冬凌草甲素诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡及机制

目的 探讨冬凌草甲素体外诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡和细胞周期阻滞的作用及其机制.方法 10～80 μmol/L冬凌草甲素分别处理SGC-7901细胞后,CCK8法检测冬凌草甲素体外对SGC-7901细胞抑制生长的作用;用流式细胞仪分别观察冬凌草甲素诱导凋亡及细胞周期阻滞.Western blot测定凋亡相关蛋白的表达.结果 冬凌草甲素对SGC-7901细胞有明显的生长抑制作用,并随着药物浓度的增加(10～80 μmol/L)而逐渐增强,呈浓度、时间依赖关系.此外,流式细胞术检测发现,冬凌草甲素浓度为0、10、40、60、80 μmol/L,作用24 h后,G_2/M期细胞数分别是(9.90±1.17)%、(9.94±0.27)%、(11.76±0.16)%、(15.64±1.48)%和(22.59±1.01)%;而S期细胞比例分别为(31.79±1.03)%、(30.90±0.47)%、(29.25±0.80)%、(21.46±1.61)%、(18.81±0.61)%,冬凌草甲素能够使得SGC-7901细胞周期呈剂量依赖性阻滞于G_2/M期;冬凌草甲素浓度为80 μmol/L,作用12、24 h后,凋亡率分别为(12.78±1.54)%、(20.62±2.39)%,明显高于对照组的(9.92±0.56)%,其能使SGC-7901细胞发生凋亡.随着冬凌草甲素作用时间延长,SGC-7901细胞的bel-2蛋白表达逐渐减弱,前体Caapase-3被激活.结论 冬凌草甲素能够诱导SGC-7901细胞产生凋亡,并使细胞周期阻滞在G_2/M期.其凋亡机制可能与下调bcl-2蛋白表达及Caspase-3的激活相关.     

二甲双胍对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖及胶原合成的影响

目的 探讨二甲双胍对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、胶原合成及蛋白激酶B/叉头框蛋白O1(Akt/FoxOl)信号通路磷酸化水平的影响.方法 将瘢痕疙瘩成纤维细胞分为培养液处理的空白对照组和用含不同浓度二甲双胍培养液处理的实验组,给药后48 h采用CCK-8比色法检测细胞增殖,western blot技术检测Akt 、FoxO1的磷酸化水平,羟脯氨酸试剂盒检测胶原的合成.结果 二甲双胍可显著抑制成纤维细胞的增殖,用30、60、90、120 mmol/L不同浓度的二甲双胍处理成纤维细胞后,成纤维细胞的抑制率依次升高为(13.30±2.04)％、(22.64±4.70)％、(54.00±5.34)％和(63.12±3.48)％,呈明显的剂量依赖性.与空白对照组比较,二甲双胍处理后的成纤维细胞中Akt、FoxO1磷酸化水平降低,胶原蛋白产生减少,并且呈剂量依赖性(P ＜0.05,P＜0.01).结论 二甲双胍可显著抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖及胶原合成,其机制可能与调控Akt/FoxOl信号通路的磷酸化水平有关.     

独角莲根茎水提取物对瘢痕疙瘩成纤维细胞的抑制作用

目的 探讨独角莲根茎水提取物(AEoTGE)对瘢痕疙瘩成纤维细胞的抑制作用,测定其半数抑制浓度及凋亡率.方法 采用组织块法体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞,以透射电镜鉴定细胞超微结构.四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测不同浓度AEoTGE(3.125、6.250、12.500、25.000、50.000、100.000g/L)作用瘢痕疙瘩成纤维细胞24 h后的抑制率,计算其半数抑制浓度(IC50).采用5-乙炔基-2-脱氧尿苷(EdU)染色法测定瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖情况,流式细胞技术检测其凋亡率.结果 ①应用不同浓度(3.125～100.000 g/L) AEoTGE作用瘢痕疙瘩成纤维细胞24 h后,随AEoTGE浓度增加对细胞抑制作用增强,与对照组比较,细胞抑制率差异有统计学意义(P＜0.05);②瘢痕疙瘩成纤维细胞经AEoTGE作用后的半数抑制浓度(IC50)为(35±0.27) g/L;③EdU染色示35 g/L AEoTGE组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05);④FITC-Annexin V/PI示AEoTGE组凋亡率为(72.07±0.70)％,对照组为(23.48±1.63)％(P＜0.05).结论 体外培养人瘢痕疙瘩成纤维细胞经AEoTGE作用24 h后,半数抑制浓度(IC50)为(35±0.27) g/L,并可明显诱导细胞凋亡,凋亡率为(72.07±0.70)％.     

丹参对瘢痕疙瘩成纤维细胞基质金属蛋白酶-1的作用

目的探讨丹参对培养瘢痕疙瘩成纤维细胞基质金属蛋白酶-1(matrix metalloprotein-ase-1,MMP-1)蛋白生成和mRNA表达的影响。方法采用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和Northern杂交技术检测培养瘢痕疙瘩成纤维细胞MMP-1蛋白的合成分泌和mRNA的表达。结果培养瘢痕疙瘩成纤维细胞的MMP-1自发分泌量为(95±38)pg/ml;在培养基中丹参浓度分别为5mg/ml和10mg/ml条件下,MMP-1的浓度分别为(128±29)pg/ml(t=3.425,P<0.05)和(151±43)pg/ml(t=5.075,P<0.01)。在培养基中丹参浓度为10mg/ml时,培养瘢痕疙瘩成纤维细胞的MMP-1mRNA的表达被提高到(125±11)%(t=4.628,P<0.01)。结论丹参可提高培养瘢痕疙瘩成纤维细胞MMP-1蛋白的合成分泌和mR-NA的表达,这为丹参用于瘢痕疙瘩的临床治疗提供了理论依据。     

外源性NO对成纤维细胞影响的研究

目的:探讨一氧化氮(Nitric Oxide,NO)供体硝普钠(sodium nitroprusside,SNP)对成纤维细胞形态及凋亡的影响。方法:将NO供体SNP制成5个不同浓度(100、200、300、400、500)μmol/L作用于成纤维细胞,观察不同时间的细胞形态变化及细胞凋亡。结果:随SNP作用浓度增高及时间延长,成纤维细胞形态呈逐渐老化状态,且数量明显减少,呈显著性负相关(y=28.943-0.858x)。成纤维细胞凋亡率300和500μmol/L组(25.67±0.36和56.38±2.18)%明显高于空白对照组(1.35±0.26)%,具有显著性差异(P<0.001)。结论:NO对成纤维细胞具有时间浓度依赖效应,可致细胞数量减少、形态老化及凋亡增加,为瘢痕防治提供了一种新的理论思路。     

消瘢醑对瘢痕疙瘩成纤维细胞I、III型胶原蛋白的影响

目的研究复方中药制剂消瘢醑对体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞(Keloid fibroblast,KFB)I、III型胶原蛋白的影响. 方法 6例瘢痕疙瘩成纤维细胞为实验组,6例正常皮肤成纤维细胞(Normal fibroblast,NFB)为对照组,采用成纤维细胞体外培养、ABC免疫细胞化学染色技术及积分光密度(IOD)分析,观察在10μg/ml消瘢醑浓度作用下,瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞I、III型胶原蛋白的表达. 结果瘢痕疙瘩成纤维细胞I、III型胶原阳性染色表达强度均显著高于正常皮肤成纤维细胞(11113.1±1304.9 vs 3519.6±236.0与11157.7±1300.3 vs 2626.5±426.3,t值分别为14.42和13.47,P值分别为0.00003和0.00004).10μg/ml浓度的消瘢醑作用48小时后:1.瘢痕疙瘩成纤维细胞I、III型胶原阳性染色表达强度均显著高于正常皮肤成纤维细胞(7675.4±825.5 vs 2305.2±320.4与10595.2±1311.5 vs 2434.8±356.9,t值分别为13.37和12.66,P值分别为0.00004和0.00005);2.瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞呈阳性表达的I、III型胶原染色强度明显下降,与未经药物处理的相应空白对照相比具有显著性差异(7675.4±825.5 vs 11113.1±1304.9与10595.2±1311.5 vs 11157.7±1300.3,t值分别为10.31和4.68,P值分别为0.0001和0.0054).瘢痕疙瘩组I型胶原蛋白合成抑制率30.7%,III型胶原蛋白合成抑制率为5.1%. 结论在I、III型胶原蛋白表达方面,体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞明显高于正常皮肤成纤维细胞;"消瘢醑"能显著抑制体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞I、III型胶原蛋白的表达,并以抑制I型胶原表达为主.     

RNA干扰Survivin基因表达对瘢痕疙瘩中成纤维细胞增殖与凋亡的影响

目的 探讨RNA干扰Survivin基因表达对癜痕疙瘩成纤维细胞增殖与凋亡的影响,为瘢痕疙瘩的基因治疗提供实验依据.方法 构建靶向Survivin的siRNA表达质粒,利用Lipofectamine TM 2000转染体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞;采用RT-PCR、Western blot技术检测成纤维细胞中Survivin基因的被干扰情况及Caspase-3基因的表达情况;利用MTT法、流式细胞仪检测成纤维细胞的增殖与凋亡情况.结果 靶向Survivin的序列特异件的siRNA对成纤维细胞中Survivin基因表达的抑制率:在mRNA水平为59.86%和82.57%,在蛋白质水平分别为48.76%和72.53%.Caspase-3基因的表达和活性显著增加(P＜0.01).转染靶向Survivin的RNAi表达质粒对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的抑制较显著(P＜0.05).Annexin V-FITC/P1双染法显示,干扰Survivin基因表达后成纤维细胞的调亡率高于对照组(56.36%,P＜0.05).结论 所构建的靶向Survivin的RNAi质粒可有效地抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞中Survivin基因的表达,通过Survivin基因表达的下调激活Caspas-3基因活性,可显著抑制成纤维细胞的增殖并诱导其凋亡,为瘢痕疙瘩的基因治疗开辟一新途径.     

5-Fu作用于瘢痕疙瘩成纤维细胞后Caspase-3变化的研究

目的:从蛋白层面证明瘢痕疙瘩、正常皮肤成纤维细胞中Caspase-3蛋白表达水平存在差异。通过5-fu(5-氟尿嘧啶)浓度梯度作用瘢痕疙瘩成纤维细胞后,观察细胞中Caspase-3蛋白的表达,及细胞增殖、迁移和侵袭性变化。方法:临床手术获取瘢痕疙瘩、正常皮肤组织块,培养瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid fibroblast KF)及正常皮肤成纤维细胞(normal skin fibroblast NSF),应用免疫组织化学及Western blot检测组织块及细胞中Caspase-3蛋白的表达;将5-fu(5-氟尿嘧啶)浓度梯度作用瘢痕疙瘩成纤维细胞(KF)后,应用Western blot检测Caspase-3蛋白的表达;CCK-8法检测KF细胞增殖情况;Trans-wells小室实验检测KF细胞的体外迁移和侵袭能力。结果:瘢痕疙瘩组织、正常皮肤组织、KF、NSF中均有Caspase-3蛋白的表达;KF中Caspase-3蛋白表达水平明显低于NSF,差异有统计学意义(P0.05),瘢痕疙瘩组织块中Caspase-3蛋白表达水平明显低于正常皮肤组织,差异存在统计学意义(P0.05);5-fu作用KF后,Western blot显示随着5-fu浓度的降低,KF中caspase-3蛋白表达减少,差异存在统计学意义(P0.05)。CCK-8结果显示,随着5-fu浓度的降低,对KF增值活性的抑制不断减弱,差异有统计学意义(P0.05);Trans-well侵袭结果显示侵袭到下室的KF数目随5-fu浓度的不断降低,而增多。结论:Caspase-3在KF中的表达明显低于NS,同时是5-fu诱导KF凋亡的关键因子,5-fu以浓度依赖方式促进Caspase-3活性增高,同时抑制KF增值、侵袭、迁移等肿瘤特性。     

圆盘状受体在病理性瘢痕成纤维细胞中表达

目的探讨圆盘状受体(discoidin domain receptors,DDRs)在病理性瘢痕形成中的作用。方法取13例瘢痕疙瘩,10例增生性瘢痕,10例正常皮肤,体外培养成纤维细胞,经荧光定量PCR,定量检测成纤维细胞中DDR1、DDR2水平。结果瘢痕疙瘩、增生性瘢痕成纤维细胞中DDR1水平明显高于正常皮肤成纤维细胞(20.98对4.2,P<0.01;7.9对4.23,P<0.05),瘢痕疙瘩与增生性瘢痕成纤维细胞中DDR1相比,有统计学意义(20.98对7.9,P<0.01),DDR2在瘢痕疙瘩、增生性瘢痕成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞中差异无统计学意义(358,332对278,P>0.05)。结论荧光定量PCR可准确测定组织中DDR含量,病理性瘢痕成纤维细胞的细胞学行为与DDR有关。     

α-2b干扰素对瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡及端粒酶逆转录酶、bcl-2 mRNA表达的影响

目的 观察α-2b干扰素(IFNα-2b)对瘢痕疙瘩成纤维细胞生长增殖、凋亡及端粒酶逆转录酶(hTERT)、bcl-2 mRNA表达的影响,探讨其在瘢痕疙瘩治疗中的作用机制.方法 进行成纤维细胞原代培养,细胞分别来自8例瘢痕疙瘩标本和8例正常皮肤标本.第3～4代的细胞用于实验.以IFNa-2b作用于体外培养的瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞,MTT法检测成纤维细胞生长增殖情况,应用流式细胞仪观察处理后成纤维细胞凋亡,RT-PCR法检测成纤维细胞hTERT和bcl-2mRNA的表达.结果 IFNα-2b对瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞生长有抑制作用,体外培养的瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞经10 000 U/ml IFNα-2b处理后,能诱导成纤维细胞凋亡发生,RT-PCR检测hTERT和bcb2 mRNA表达降低,和对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01),且具有明显的时间依赖性.结论 作为一个负性调节因子,IFNα-2b能抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的生长增殖并诱导成纤维细胞发生调亡,下调成纤维细胞端粒酶活性是其重要作用机制之一.通过抑制端粒酶活性进行抗瘢痕疙瘩治疗可能是一个新途径.     

膝关节后交叉韧带断裂治疗临床分析

目的 对35例膝关节后交叉韧带断裂治疗进行临床分析,重点探讨了有关交叉韧带断裂的治疗问题。方法 经明确诊断后,分析采用胫骨附着处撕脱骨折复位固定手术治疗26例、早期髌韧带中1／3移植重建3例、单纯长腿石膏固定6例。结果 本组病例全部进行随访,随访时间13个月－5年,胫骨附着处撕脱骨折复位固定及髋韧带中1／3移植重建29例为优良、单纯长腿石膏固定6例为差。结论 后交叉韧带断裂后应该及时给予手术修复;膝后外侧手术入路,操作简单,暴露充分;少于3个月的陈旧性病例仍适应手术治疗。     

不同方法重建指尖离断静脉回流的疗效分析

目的：探讨不同方法重建指尖离断静脉回流的疗效。方法：2008年3月-2013年2月收治指尖离断患者80例,38例吻合指侧方静脉重建回流,术中吻合动静脉比例1：1或1：2或2：2,平均1：2;22例吻合指腹静脉重建回流,术中吻合动静脉比例1：1;20例未吻合静脉,术中仅吻合1条动脉,行侧切口或甲床放血。观察各组治疗效果。结果：吻合指侧方静脉组手指全部成活,无一例发生回流障碍;吻合指腹静脉组19例发生静脉危象,其中4例手指坏死;未吻合静脉组20例均发生回流障碍,其中6例手指坏死。58例获随访,随访时间6~28个月。吻合指侧方静脉组32例,指尖外形佳、指腹饱满;吻合指腹静脉组14例,指体轻度萎缩,指甲生长不平整;未吻合静脉组12例,指体萎缩明显。吻合指侧方静脉组指甲生长近平整,长度长于其他两组[（14.4±3.2）mm比（12.5±2.3）mm和（12.2±2.2）mm],远侧指间关节活动度大于其他两组[（63±5）°比（48±3）°和（45±7）°],两点分辨觉小于其他两组[（4.6±0.4）mm比（7.1±1.2）mm和（7.3±0.6）mm],感觉级别高于其他两组[S（3.45±0.39）级比S（2.57±0.42）级和S（2.55±0.49）级],差异均具有显著性（P〈0.05）。吻合指腹静脉组和未吻合静脉组在指甲长度、运动和感觉方面差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：吻合指侧方静脉能有效解决指尖再植静脉回流问题,可避免回流障碍,成活率高,促进指甲生长,可恢复 DIPJ 活动度及感觉。     

胫骨干骨折的手术治疗对策

目的：明确不同固定器械在胫骨干不同骨折类型固定中的特点，以指导临床应用。方法：68例胫骨干骨折，行加压钢板螺钉、交锁髓内钉、单侧外固定架固定后，作临床疗效分析。结果：加压钢板固定组42例，感染5例，骨不连1例，平均愈合时间3．8个月；交锁髓内钉固定组13例，无感染及骨不连，平均愈合时间5．4个月；单侧外固定架组13例，骨不连1例，踝关节背伸受限3例，平均愈合时间4．5个月。结论：胫骨骨折交锁髓内钉固定并发症少，功能恢复好，适用范围广，但要注意及时进行动力加压。加压钢板及外固定架固定应选择各自的最佳适应证，以达到理想的疗效。