TiO2喷砂酸蚀处理对人成骨细胞骨保护素和骨保护素配体mRNA表达影响的研究

[目的]探讨纯钛钛片经过喷砂及喷砂酸蚀处理后对人成骨细胞系MG63细胞骨保护素(osteoprotegerin,OPG)及骨保护素配体(osteoprotegerin ligand,OPGL)mRNA表达水平的影响.[方法]纯钛钛片表面分别进行机械打磨、喷砂及喷砂酸蚀处理,将人成骨细胞系MG63细胞接种于钛片表面,采用荧光实时定量PCR法检测OPG、OPGL mRNA表达水平.[结果]MG63细胞在经过喷砂及喷砂酸蚀处理后的钛片上培养后其OPG mRNA水平增高,与机械打磨组相比有统计学意义(P＜0.05),而OPGL mRNA表达水平在各组之间没有明显差异(P＞0.05).[结论]经过喷砂及喷砂酸蚀处理的钛片均可促进人成骨细胞表达OPG,从而调节成骨细胞与破骨细胞之间的平衡,促进骨质重建.     

地塞米松对成骨细胞保护蛋白mRNA的调节

目的：观察皮质醇激素对成骨细胞OPG基因表达的调节，探讨激素通过成骨细胞影响破骨细胞骨吸收的分子机理。方法：体外培养大鼠成骨细胞，分别予不同时间、剂量地塞米松进行干预实验，提取总RNA进行半定量逆转录PCR分析，检测OPGmRNA水平的改变。结果：地塞米松可以抑制OPGmRNA的表达，作用强度随时间，剂量而改变。结论：激素引发的骨质疏松与其下调成骨细胞OPG基因表达，诱导破骨细胞形成，增加骨吸收有关。     

骨保护素和骨保护素配体在人骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中的表达

目的研究骨保护素和骨保护素配体在人骨髓基质细胞向成骨细胞诱导分化过程中的表达情况，探讨其在骨重建过程中的调节作用。方法实验中采用梯度离心法和酶消化法分别获得人骨髓基质细胞和成骨细胞，并将骨髓基质细胞向成骨细胞方向诱导分化。通过形态学观察、生化指标检测、细胞染色和矿化结节测定等方法，确定骨髓基质细胞的功能状态和分化程度。采用RT-PCR和Westem blot方法，检测骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中骨保护素和骨保护素配体的表达情况。结果获得的骨髓基质细胞和成骨细胞生长状态良好，生化指标稳定。骨髓基质细胞分化后，碱性磷酸酶分泌明显增加，可以产生大量的矿化结节，具有成熟成骨细胞的表型特征。RT-PCR和Western blot检测，在骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中，骨保护素在mRNA和蛋白质水平的表达明显升高，而骨保护素配体的表达则逐渐下降。细胞中OPG mRNA表达在第21天时达到最大，约为未分化时水平的2．5倍。而OPGLmRNA表达减少为未分化时1／2；细胞中OPG的蛋白质表达水平提高约为未分化细胞的6倍。统计学分析，P〈0．01，差异有显著性。结论在人骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中，骨保护素表达逐渐升高而骨保护素配体表达显著降低，两者比值的逐渐增大，从而发挥促进骨形成，抑制骨吸收的作用，这可能是协调骨重建周期有序进行的重要机制之一。     

间歇性负压培养对人BMSCs骨保护素和骨保护素配体mRNA表达水平的影响

目的 探讨间歇性负压对体外培养的人BMSCs骨保护素(osteoprotegerin,OPG)mRNA和骨保护素配体(osteoprotegerin ligand,OPGL)mRNA表达水平的影响. 方法 2008年1月由2例髋关节骨性关节炎行人工关节置换患者自愿捐赠骨髓,分离并体外培养人BMSCs,取第3代细胞.实验组进行负压诱导,设置压力为50 kPa,30 min/次,2次/d,间歇性负压干预2周;对照组于普通CO2培养箱中常规培养.倒置相差显微镜下观察细胞形态,并通过实时定量PCR检测OPG mRNA和OPGL mRNA表达水平. 结果 实验组细胞增殖速度略低于对照组,细胞逐渐由梭形向多角形转变,有数个突起,数目和形态不定,10～14d细胞融合成单层,2周后逐渐形成多个散在致密岛状结构;对照组细胞大部分为梭形.间歇性负压培养2周后,与对照组比较,实验组细胞OPG mRNA表达水平显著提高,OPGL mRNA表达水平显著降低,OPGL mRNA与OPG mRNA比率显著下降,差异均有统计学意义(P＜0.01). 结论 间歇性负压促进入BMSCsOPG表达,同时抑制其OPGL表达.     

钴铬离子对成骨细胞细胞毒性及对其分泌骨保护素及其配体的影响

[目的]观察金属Co2+、Cr3+离子对小鼠成骨细胞(MC3T3E1)的细胞毒性以及在Co2+、Cr3+离子刺激下对成骨细胞分泌RANKL、OPG的影响.[方法]体外培养成骨细胞.MTT法检测细胞活力.ELISA法对培养上清液RANKL、OPG浓度进行检测.[结果]MTT显示与对照组相比,钴铬离子使成骨细胞的细胞活力明显下降.成骨细胞暴露在钴铬离子下,与对照组相比,24 h、48 h后:OPG的分泌分别增长32.1%、17.8%(P<0.05);RANKL的分泌量分别是对照组的61.6倍、13.8倍(P<0.05);RANKL/OPG比率分别升高51.4倍、12.3倍.[结论]金属离子对成骨细胞有细胞毒性,可刺激成骨细胞释放RANKL、OPG,并上调RANKL/OPG的比值.     

细胞因子、激素调节骨保护素和骨保护素配体基因表达及破骨细胞功能的研究进展

破骨细胞(Osteoclast OC)是骨吸收细胞，已知其功能与分化的调节是由成骨细胞(Osteoblast OB)完成的。发现了其调节的新的分子学机理。破骨细胞的分化依赖于成骨／基质细胞，在研究破骨细胞的过程中发现了一种由成骨／基质细胞产生的因子一骨保护素(Osteoporotegerin OPG)及骨保护素配体(Re-     

痩素对成骨细胞骨保护蛋白mRNA表达的影响初探

目的 初步探讨瘦素(Leptin)对成骨细胞骨保护蛋白(OPG)mRNA表达的影响。方法 用SYBR GreenⅠ染料实时监测定量RT-PCR的方法测定骨保护蛋白(OPG)mRNA表达。结果 瘦素(Leptin)使成骨细胞骨保护蛋白OPG mRNA表达呈剂量和时间依赖性降低。结论 瘦素(Leptin)作为一种内分泌因子，可直接与成骨细胞上leptin受体特异结合，通过受体后信号转导下调节成骨细胞OPG mRNA表达，使OPG mRNA表达降低，和其它因子共同参与骨再建调节。     

阿胶强骨口服液含药血清对胎鼠成骨细胞护骨素及护骨素配体mRNA表达的影响

目的研究阿胶强骨口服液含药血清对胎鼠成骨细胞中OPG、RANKL表达的影响,探讨阿胶强骨口服液治疗骨质疏松的分子机制。方法 3月龄Wistar大鼠(雌雄各半)30只,随机分为阿胶强骨口服液,雌激素,及生理盐水对照组,灌胃7d后,制备实验组和对照组的含药血清。将新生SD大鼠分离的颅骨成骨细胞,制成单细胞悬液,消化传代,取二代培养的成骨细胞,制成细胞悬液。培养细胞被分为5组,分别加同体积药液,对照组仅加培养液,继续培养。采用MTT比色分析、3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)渗入法测定成骨细胞增殖,用放免法测定细胞内BGP含量,RT-PCR测定胎鼠成骨细胞中OPG、RANKL mRNA的表达。结果阿胶强骨口服液含药血清以剂量依赖方式促进成骨细胞的增殖,与对照组相比,差异显著(P<0．05)。成骨细胞OPG基因mRNA表达在阿胶强骨口服液含药血清100ml／L时最强,与雌激素组比较无显著性差异(P>0 05),且明显高于对照组(P<0．05)。成骨细胞RANKL基因mRNA表达在1000ml／L阿胶强骨口服液含药血清与雌激素组比较无显著性差异(P<0 05),且明显低于对照组(P<0．05)。结论阿胶强骨口服液可在细胞水平上促进骨的合成代谢及前成骨细胞的有丝分裂,分子水平上调节 OPG／RANKL表达而治疗骨质疏松。     

雌激素对去卵巢大鼠松质骨中骨保护素mRNA表达的影响

目的 :通过去卵巢大鼠予雌激素后 ,腰椎内OPGmRNA的表达进一步探讨雌激素防治骨质疏松的分子机制。方法 :雌性 3月龄SD大鼠 3 6只 ,随机均分为卵巢切除 +雌激素 (倍美力 )预防组 (EP) ,骨质疏松组 (卵巢切除OVX)及正常对照组 (SHAM ) 3组。术后 12周处死大鼠 ,取第 3腰椎椎体 ,异硫氰酸胍一步法提取总RNA ,嵌套式反转录聚合酶链反应 (NRT PCR)扩增待检测各组OPGmRNA的表达。同时取第 4腰椎椎体 ,行骨组织形态计量学检测。结果 12例腰椎骨组织中 ,EP组 10例OPGmRNA呈阳性表达 (阳性率 83 .3 % ) ,OVX组 2例呈阳性表达 (阳性率 16.7% ) ,而SHAM组 12例均呈阳性表达。统计学处理 :EP组与OVX组有高度显著性差异 (P <0 .0 1) ,EP组与SHAM组无显著性差异 (P >0 .0 5 )。骨组织形态计量学检测 ,OVX组骨体积、骨小梁数目均比SHAM组显著减少 ,而骨小梁间隔显著增大。与OVX组比较 ,EP组骨体积、骨小梁厚度增加 ,骨小梁间隔稍有减小 ,无统计学意义。EP对骨小梁数目无明显影响。结论 :雌激素通过增强松质骨中OPGmRNA的表达 ,抑制破骨细胞性骨吸收 ,从而对去卵巢大鼠的骨质疏松有明显的预防作用。     

雄激素对体外成骨细胞QPG及其配体基因表达的影响

目的检测小鼠胎鼠成骨细胞体外培养并将不同浓度雄激素干预后,OPG和OPGLmRNA表达的变化,探讨雄激素在成骨细胞介导破骨细胞分化、活化过程中的调控机制。方法分离得到小鼠胎鼠颅盖骨成骨细胞,培养传代并选择第二代细胞用于实验;对第二代成骨细胞实施含10-10mol/L、10-9mol/L、10-8mol/L3种浓度雄激素的培养液干预;抽提细胞RNA,采用RT-PCR方法半定量观察成骨细胞中OPG和OPGL基因mRNA表达的变化。结果实验选用的各浓度组均未出现细胞毒性反应,雄激素干预使成骨细胞中OPG基因表达上调,而OPGL与OPG比率随时间呈递减趋势。结论雄激素可以特异性地在转录水平调节成骨细胞中OPG和OPGL基因的表达。     

乳铁蛋白对大鼠成骨细胞增殖与分化的影响

目的观察乳铁蛋白(Lf)对大鼠成骨细胞增殖分化的影响,初步探讨Lf对成骨细胞的作用机制。方法用不同浓度的Lf干预成骨细胞,在不同时间分别测定细胞数目的增殖、细胞内碱性磷酸酶活性,并用半定量RT-PCR法检测成骨细胞内RANKL/OPG mRNA基因的表达。结果Lf呈时间和浓度依赖性地促进大鼠成骨细胞增殖及碱性磷酸酶活性,每组实验在不同时间的差异均有显著的统计学意义(P<0.05),其中400μg/ml组在72h时细胞增殖数目达到最大。在碱性磷酸酶活性方面,400μg/ml组在72h时则有所下降。不同浓度Lf、不同作用时间均能促使成骨细胞中OPG mRNA表达增加,同时抑制RANKL mRNA表达。结论Lf能促进成骨细胞的增殖分化,并且能够调节成骨细胞RANKL/ OPG mRNA表达,从而抑制破骨细胞介导的骨吸收。     

Raji-MG63细胞共培养体系中心肌营养蛋白样细胞因子1(CLCF1)对RANKL/OPG比值及成骨细胞分化的影响

目的 探讨Raji-MG63细胞共培养体系中,心肌营养蛋白样细胞因子1(cardiotrophin-like cytokine factor 1,CLCF1)基因对骨保护素(osteoprotegerin,OPG)、核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of NF-κB ligand,RAN...     

三七总甙对成骨细胞增殖、分化及0PG表达影响的研究

目的 观察不同剂量的三七总甙对体外培养大鼠成骨细胞增殖、分化及OPG表达的影响，探索体外作用的机制和最佳剂量。方法 第2代培养的成骨细胞分别加入终浓度为0μg／ml、10μg／ml、50μg／ml、100μg／ml的三七总甙，观察细胞生长、钙结节形成情况，碱性磷酸酶(ALP)染色、分泌量检测，骨钙素(OCN)检测，MTT法观察成骨细胞增殖，免疫组化SP法结合阳性细胞计数法检测成骨细胞OPG表达。结果 成骨细胞在7d可铺满瓶壁，30d可形成钙结节，三七总甙可促进成骨细胞的增殖ALP、OCN的分泌，以50μg／ml时作用明显。三七总甙可促进成骨细胞OPG的表达，在50μg／ml时作用明显。结论 三七总甙可促进大鼠成骨细胞的增殖、分化，促进成骨细胞OPG的表达，以50μg／ml时作用明显。     

乳铁蛋白促进成骨细胞增殖的最佳浓度及促进分化的最佳时间

目的 探索乳铁蛋白促进大鼠成骨细胞增殖的最佳浓度及1000μg/mL乳铁蛋白对促进成骨细胞分化的最佳时间。方法 用混合酶消化法分离大鼠颅盖骨成骨细胞进行原代培养;不同浓度乳铁蛋白干预成骨细胞,浓度分别为0、0.1、1、10、100、200、400、600、800和1000μg/mL,在1、3、5、7d后分别采用CCK-8法测定细胞增殖;用1000μg/mL的乳铁蛋白干预成骨细胞7、14、21d后,采用碱性磷酸酶染色法检测细胞内碱性磷酸酶的活性。结果 1.CCK-8法测定细胞增殖结果显示,低于100μg/mL浓度乳铁蛋白组其OD值随着浓度的增高而增高,而高于100μg/mL浓度乳铁蛋白组其OD值随着乳铁蛋白浓度的增高而递减;2.碱性磷酸酶染色法结果显示,1000μg/mL的乳铁蛋白在干预第21天时碱性磷酸酶活性最高。结论 100μg/mL乳铁蛋白是促进大鼠成骨细胞增殖的最佳浓度;1000μg/mL的乳铁蛋白促进成骨细胞分化作用呈时间依赖性。     

α-玉米赤霉醇对小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化过程中OPG和RANKL蛋白表达的影响

目的 探讨α-玉米赤霉醇(α-zearalanol,α-ZAL)对小鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs)向成骨细胞增殖、分化的影响。方法 采用全骨髓培养差速贴壁法体外分离培养小鼠骨髓间充质干细胞,取第3代细胞分为空白对照组、雌二醇阳性对照组、低浓度α-ZAL组、中浓度α-ZAL组,高浓度α-ZAL组。镜下每天观察细胞形态变化,碱性磷酸酶染色鉴定成骨细胞纯度,MTT实验测定细胞增殖活性绘制细胞生长曲线,采用酶联免疫吸附法(ELISΑ)测定碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨形态发生蛋白2( Bone morphogenetic protein-2,BMP-2),运用蛋白免疫印迹法（Western blotting,WB）检测护钙素（Osteoprotegerin,OPG）和NF-KB受体活化配体（Receptor actiator of nuclear factor-KB ligand, RANKL）的蛋白水平表达变化。结果 不同浓度的α-玉米赤霉醇可显著的促进小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞增殖、分化,增加细胞活性（P<0.05）,明显提高小鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化后ALP和BMP-2的表达（P<0.05）,并且显著的上调了成骨细胞内OPG/ RANKL的表达率（P<0.05）。结论 不同浓度的α-玉米赤霉醇可以促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞增殖、分化,并且通过上调OPG/ RANKL的表达率抑制成骨细胞细胞向破骨细胞分化,有望成为临床骨折疏松症治疗的激素替代药物。     

蛇床子素对大鼠成骨细胞中0PG和RANKL基因mRNA表达的影响

目的 观察蛇床子素(OST)对体外培养的大鼠成骨细胞中OPG中RANKL基因表达的影响。方法 新生SD大鼠颅骨成骨细胞培养,设空白对照组和用不同浓度蛇床子素培养液(10-7,10-6,10-5mol／L)培养处理的大鼠成骨细胞为实验组,未经处理的细胞为空白对照组,分别提取48 h和7 d的细胞总mRNA,用RT-PCR技术分析OPG／RANKL的mRNA表达情况进行半定量比较。结果48h两基因都已有表达,相对空白对照组,OST上调OPG mRNA的表达(P<0.05),但对RANKL的表达无显著影响,OPG／RANKL比值变大;7 d时OPG和RANKL表达都有增加,OST上调OPG的表达(P<0.01),OST在10-5mol／L下调RANKL的表达(P<0.05),OPG／RANKL比值增大。结论OST可以增加大鼠成骨细胞OPG的表达,同时轻微抑制RANKL的表达,早期对RANKL的表达影响不大。     

黄瓜籽总皂苷对MC3T3-E1细胞分化及SPARC、OPG/RANKL表达的影响

目的观察黄瓜籽总皂苷提取物(cucumber seed saponins,CSS)对小鼠成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化和矿化的影响,以及与骨质疏松相关的SPARC、OPG/RANKL/RANK信号通路的作用。方法通过MTT实验、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性检测、茜素红染色,考察不同浓度CSS对MC3T3-E1细胞增殖、分化及矿化的影响;采用RT-PCR方法检测SPARC、OPG/RANKL mRNA表达水平; Western blot检测SPARC、OPG/RANKL的蛋白表达量。结果与阳性对照组相比,CSS能明显促进MC3T3-E1细胞增殖(P0.05),CSS高、中剂量组能明显提高MC3T3-E1细胞ALP活性及钙化结节数量(P0.05);与空白组相比,CSS不同剂量组均明显上调SPARC、OPG/RANKL mRNA及蛋白表达水平(P0.05)。结论黄瓜籽总皂苷能够促进成骨细胞MC3T3-E1的增殖、分化及矿化能力,并通过上调SPARC、OPG/RANKL的表达水平提高MC3T3-E1细胞的成骨能力。     

RANKL/QPG在青少年特发性脊柱侧凸患者低骨量发生机制中的作用

目的从骨髓间质干细胞（MSCs）水平探讨RANKL及OPG与青少年特发性脊柱侧凸（AIS）患者骨量降低的关系。方法46例12-17岁志愿者分为2组,其中AIS组30例,年龄12-17岁,平均14.1岁。正常对照组16例,年龄12-17岁,平均14.7岁。AIS组Lenke1型14例,2型2例,3型6例,5型8例。2组均采用双能X线吸收测量仪测量BMD,测量部位包括非优势侧股骨近端及腰椎。分别从2组志愿者髂前上棘处骨穿刺抽取10ml骨髓,肝素抗凝。体外密度梯度离心法分离培养MSCs,扩增至P3代行表型鉴定,RT-PCR法检测2组MSCs中RANKL及OPG的 mRNA表达强度。结果AIS组腰椎（L2-L4）及股骨近端的BMD值明显低于正常对照组。AIS组RANKL的 mRNA表达显著强于对照组（P〈0.01）,而OPG的 mRNA表达显著低于对照组（P〈0.01）。结论RANKL及OPG在MSCs水平表达强度的异常可能与AIS骨量降低的分子机制相关。     

联合甲状旁腺激素和普萘洛尔对人成骨细胞增殖及OPG和RANKL mRNA表达的影响

目的 联合甲状旁腺激素(rhPTH 1-34)和普萘洛尔(PRO)处理体外培养的人松质骨源性成骨细胞(HOB),观察其对人成骨细胞增殖及骨保护素(OPO)和核因子KB受体活化因子配体(RANKL )基因表达的影响,探讨其对骨代谢影响的可能机制。方法 (1)以成人骼骨和股骨颈部松质骨为原料,分离培养原代人成骨细胞并对其鉴定。(2)以人成骨细胞为体外实验模型,固定浓度rhPTH1- 34 (50 ng/ml)和不同浓度PRO(0. 1μM,1μM,10μM)分别及联合刺激体外培养的人成骨细胞72 h后,采用CCK-8法检测细胞增殖能力,用实时荧光定量PCR法检测成骨细胞OPG和RANKL基因的表达。结果 rhPTH1-34和PRO单独给药均可促进成骨细胞增殖(P <0.05),在PRO 10μM时成骨细胞OPG基因的表达量增加(P<0.05),且大于RANKL基因的表达量;相反,联合rhPTH 1-34和PRO给药抑制成骨细胞增殖(P<0.05),并抑制成骨细胞OPG和RANKL基因的表达(P<0.05),且随着PRO浓度的增加,OPG和RANKL基因表达均呈下降趋势。结论 rhPTH1- 34和PRO单独给药均可促进成骨细胞增殖,而两者联合给药后却抑制了成骨细胞的增殖,可能是通过调控OPG和RANKL基因的表达来实现的。     

葡萄糖对人牙周膜成纤维细胞OPG、RANKLmRNA表达的影响

目的：以体外培养的人牙周膜成纤维细胞（HPDLF）为研究对象,观察不同浓度的葡萄糖对HPDLF中骨保护素（OPG）、核因子KB受体活化剂配体（RANKL）mRNA表达的影响,探讨葡萄糖在牙槽骨吸收中的作用。方法：组织块法体外原代培养HPDLF并鉴定,选择4-8代的HPDLF作为实验的靶细胞,不同浓度的葡萄糖（0、5．5、11．1、16．7、22．2、33．3mmol／1）干预HPDLF,半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测HPDLF中OPG、RANKL mRNA的表达。结果：高浓度的葡萄糖可下调HPDLF中OPG mRNA的表达,呈剂量依赖性;可上调RANKL mRNA的表达,也呈剂量依赖性,且使RANKL／OPG mRNA的比值随着葡萄糖浓度的增高而呈现持续上升的趋势。结论：糖尿病时,牙周组织中高浓度的葡萄糖,可下调OPG的表达,上调RANKL的表达,使RANKL／OPG的比值升高,调节破骨细胞分化,刺激骨吸收,导致牙槽骨的破坏,加重牙周病的病情。