常显著(P<0.001);A2 PBC组中PDC-E2159~167aa特异性的CTL频率与PDC-E2165~174aa特异性的CTL无显著性差异(P>0.05)。处于临床Ⅰ、Ⅱ期的A2 PBC患者中CD8 特异性CTL频率均较Ⅲ期的要高(P<0.05)。PDC-E2159~167aa特异性CTL与PDC-E2165~174aa特异性CTL频率在抗-PDC阳性PBC组和抗-PDC阴性组之间均无显著性差异(P>0.05)。结论HLA-A0201限制性的PDC-E2159~167aa和PDC-E2165~174aa特异性CD8 CTL在PBC疾病进展中起重要作用,抗线粒体抗体阴性或抗-PDC阴性PBC患者与阳性患者可能有着相似的T细胞介导的免疫发病机制。     

人脐带血抗巨细胞病毒和EB病毒的特异性细胞毒性T细胞的建立

目的:探讨用人的脐带血单个核细胞体外同时扩增对抗EB病毒(EBV)和巨细胞病毒(CMV)的特异性细胞毒性T淋巴细胞的可行性。方法:利用人的脐带血单个核细胞(CBMC),通过EBV感染转化成B成淋巴细胞细胞株(BLCL),再通过逆转录病毒载体,将CMV蛋白基因pp65导入BLCL,用这种细胞体外刺激同一供者脐带血的CBMC产生细胞毒性T细胞(CTL),经[⁵¹Cr]释放实验(CRA)检测产生的CTL的杀伤功能。结果: 经免疫印迹 (Western Blot)检测,我们获得了同时表达EBV和CMV特异性抗原的抗原递呈细胞BLCLpp65,免疫组化结果表明,BLCLpp65细胞表达CMVpp65抗原的阳性率高达95%。CRA结果证实,用BLCLpp65刺激产生的CTL同时对EBV和CMV都有细胞毒作用。用免疫磁珠法将CD₄⁺和CD₈⁺ T细胞分离后再进行CRA,表明特异性的细胞毒性作用主要是CD₈⁺ CTL介导的。结论:BLCLpp65是很好的抗原递呈细胞,在体外能同时表达EBV和CMV蛋白抗原,用其刺激血清病毒抗体阴性的CBMC,能够扩增出同时针对EBV和CMV的特异性CTL,其中CD₈⁺CTL起主要作用。     

HFRS患者汉滩病毒核蛋白特异性T细胞克隆及其靶细胞的建立

目的　建立肾综合征出血热 (HFRS)患者汉滩病毒 (HTNV)核衣壳蛋白 (NP)特异性CTL克隆 ,为HTNVNPT细胞表位鉴定及HFRS患者T细胞免疫功能研究奠定基础。方法　采用Fi coll密度梯度离心法分离HFRS患者外周血单个核细胞 (PBMC) ,用灭活HTNV和IL 2体外刺激 ,有限稀释法建立T细胞克隆 ,流式细胞术鉴定克隆表型。并用EB病毒 (EBV)转化B淋巴细胞 ,建立B淋巴母细胞样细胞系 (B LCL) ,以含HTNVS基因的重组痘苗病毒感染B LCL作靶细胞 ,以CTL克隆作效应细胞进行细胞毒杀伤试验 ,测定T细胞克隆的抗原特异性。结果　T细胞克隆能特异性识别表达NP的B LCL。在 5名患者中 ,3名有较高的杀伤率 ,并自 2名患者建立了 5株HTNV特异性CTL克隆 ,其表型为CD8 均大于 6 0 %。结论　成功建立了HFRS患者HTNVNP特异性CTL克隆及其靶细胞。NP是HFRS患者HTNV特异性CTL应答的主要靶抗原之一。     

丙型肝炎病毒非结构区5个细胞毒性T细胞表位的鉴定

目的 采用T细胞表位预测软件结合体外实验鉴定丙型肝炎病毒(HCV)特异性细胞毒性T细胞(CTL)表位.方法 采用T表位预测软件Rankpep预测HCV特异性CTL表位,选择候选CTL表位加以合成;用候选CTL表位肽分别刺激HCV感染者以及健康志愿者的外周血单个核细胞(PBMC),采用酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测PBMC中肽特异性分泌IFN-γ的斑点形成细胞(spots forming cells,SFC)的水平,采用细胞内细胞因子染色(intracellular cytokine staining,ICS)检测PBMC中肽特异性IFN-γ+CD8+T细胞的水平.结果 用5条候选CTL表位肽[NS3 450(TVPQDAVSR)、NS3 594(GPTPLLYRL)、NS4b 78(SMMAFSAAL)、NS5a 416(SEENVSVVF)和NS5a 367(TVSSALAEL)]分别刺激10个HCV感染者和2个健康者的PBMC后,健康者的PBMC不产生IFN-γ而7个HCV感染者的PBMC产生IFN-γ;HCV感染者的PBMC中肽特异性分泌IFN-γ的细胞的频率为(5-36)SFC/105 PBMC,肽特异性IFN-γ+CD8+T细胞占总CD8+T细胞的百分比为0.02%～0.25%.结论 ELISPOT结果和ICS结果证实5条肽NS3 450、NS3 594、NS4b 78、NSSa 416和NS5a 367为全新的HCV特异性CTL表位.     

治疗用HBV模拟抗原的设计及其诱导慢性乙型肝炎患者外周血CTL活性研究

目的：引入四聚体技术比较基于不同表位组合的模拟抗原分子的免疫原性，研究其结构与诱导免疫应答之间的关系。方法：以乙型肝炎病毒核心抗原(HBeAg)18～27表位为基础，分别引入了TH、TH B细胞表位，合成了3种模拟抗原，并以这3种模拟抗原在体外刺激慢性乙型肝炎患者的外周血单个核细胞为模型，通过HLA—A2 *0201 tetramer定量检测抗原特异性细胞毒性T细胞(CTL)。结果：3种模拟抗原分子能有效地诱导慢性乙型肝炎患者外周血单个核细胞产生抗原特异性CTL反应；TH和B细胞表位的引入可增强该效应。结论：我们所建立的四聚体技术可定量检测表位特异性CTL；模拟抗原的设计中引入TH、B细胞表位可增强其免疫原性。     

HLA-A2+供者外周血hCMV特异性CTL的定量及其表型分析

目的:利用加载人巨细胞病毒(hCMV)结构蛋白pp65衍生抗原肽NLV(pp65495-503)的HLA-A0201(A2-NLV)四聚体,探讨四聚体染色条件的优化及其在特异性CTL表型分析中的应用。方法:取HLA-A2 供者外周血,以A2-NLV四聚体/PE在不同条件下染色,然后以anti-CD3-FITC和anti-CD8-APC标记,流式细胞术分析染色结果,寻找四聚体最佳染色条件,并分析特异性CTL的表型和活化抗原表达。结果:以全血样进行四聚体染色结果优于分离的PBMC。A2-NLV四聚体用量为0.3μg时,与100μL全血于4℃温育1h,特异性染色效果最佳,而与CD8-T细胞非特异性结合很低。以此优化条件进行特异性CTL表型分析,结果显示CD28阳性的A2-NLV四聚体特异性CTL的百分率较非特异性CTL低,表达CD57的百分率较非特异性CTL高,CD25分子只表达于活化的特异性CTL上。结论:通过对染色条件进行优化可明显提高四聚体染色的特异性,降低非特异性结合,优化的四聚体染色法能用于抗原特异性CTL的表型和功能分析。     

CTL识别的HLA-A2限制性人卵巢癌相关抗原OVA66表位的鉴定

目的：鉴定CTL识别的HLA—A2限制性人卵巢癌相关抗原OVA66表位。方法：以细胞因子从外周血单个核细胞(PBMC)中诱导树突状细胞(DC)，通过形态学观察和流式细胞术进行鉴定。用表位预测法选取并合成两种肽分子，分别脉冲成熟的DC，并刺激HLA—A2^ 健康人自体CD8^ T细胞，1wk后，用脉冲肽的自体PBMC以每7d的间隔刺激该CD8^ T细胞3次。以共接受4次抗原肽刺激的T细胞作为CTL，用乳酸脱氢酶(LDH)释放试验，检测CTL对靶细胞的杀伤效应。用酶联免疫斑点法(ELISPOT)．检测CTL中抗原特异性分泌IFN-γ的T细胞数。结果：形态学和流式细胞术的结果显示．PBMC可诱生成熟的DC。肽1235(FLPDHINIV)诱导的CTL．可特异性杀伤1235脉冲的T2细胞和OVA66^ 、HLA—A2^ 的SW480细胞，且L235诱导的特异性分泌IFN-γ的T细胞数增加。结论：卵巢癌相关抗原OVA66的HLA—A2限制性CTL表位1235．能激发对肿瘤抗原的特异性免疫应答，为制备肿瘤特异性肽疫苗奠定了实验基础。     

EB病毒转化B淋巴母细胞在汉滩病毒CTL表位研究中的应用

目的:建立EB病毒转化B淋巴母细胞系(B-LCL),作为抗原提呈细胞(APC)提呈抗原肽,刺激短期培养的特异性T细胞活化并分泌IFN-γ,从而应用于T细胞表位鉴定中.方法:用B95-8细胞培养上清中的EB病毒转化肾综合征出血热(HFRS)患者PBMC,建立HFRS患者的B-LCL,以自身BLCL为APC,加载抗原肽后,刺激短期培养的G9L特异的HFRS患者CD8+ T细胞系,应用ELISPOT测定CD8+ T细胞受到抗原肽刺激后产生IFN-γ的能力.结果:加载过抗原肽G9L或V15R的B-LCL可刺激G9L特异的CD8+ T细胞活化并产生IFN-γ,而与G9L无同源序列的115P则不能刺激G9L特异的CD8+ T细胞活化.结论:B-LCL可作为非专职APC有效地将抗原肽提呈给特异性T细胞.     

HBc-HLA-A*1101-β2m复合物单体及其四聚体的制备和鉴定

目的制备HBc-HLA-A ＊ 1101-β2m复合物单体和四聚体,并对其特异性进行了鉴定。方法原核高效表达的HLA-A ＊ 1101-BSP和β2m蛋白,在抗原肽（乙型肝炎病毒的核心蛋白HBc88-96）的存在下,体外复性折叠成可溶性的HLA-A ＊ 1101抗原肽复合物单体,经BirA酶作用并通过凝胶过滤层析法纯化复合物单体;然后将此复合物单体与藻红蛋白标记的链霉亲和素按一定比例耦合构建成四聚体;最后用流式细胞仪检测分析该四聚体结合特异性CTL的能力。结果Western blot和Dot-ELISA检测显示所制备的HLA-A ＊ 1101抗原肽复合物单体具有天然构象,且可被生物素化;流式细胞仪分析显示所制备的四聚体可与HLA-A11^＋供者的抗原特异性CTL结合。结论成功制备了具有完整构象的生物素化HLA-A ＊ 1101抗原肽复合物单体;此四聚体可以特异检测抗原特异性的细胞毒性T细胞。     

人乳头状瘤病毒11型E7抗原HLA-A*0201限制性细胞毒性T淋巴细胞表位的功能鉴定

目的 筛选和鉴定人乳头状瘤病毒11型E7抗原(HPVllE7)HLA-A*0201限制性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte,CTL)表位.方法 预测HPVllE7抗原HLA-A*0201限制性CTL表位并合成相对应的表位多肽和四聚体(tetramer),即HPVllE7 7-15(TLKDIVLDL)、15-23(LQPPDPVGL)、47-55(PLTQHYQIL)、81-89(DLLLGTLNI)和82-90(LLLGTLNIV).从健康HLA-A*0201成人外周血单一核细胞诱导树突状细胞(DC)并负载上述表位多肽,流式细胞技术检测DC成熟分化标记及ELISA法检测DC分泌的IL-12;成熟DC负载各组多肽后观察DC激活T淋巴细胞的效应,ELISA法检测T细胞分泌的IFN-γ;四聚体检测抗原特异性CD8+ T细胞及乳酸脱氢酶(LDH)释放法评价DC诱导的CTL对靶细胞的特异性体外杀伤效应.结果 预测的5条HPVllE7表位多肽均能诱导DC的成熟分化;E7 7-15、82-90和15-23多肽负载的DC能激活T淋巴细胞分泌高水平IFN-γ;E7 7-15多肽负载的DC能刺激特异性tetramer+CD8+细胞增殖且其诱导的CTL对HPVllE7/293细胞产生高效率的特异性杀伤作用(P<0.05).结论 筛选并鉴定出1条HPVllE7HLA-A*0201限制性CTL表位E7 7-15(TLKDIVLDL),负载该表位肽的DC体外可诱导高效、特异性的CTL效应,抗原性较强,有可能作为HPV感染治疗用肽疫苗的候选表位.     

pMHC 多聚体技术研究进展

抗原肽结合的主要组织相容性复合物(pMHC)通过形成多聚体可有效提高结合到位于T 细胞表面上的T 细胞受体(TCR)的亲合力。自从20 年前pMHC 四聚体首次被用于抗原特异性T 细胞检测以来,pMHC 四聚体已成为免疫分析中最重要的检测工具之一。近年来pMHC 多聚体在四聚体的基础上又取得了较大进展,更高价的pMHC 多聚体被研制出来以提高免疫检测的灵敏度;可逆化的pMHC 多聚体由于可以从T 细胞表面解离而避免了对T 细胞的功能损伤,也被发展用于抗原特异的T 细胞分离。pMHC 多聚体作为一类分子工具在抗原特异的T 细胞分析和免疫治疗中具有重要作用,对它的充分了解和有效运用能帮助我们更好地进行科学和临床应用。     

三种常见HBV抗原肽-HLA-A*0201复合物四聚体的构建及初步检测应用

目的 体外构建三种常见HBV抗原肽-HLA-A*0201复合物四聚体,并初步用该三种四聚体对抗原肽特异性的细胞毒性T细胞(CTL)进行了初步检测.方法 原核高效表达的HLA-A*0201-BSP和β2m蛋白,分别和三种HBV抗原肽(HBVCore18-27,Env335-343,Po1575-583)体外复性折叠成可溶性的HLA-A*0201抗原肽复合物单体,经BirA酶作用并通过凝胶过滤层析法纯化复合物单体,分别将复合物单体与藻红蛋白标记的链霉亲和素按一定比例耦合构建成相应的三种抗原肽四聚体.最后进行流式细胞仪检测.结果 Dot-ELISA和ELISA检测显示获得了三种具有天然构象的生物素化的HBV抗原肽-HLA-A*0201复合物单体.构建的三种四聚体均可以检测到相应特异性的CTL,在自限性感染患者体内针对乙肝核心抗原(core18-27)的CTL细胞频数(0.18%)高于针对聚合酶抗原(po1575-583)(0.08%)和包膜抗原(env335-343)(0.06%).结论 成功构建了三种具有完整构象的生物素化HBV抗原肽-HLA-A*0201复合物单体,所构建的三种四聚体都可以检测到抗原特异性的CTL.     

可溶性MHC-肽四聚复合物法及其进展

抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)主要是CD8^ T细胞，少数为CD4^ T细胞，CTL对抗原的识别及自身的活化受MHC分子的限制。抗原特异性CTL在抗感染免疫、移植物免疫和肿瘤免疫中发挥重要作用，定量分析抗原特异性CTL可为阐明免疫应答的自然发生过程提供重要信息，但是传统的检测分析方法均为间接的活性测定，费时费力。1996年Ahman等首创的可溶性MHC-肽四聚复合物法则能够直接定量检测抗原特异性CTL的比率，     

外周血干细胞采集物来源的巨细胞病毒特异性T细胞的体外培养和扩增

目的建立巨细胞病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞(CMV CTL)体外扩增的方法。方法用1μg/mL全长巨细胞病毒pp65(CMV pp65)多肽体外多轮刺激由粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)动员的外周血干细胞采集物中分离的单个核细胞(PBMC),同时加入白细胞介素2(IL-2)、 IL-15、 IL-21扩增20 d。在培养第7天,加入丝裂霉素处理的负载CMV pp65抗原肽的自体PBMC,第10天补充经γ射线辐照处理并负载CMV pp65抗原肽的PBMC和CD3(OKT3);对照组为未加入抗原肽进行扩增的PBMC组。采用多色流式细胞术分别对扩增前、扩增后的T淋巴细胞表型及细胞内肿瘤坏死因子α(TNF-α)和γ干扰素(IFN-γ)的分泌水平进行分析, ELISA检测供者血清中CMV IgM/IgG抗体滴度水平。结果培养后可以收集得到(165.26±6.14)×10~6个细胞,其中CD3~+ T细胞占89.21%, CD8~+ T细胞占CD3~+ T细胞的(43.54±28.03)%, CD4~+ T细胞占CD3~+ T细胞(34.23±26.18)%。获得的CD3~+ T细胞以效应记忆性T细胞(T_(EM))为主,且扩增培养后的CD8~+和CD4~+ T_(EM)比例较培养前显著增高。另外,培养后干细胞样记忆性T细胞(T_(SCM))和组织原位记忆T细胞(T_(RM))的比例均较培养前显著增加。在功能实验中,培养后得到的IFN-γ~+的分泌型CMV特异性CD8~+ T细胞群比例较扩增前明显增加, TNF-α~+ CMV特异性CD8~+ T细胞比例呈增长趋势;能够分别分泌IFN-γ和TNF-α的CMV特异性CD4~+ T细胞群比例与培养前无明显变化。此外,供者体内CMV IgG水平与供者年龄呈现正相关,且在该培养体系下, IFN-γ~+和TNF-α~+ CMV特异性T细胞扩增比例与供者年龄呈负相关。结论本研究成功建立了在体外有效的培养和扩增CMV CTL的方法。     

原发性胆汁性肝硬化HLA-A*0201限制性PDC-E2特异性CTL功能分析

目的：探讨原发性胆汁性肝硬化（PBC）中HLA-A＊ 0201限制的PDC-E2159-167特异性CTL与PDC-E2165-174特异性CTL功能。方法：分析15例HLA-A＊0201阳性（A2＋）PBC患者抗原肽PDC-E2159-167、PDC-E2165-174诱导的CTL对以表达HLA-A＊ 0201分子的T2细胞作为靶细胞的细胞毒性作用，并利用四聚体技术结合细胞内因子染色研究PDC-E2159-167特异性CTL与PDC-E2165-174特异性CTL分泌细胞因子（IFN-γ、IL-4和TNF-α）情况。结果：15例A2＋PBC患者中，12例PDC-E2159-167诱导的CTL和10例PDC-E2165-174诱导的CTL对负载相应抗原肽的靶细胞特异杀伤活性大于10%（E∶T=40∶1），而对照组则均小于10%；15例A2＋PBC患者从PBMC诱导的PDC-E2159-167特异性CTL和PDC-E2165-174特异性CTL中分泌IFN-γ细胞比值分别为0.33%±0.24%（0%～0.86%）、0.27%±0.24%（0%～0.75%），未检测到分泌TNF-α或IL-4的PDC-E2159-167或PDC-E2165-174特异性CTL。结论：结果表明，大部分PBC患者中HLA-A＊ 0201限制性PDC-E2159-167特异性CTL和PDC-E2165-174特异性CTL具有特异杀伤活性，HLA-A＊ 0201限制性PDC-E2特异性CTL主要分泌IFN-γ并非IL-4、TNF-α。     

H-2K~d四聚体的制备及其在检测特异性同种CTLs中的应用

目的制备H-2Kd限制性胰岛GAD抗原肽/H-2Kd四聚体并用于检测相应的特异性同种CTL。方法以原核表达的sH-2Kd-BSP为重链,β2m为轻链,与人工合成的GAD抗原肽在体外利用稀释法进行共折叠复性得到单体。然后在BirA酶作用下对其进行生物素化,通过凝胶过滤层析法纯化生物素化的复合物单体,再与Strep-tavidin-FITC按4∶1比例混合形成四聚体;取Balb/c小鼠(H-2Kd)巨噬细胞加载胰岛GAD抗原肽,作为刺激细胞,取C3H小鼠脾细胞(H-2KK)作为效应细胞,在体外进行混合淋巴细胞培养,以获得针对H-2Kd限制性胰岛GAD抗原肽的特异性同种CTL。结果该四聚体能够与长期混合淋巴细胞培养出的同种特异性T细胞结合。结论成功构建胰岛GAD抗原肽/H-2Kd四聚体,并可用于针对H-2Kd限制性胰岛GAD抗原肽特异性同种CTL的检测。