阳性脂质体与非编码DNA复合物的抗肿瘤作用

本文介绍了阳性脂质体与非编码DNA形成的复合物经局部或全身给药后可产生特异和非特异的抗肿瘤免疫反应以及它产生的一些毒副作用。     

SIRNA表达载体与阳离子脂质体复合物转染HEPG-2细胞的实验研究

目的 观察针对HIF1 岬腟IRNA表达载体Genesil-HIF1a与阳离子脂质体复合物对EPG-2细胞增值及其对HIFl a表达的影响.方法 以pGenesil表达载体分别设计阳性对照(pG-shRNA-Hif-1a),阴性对照(pG-shRNA-HK),未处理细胞为空白对照(KB).用3ug:15ul配比的pGenesil-SIRNAc与阳离子脂质体的复合物转染HEPG-2细胞,Q418 400mg/ml培养转染后的细胞10天,拍荧光照片.37℃,5%CO2,5%O2、90%N2培养36小时,用RT-PCR测定HIF-1a mRNA的表达,用cck-8测细胞增殖.结果 培养36小时的阳性对照组Hif-1a m RNA表达明显减低(P＜0.05),对Hepg-2细胞增殖抑制作用明显(P＜0.05);结论 3ug:15ul计量配比组pGenesil-hif-1a与阳离子脂质体复合物可有效转染 Hepg-2细胞,能有效抑制HEPG-2细胞Hif-1a的表达,并抑制其增殖.     

siRNA表达载体与阳离子脂质体复合物转染HepG2.2.15细胞实验研究

目的:观察针对HBV X的siRNA表达载体pGenesil-HBV X与阳离子脂质体的复合物对HepG2.2.15细胞转染效果及其对HBVM表达的影响。方法:以pGenesil-siAFP表达载体和非转染细胞分别作非特异性序列对照组和空白对照组,用不同配比浓度pGenesil-HBV X与阳离子脂质体的复合物转染HepG2.2.15细胞,荧光显微镜下观察并计算转染阳性细胞百分率,筛选出最佳转染效率的剂量配比。于转染后24h、48h、72h采用时间分辨荧光免疫测定技术(TRFIA)检测上清液中HBsAg和HBeAg。结果:pGenesil-HBV X与阳离子脂质体复合物8μL∶2.5μg剂量配比组的平均转染率达到了(55.1±4.3)%,且不影响细胞活性;转染后48h和72h后该siRNA表达载体对HepG2.2.15细胞表达HBsAg和HBeAg抑制作用显著(P<0.05)。结论:8μL:2.5μg剂量配比组的pGenesil-HBV X与阳离子脂质体复合物是最佳的转染剂量配比,能有效抑制HepG2.2.15细胞表达HBsAg和HBeAg。     

不同阳离子脂质体介导基因转染效率的比较研究

目的评估不同脂质体介导基因转染条件及效率。方法以大肠杆菌β-gal基因为报告基因，比较三种阳离子脂质体（lipen、lipotecfamine和Dosper）在不同的脂质体：DNA比例、不同细胞汇合度、不同转染时间及血清存在条件下转染情况。通过x-gal染色法观察不同脂质体的转染效率。结果三种阳离子脂质作的最优条件不同。Dosper转染效率最高，蓝染细胞达18％。结论通过条件优化可使脂质体转染效率提高。有望成为一种有效的非病毒基因转移方法应用于基因治疗。     

GFP质粒DNA/阳离子脂质体复合物的制备及其体外表达

目的 为基因免疫和基因治疗寻找一种简单、经济、有效的DNA投递系统。方法 采用逆向蒸发法,用卵磷脂、胆固醇、十八胺制备成阳离子脂质体包封含绿色荧光蛋白基因的真核表达质粒pEGFPC1,对三种不同DNA加入量所形成的DNA／脂质体复合物的微球形、包封率、电荷性、转染真核细胞的效果以及对细胞的毒性作用进行初步检测研究。结果 所获得的DNA／脂质体复合物呈球形、平均粒径为562nm;包封率达55％～65％,为阳离子脂质体;都能有效转染真核细胞,但转染效率有差异,DNA／脂质体混悬液中DNA含量、混悬液的加入量以及细胞的作用时间,都对细胞毒性有不同程度的影响。结论 该方法可作为提高基因免疫效果的简单、经济、有效的手段之一。     

SIRNA表达载体与阳离子脂质体复合物转染HEPG-2细胞的实验研究

目的 观察针对HIF1 α的SIRNA表达载体Genesil-HIF1 α与阳离子脂质体复合物对HEPG-2细胞增值及其对HIF1 α表达的影响.方法 以pGenesil表达载体分别设计阳性对照(pG-shRNA-Hif-1 α),阴性对照(pG-shRNA-HK),未处理细胞为空白对照(KB).用3 μg:15μl配比的pGenegil-SIRNA与阳离子脂质体的复合物转染HEPG-2细胞,G418 400mg/ml培养转染后的细胞10天,拍荧光照片.37℃、5%CO2、5%O2、90%N2培养36小时,用RT-PCR测定HIF-1 α mRNA的表达,用cck-8测细胞增殖.结果培养36小时的阳性对照组Hif-1 α mRNA表达明显减低(P<0.05),对Hepg-2细胞增殖抑制作用明显(P<0.05);结论 3μg:15 μl计量配比组pGenesil-hif-1 α与阳离子脂质体复合物可以有效转染Hepg-2细胞,能有效抑制HEPG-2细胞Hif-1 α的表达,并抑制其增殖.     

SIRNA表达载体与阳离子脂质体复合物转染HEPG-2细胞的实验研究

目的 观察针对HIF1 岬腟IRNA表达载体Genesil-HIF1a与阳离子脂质体复合物对EPG-2细胞增值及其对HIFl a表达的影响.方法 以pGenesil表达载体分别设计阳性对照(pG-shRNA-Hif-1a),阴性对照(pG-shRNA-HK),未处理细胞为空白对照(KB).用3ug:15ul配比的pGenesil-SIRNAc与阳离子脂质体的复合物转染HEPG-2细胞,Q418 400mg/ml培养转染后的细胞10天,拍荧光照片.37℃,5%CO2,5%O2、90%N2培养36小时,用RT-PCR测定HIF-1a mRNA的表达,用cck-8测细胞增殖.结果 培养36小时的阳性对照组Hif-1a m RNA表达明显减低(P＜0.05),对Hepg-2细胞增殖抑制作用明显(P＜0.05);结论 3ug:15ul计量配比组pGenesil-hif-1a与阳离子脂质体复合物可有效转染 Hepg-2细胞,能有效抑制HEPG-2细胞Hif-1a的表达,并抑制其增殖.     

阳离子脂质体介导的肺癌细胞基因转染效率的比较研究

目的 提高阳离子脂质体介导的肺癌细胞基因转染效率。方法 采用表达Ｅ．ｃｏｌｉβ－半乳糖苷酶的ｐＣＭＶβ报告基因质粒及组化染色评价阳离子脂质体的转染效率。优化脂质体介导肺癌细胞基因转染效率的条件包括：脂质体：ＤＮＡ电荷比率，ＤＮＡ转染剂量，阳离子脂质体的类型。结果 当阳离子脂质体：ＤＮＡ电荷比率（＋／－）为３：１时，ｐＣＭＶβ的剂量为４ｕｇ／孔（２４孔板）时，阳离子脂质体ＤＯＳＰＥＲ介导肺癌细胞株Ｓ     

阳离子脂质体介层的外源基因转染小鼠脾细胞的方法学探讨

目的：探讨高效阳离子脂质体介导外源基因转染体外生长的小鼠脾细胞的方法。方法：用新型阳离子脂质体DOSPER包裹携带lac Z报告基因的质粒pCAGGS-lacZ按3种方法转染小鼠脾细胞，（1）常规方法直接转染；（2）脾细胞经刀豆球蛋白A（ConA)活化后再按常规方法转染；（3）用黏附辅助脂质体法（adhesion-assisted lipofection,AAL）转染脾细胞。转染效率用X－gal染色法测定。结果：上述3种方法的转染效率依次为＜0．010，0．057及0．199，经方差分析，3种方法转染效率的差异有显著性（P＜0．01，n=3).结论：AAL法介导外源基因转染体外生长的小鼠脾细胞的转染效率最高。     

流感疫苗脂质体干粉制备方法对其免疫原性影响研究

目的:考察薄膜分散及冻融冻干法制备H1N1单价流感疫苗脂质体呼吸道免疫效果,为减毒活疫苗脂质体的制备奠定基础?方法:将实验小鼠分为4个实验组(脂质体疫苗干粉肺部免疫组?腹腔免疫组,非脂质体疫苗原液肺部免疫组?腹腔免疫组),和1个阴性对照组?实验组以每只4 ?滋g和6 ?滋g血凝素含量(H1N1亚型)肺部免疫或腹腔免疫,以未免疫小鼠(PBS给药)为阴性对照?免疫7?14?28 d,血凝抑制试验(HI)检测免疫后小鼠血清抗HA抗体水平,ELISA检测血清中细胞因子含量?结果:两种方法制备的脂质体组6 ?滋g剂量肺部免疫抗体滴度高于4 ?滋g剂量肺部免疫(P < 0.05);两种方法制备脂质体肺部免疫抗HA抗体滴度高于非脂质体肺部免疫(P < 0.05)?脂质体组肺部免疫抗HA抗体滴度高于非脂质体组腹腔免疫(P < 0.01);薄膜分散法优于冻融冻干法组;两种方法制备的脂质体肺部免疫产生的白细胞介素(IL)-2与干扰素(IFN)-γ水平高于疫苗原液腹腔免疫,均高于阴性对照组?结论:两种方法制备流感疫苗脂质体肺部给药均能有效诱发体液免疫及细胞免疫,薄膜分散法优于冻融冻干法,均高于疫苗原液组;冻融冻干法肺部免疫14 d即产生免疫应答,而原液腹腔免疫抗体滴度比仅为1.8?冻融冻干法组脂质体肺部免疫产生的细胞因子水平也明显高于疫苗原液腹腔免疫组?说明冻融冻干法在疫苗脂质体制备中具有可行性?     

多聚胺阳离子脂质体转染体系的构建

目的 制备多聚胺阳离子脂质体（Polyamine Cationic liposome，PCL），转染哺乳动物细胞，评估其转染效率及细胞毒性，筛选高效低毒的阳离子脂质体转染体系。方法 多聚胺阳离子脂质TC—Chol与中性磷脂DOPE以一定比例，制备PCL，通过转染以增强型绿色荧光蛋白为报告基因的质粒PIRES2-EGFP入Hela细胞，倒置荧光显微镜下检测转染细胞的报告基因表达，通过MTT法，检测细胞毒性，筛选阳离子脂质体与DNA结合的最佳比例及最佳转染时间。结果 多聚胺阳离子脂质体与DNA的质量比为3～4：1时可达到高效低毒，转染后48h转染效率最高。结论 由TC—Chol与DOPE制备的多聚胺阳离子脂质体可提高转染效率，在一定条件下可达到相对高效低毒，为基因转染和基因治疗提供可靠的实验室依据。     

流感疫苗脂质体干粉的稳定性

考察制备的流感疫苗脂质体干粉的物理稳定性,确定加入的抗氧化剂维生素E（VitE）用量以及在该用量下产品的生物学稳定性。将样品分别储存于（37±2） ℃,（25±2） ℃,4 ℃下,于规定时间取样测定包封率,以此考察其物理稳定性,发现（37±2） ℃下储存14 d内稳定;（25±2） ℃下90 d内稳定;4 ℃下180 d内稳定。脂质体中加入不同量VitE,储存于（37±2） ℃下,于不同时段取样测定包封率和氧化指数,筛选最佳VitE用量为5%,将含5%VitE的流感疫苗脂质体干粉于（37±2） ℃储存,于1,14,21 d取样,以含6 μg血凝素的流感疫苗脂质体对小鼠肺部灌注免疫后用红细胞凝集抑制法测定抗体滴度,以考察其生物学稳定性,发现该干粉储存21 d后免疫后与免疫前抗体滴度比达19.1,表明流感疫苗脂质体干粉（37±2） ℃储存21 d的生物学稳定性良好。     

流感疫苗脂质体干粉黏膜免疫研究

目的考察H3N2单价流感疫苗脂质体诱发呼吸道黏膜免疫的效果,并比较呼吸道不同部位产生抗体水平的差异。方法将实验小鼠分为非脂质体疫苗原液组、脂质体疫苗冻干粉组、阳性对照和阴性对照组（n=5）。非脂质体疫苗原液组和脂质体疫苗冻干粉组各以每只4μg和6μg血凝素含量（H3N2亚型）滴鼻免疫,同时以非脂质体疫苗原液腹腔给药和脂质体疫苗冻干粉腹腔给药作为阳性对照,以未免疫小鼠（磷酸盐缓冲液给药）作为阴性对照。免疫28 d后,采用间接ELISA法检测血清IgG和呼吸道黏膜sIgA分泌水平。结果脂质体滴鼻给药诱导的黏膜sIgA水平高于腹腔给药免疫组（P〈0.05）,上呼吸道（鼻咽部）黏膜sIgA水平明显高于下呼吸道（肺部）（P〈0.01）;与非脂质体组滴鼻免疫相比,上呼吸道脂质体组诱发的sIgA水平较低（P〈0.01）,而下呼吸道脂质体组诱发的sIgA水平较高（P〈0.05）。结论流感疫苗脂质体滴鼻给药能有效诱发体液免疫和呼吸道黏膜免疫,上呼吸道黏膜免疫水平高于下呼吸道,但与非脂质体相比,脂质体在下呼吸道（肺部）能表现出更好的免疫佐剂效应。     

多价阳离子脂质体介导重组基因pCKM-mPTH治疗甲状旁腺功能低下症的实验研究

目的探讨多价阳离子脂质体介导的pCKM-mPTH质粒治疗甲状旁腺功能低下症(HPT)的最佳方案。方法用DNaseⅠ敏感性试验测定脂质体对质粒的保护作用,用不同比例的脂质复合物及裸质粒进行体内外转染,收集细胞培养液和血清,采用放射免疫法测定其甲状旁腺激素(PTH)含量。结果脂质复合物比例为2∶1时,即对DNA有明显的保护作用;在体外转染实验中,复合物比例在3∶1时PTH表达量最高,为每24小时(16.4±4.8)pg/10 000细胞,而在此比例下pCKM-mPTH质粒达20μg/100μl时,模型体内PTH的血清浓度最高,为35.9 pg/m l±2.2 pg/m l。结论与裸质粒相比,多价阳离子脂质体更适宜于作为HPT基因治疗的非病毒载体,而其介导重组质粒pCKM-mPTH直接转染肌肉的良好效能取决于脂质复合物的构成比例和剂量。     

新型阳离子脂质体的制备及其转染效率的测定

目的制备以新型细胞转染素为阳性成分的阳离子脂质体,作为基因载体,用于基因转染的实验研究和肺部疾病的基因治疗.方法用薄膜法制备N4-精胺胆固醇羰酰氨阳离子脂质体,通过电镜观察和电泳,检测其形态、结构和细胞转染条件,并对SPC肿瘤细胞进行转染,评估其转染效率.结果制备的新型阳离子脂质体具有良好的微囊形态,当脂质体∶质粒为(6～8)∶1时,其转染效率可达60%.结论成功制备了新型阳离子脂质体,在适当条件下其具有较高的转染活性,为以后的基因转染和基因治疗打下基础.     

新型阳离子核酸载体的细胞转染效率研究

目的新型阳离子核酸载体LW13-2进行研究,分析其细胞毒性和基因转染效率,探讨其作为核酸载体的可能性。方法使用MTT比色法分析LW13-2与DNA在不同比例下的细胞毒性。选用绿色荧光蛋白表达质粒EGFP为报告基因,以人胚胎肾HEK293细胞为工具细胞,在荧光显微镜下观察计数,计算转染效率。结果当LW13-2与DNA的质量比为(1~3)∶1时,细胞毒性最低。LW13-2与DNA的质量比为3∶1时,转染作用4 h,在无血清培养基中继续培养48 h,得到LW13-2的最大转染效率为87.6%。结论通过与市售成熟转染试剂Lipofectamine 2000的对比,新型阳离子核酸载体在大幅提高基因转染效率的同时并没有增加其细胞毒性,有望成为核酸转移的有效载体,为相关研究及基因的靶向治疗研究提供基础。     

自制多聚胺阳离子脂质体转染效率及细胞毒性的评价

目的: 评估制备的多聚胺阳离子脂质体转染哺乳动物细胞的转染效率及细胞毒性. 方法: 多聚胺阳离子脂质TC-Chol与中性磷脂DOPE以3: 1摩尔比,制备多聚胺阳离子脂质体,通过转染以增强型绿色荧光蛋白为报告基因的质粒PIRES2-EGFP入HeLa细胞, Hep2细胞,倒置荧光显微镜下检测转染细胞的报告基因表达,通过MTT法,检测细胞存活分数,并以Lipofectamine2000为对照,评价制备阳离子脂质体转染效率及细胞毒性. 结果: 多聚胺阳离子脂质体转染效率略低于Lipofectamine 2000,但细胞毒性较低,为一种相对高效低毒的阳离子脂质体. 结论: 多聚胺阳离子脂质体为一种相对高效低毒的阳离子脂质体,在基因转染和基因治疗方面具有较广阔的前景.     

冻融-冻干法制备的流感疫苗脂质体的细胞免疫研究

分别用冻融-冻干法、薄膜分散-冻干法制备流感疫苗脂质体干粉,通过小鼠肺部免疫后,从细胞免疫水平考察两种方法制备脂质体的免疫原性。将小鼠分为非脂质体疫苗原液组(non-liposome)、薄膜分散-冻干法制备流感脂质体疫苗组、冻融-冻干法制备流感疫苗脂质体组、阳性对照和阴性对照组(n=5)。脂质体疫苗冻干粉组以每只血凝素含量(以H1N1计)6 μg肺部免疫,以非脂质体疫苗原液每只血凝素含量6 μg腹腔给药作为阳性对照,以未免疫小鼠(PBS给药)为阴性对照。免疫28 d,MTT法检测脾淋巴细胞的增殖,流式细胞术检测CD4⁺与CD8⁺细胞。结果显示:两种方法制备的流感疫苗脂质体冻干粉均可诱导细胞免疫,且免疫效果相当,说明冻融-冻干法有望进一步应用于减毒活疫苗制备。     

阳离子脂质体介导小干扰RNA转染EOMA细胞时转染条件的优化

目的 优化在阳离子脂质体Lipofectamine^TM2000介导下将小鼠NF-κB的小干扰RNA（siRNA）转染入EOMA细胞时的转染条件.方法 将1.0 μl和1.5 μl的Lipofectamine^TM2000与20 pmol、30 pmol、40 pmol、50 pmol 、60 pmol的带荧光标记的siRNA分别组合,制备成相应的转染混合物,转染小鼠血管瘤内皮细胞（EOMA细胞）,于转染24 h后在荧光显微镜下计数阳性细胞率、MTT法检测各转染条件下EOMA的细胞活性.结果 在siRNA量相同的情况下,分别采用1.0 μl和1.5 μl的Lipofectamine^TM2000进行转染其转染效率、细胞毒性无明显差异（P＞0.05）;转染混合物中siRNA浓度为50 pmol时,转染效率最高达到86%,继续增加siRNA的浓度,转染效率提高并不明显;siRNA浓度为60 pmol时转染混合物表现出较高的细胞毒性.结论 以1.0 μl Lipofectamine^TM2000与50 pmol的siRNA组成转染混合物可以实现对EOMA细胞高效转染并保持较高的细胞活性.