VP3基因联合吉西他滨诱导人膀胱癌细胞凋亡的实验研究

目的探讨鸡贫血病毒VP3基因在人膀胱癌EJ细胞株中的表达,观察VP3基因联合吉西他滨诱导人膀胱癌EJ细胞株凋亡的效应。方法用真核表达载体PcDNA3-VP3转染人膀胱癌EJ细胞株,利用RT-PCR技术检测VP3基因在EJ细胞中的表达状况。观察VP3基因和10^-7mol／L、10^-8mol／L、10^-9mol／L浓度吉西他滨在体外单独或联合用药对人膀胱癌EJ细胞的增殖活性的影响,检测VP3基因和10^-8mol／L浓度吉西他滨在体外单独或联合用药对人膀胱癌EJ细胞的凋亡作用。结果转染PcDNA3-VP3后VP3基因在EJ细胞中表达。转染重组质粒PcDNA3-VP3、吉西他滨各浓度、VP3基因联合吉西他滨各浓度的EJ细胞株的增殖活性明显下降（P〈0．01）。透射电镜下观察到凋亡细胞的典型形态学特征。TUNAL法检测EJ细胞株凋亡率表现为：转染PcDNA3-VP3组高于对照组（P〈0．01）,10^-8mol／L浓度的吉西他滨组高于对照组（P〈0．01）,联合组高于转染PcDNA3-VP3组（P〈0．01）。结论VP3基因表达能高效诱导人膀胱癌EJ细胞株细胞凋亡,联合10^-8mol／L浓度的吉西他滨能增加VP3基因诱导的人膀胱癌EJ细胞株凋亡。     

免疫抑制剂对嗜铬细胞瘤12细胞和L929细胞增殖的影响

目的 初步探讨多种免疫抑制剂对嗜铬细胞瘤12（pheochromocytoma 12，PC12）细胞和L929细胞增殖的影响。方法 对数生长期PC12细胞和L929细胞传代，取细胞株复苏后第3代细胞均以1×10^6／ml密度接种于培养板中，分别加入10、10、10^-7和10^8mol／L环孢菌素A（cyclosporin A，CsA），10^-6、10^-7、10^-8和10^-9mol／LFK506以及10^-3、10^-4、10^-6和10^-8mol／L甲基强地松龙，并设立空白对照组。于培养24、48和72h后，取各浓度药物作用的细胞，采用MTT法检测细胞增殖。结果 高浓度（10mol／L）甲基强地松龙和较低浓度（10^-8～10^-7mol／L）CsA，在给药后48h内对PCI2细胞增殖有明显促进作用，此后促增殖作用不明显；而各个浓度的FK506均无促进PCI2细胞增殖的作用。高浓度甲基强地松龙（10^-3mol／L）和CsA（10^-6～10mol／L）作用24h后，对L929细胞增殖有显著抑制作用，FK506仅在较高浓度（10^-6mol／L）有一过性（仅出现于给药后48h）促进L929细胞增殖的作用。结论 10^-3mol／L甲基强地松龙和10^-8～10^-7mol／LCsA能够在短时间内促进PC12细胞增殖，而10^-3mol／L甲基强地松龙和10^-6～10^-5mol／L CsA对L929细胞增殖有显著抑制作用。     

FBS对成骨生长肽促进BMSCs增殖分化的影响

目的探讨培养液中不同浓度FBS对成骨生长肽(osteogenic growth peptide,OGP)促进BMSCs增殖和分化的影响。方法取8只5周龄SD大鼠四肢骨,贴壁法分离纯化BMSCs并传代,倒置相差显微镜下观察细胞形态。取第3代BMSCs分组培养:分别采用浓度为1×10-10、1×10-9和1×10-8 mol/L的OGP进行培养,以正常培养细胞作为对照组;同时每组设FBS浓度为0、2%、5%、8%和10%5个梯度。培养后1、3、5、7、9、12 d采用MTT法检测细胞增殖,9 d时采用对硝基苯磷酸二钠法测定早期分化指标细胞内ALP活性。结果倒置相差显微镜下观察BMSCs贴壁生长,增殖迅速,呈纤维状涡旋生长,形态典型。MTT检测示,FBS低于5%时各组细胞不能持续增殖,当FBS浓度为8%以上时细胞可持续增殖;OGP 1×10-8 mol/L和1×10-9 mol/L组在FBS各浓度中促增殖效果均大于对照组(P0.05);FBS浓度低于10%时,OGP 1×10-8 mol/L组促增殖效果显著优于其余OGP浓度组(P0.05),但FBS浓度为10%时OGP 1×10-8 mol/L组无促增殖优势。ALP检测示,各组组内随FBS浓度增加,ALP活性增加(P0.05);当FBS浓度为5%、8%时,各OGP浓度组ALP活性均大于对照组(P0.05),且OGP 1×10-8 mol/L组最高(P0.05);当FBS浓度为10%时,各OGP组ALP活性仍大于对照组(P0.05),但OGP1×10-8 mol/L组与OGP 1×10-9 mol/L组差异无统计学意义(P0.05)。结论 8%FBS浓度为OGP促进BMSCs增殖分化的最佳血清浓度,且OGP促进BMSCs增殖分化的最适浓度为1×10-8 mol/L。     

奥曲肽对人结肠癌细胞生长增殖抑制作用的研究

目的研究不同浓度的生长抑素类似物奥曲肽对人结肠癌SW480细胞生长增殖的抑制作用。方法体外培养人结肠癌SW480细胞,MTT比色法测定不同浓度奥曲肽抑制SW480细胞增殖作用,以效价强度最高者为最佳抑制浓度;平皿集落形成法测定奥曲肽抑制体外培养SW480细胞的锚定依赖性生长作用。结果不同浓度奥曲肽对SW480细胞增殖活性具有不同程度的抑制作用,在1×10^-10～1×10^-8mol/L浓度范围内呈剂量依赖性,其中1×10^-8mol/L为最佳抑制浓度;奥曲肽对SW480细胞锚定依赖性生长具有明显的抑制作用,并呈浓度依赖性。结论奥曲肽能抑制体外培养的人结肠癌SW480细胞生长增殖,并在一定范围内呈浓度与时间依赖性。     

辛伐他汀对人牙髓干细胞成骨活性的影响

目的：研究辛伐他汀对人牙髓干细胞成骨活性的影响.方法：将体外分离培养的人牙髓干细胞分别接种于含有不同浓度辛伐他汀的矿化培养液中诱导培养,测定碱性磷酸酶活性及骨唾液酸蛋白基因的表达情况.结果：与对照组比较,适宜浓度辛伐他汀（1×10^-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L）促进人牙髓干细胞的成骨活性作用更为明显,差异具有统计学意义（P＜0.05）,当辛伐他汀浓度为1×10-7mol/L时,促进作用最显著.结论：适宜浓度的辛伐他汀可以有效促进人牙髓干细胞的成骨活性.     

AcSDKP对正常人真皮成纤维细胞表达TGF-β1的影响

目的探讨N-乙酰基-丝氨酰-天冬氨酰-赖氨酰-脯氨酸（AcSDKP）对真皮成纤维细胞表达TGF—β1的影响。方法对人皮肤成纤维细胞原代培养及鉴定后,给予不同浓度AcSDKP（10^-7mol／L、10^-8mol／L、10^-9mol／L、10^-10mol／L、10^-11mol／L）干预,设立空白对照组。WST-8法检测人皮肤成纤维细胞增殖;RT-PCR技术检测人皮肤成纤维细胞TGF～β1 mRNA表达：酶联免疫法检测培养细胞上清液TGF-β1含量。结果与空白对照组相比,各浓度组对成纤维细胞的增殖都有抑制作用,其中10^-10mol／LAcSDKP抑制成纤维细胞增殖作用最强;10^-7mol／L、10^-8mol／L、10^-9mol／L、10^-10mol／LAcSDKP对TGF-β1 mRNA表达有显著的抑制作用,且各浓度组间的抑制作用无差异;10^-8mol／L、10^-9mol／L、10^-10mol／LAcSDKP可使培养上清液中的TGF—β1显著减少,各浓度组间差异无显著性。结论AcSDKP能够抑制人皮肤成纤维细胞增殖及TGF—β1的生成,有望成为病理性瘢痕防治的新方法。     

胰岛素干预后脂肪来源干细胞分泌功能对HaCaT细胞生物学影响

目的 分离培养脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs),探讨胰岛素刺激前后其分泌因子的变化及对人角质形成细胞株HaCaT细胞生物学影响.方法 从腹部外科手术患者自愿捐献皮下脂肪组织中分离、培养ADSCs,取第3代ADSCs调整密度为5×104个/mL,采用1×10-7mol/L胰岛素刺激作为A组,以未加胰岛素刺激作为B组,培养3 d后收集两组ADSCs培养上清液(conditioned medium of ADSCs,ADSC-CM),ELISA法测定其VEGF、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)含量.取人角质形成细胞株HaCaT细胞培养,将第4代细胞根据培养液不同分为4组.A1组:含A组ADSC-CM和2%FBS各0.5 mL:B1组:含B组ADSC-CM和2%FBS各0.5 mL;C1组:1 mL含终浓度为1×10-7mol/L胰岛素的2%FBS;D1组:仅含2%FBS 1 mL.培养3 d采用MTT法测定HaCaT细胞增殖情况:培养12 h Annexin V-FITC双染测定细胞凋亡情况;培养0、12、24、36、48 h采用体外细胞划痕法测定其迁移能力.结果 A组VEGF、HGF含量分别为(643.28±63.57)、(929.95±67.52)pg/mL,B组分别为(286.52±46.68)、(576.61±84.29)pg/mL,组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).细胞增殖测定A1、B1组吸光度值分别为0.881±0.039、0.804±0.041,与C1组(0.663±0.027)及D1组(0.652±0.042)比较,差异有统计学意义(P＜0.01);A1组高于B1组(P＜0.05).A1、B1组凋亡率分别为5.23%±1.98%、8.82%±2.59%,均低于C1组(31.70%±8.85%)和D1组(29.60%±8.41%),差异有统计学意义(P＜0.05),但B1组凋亡率高于A1组(P＜0.05).A1、B1、C1和D1组36 h迁移距离分别为(0.184 6±0.019 2)、(0.159 8±0.029 4)、(0.059 2±0.017 6)及(0.058 2±0.012 3)mm,48 h分别为(0.231 8±0.174 0)、(0.205 1±0.012 1)、(0.079 2±0.008 1)及(0.078 4±0.0117)mm,两时间点A1组和B1组距离明显大于C1组和D1组(P＜0.01),A1组大于B1组(P＜0.05);其他时间点迁移距离差异无统计学意义(P＞0.05).结论 胰岛素干预后ADSCs能更有效促进HaCaT细胞增殖、迁移和抑制凋亡.     

4-羟基他莫昔芬对前列腺基质细胞增殖与凋亡的作用

目的:研究4-羟基他莫昔芬(OHT)对原代培养的前列腺基质细胞增殖与凋亡的影响。方法:以10-8~10-5mol/L的雌二醇(E2)、己烯雌酚(DES)、OHT以及10-8~10-6mol/L的E2与10-7mol/L的OHT混合物分别作用于原代培养的前列腺基质细胞,采用MTT法和TUNEL法分别检测细胞增殖和凋亡。结果:OHT对前列腺基质细胞增殖和凋亡的作用与E2和DES比较均有显著差异(P均<0.05),在10-7~10-5mol/L浓度下表现出与浓度相关(r=-0.383,P=0.005)的抑制增殖作用(P<0.05),10-7mol/L的OHT可以抑制相同甚至更高浓度(10-6mol/L)E2的促增殖作用(P<0.05);OHT在10-8~10-5mol/L浓度下显示与浓度相关(r=0.349,P=0.012)的促凋亡作用(P<0.05),且10-7mol/L OHT的促凋亡作用不能被相同甚至更高浓度(10-6mol/L)E2所逆转(P>0.05)。结论:OHT在一定浓度范围内对原代培养的前列腺基质细胞具有明显的抑制增殖和促凋亡作用,该作用可能不完全是通过竞争性抑制雌激素受体而实现的。     

虾青素对成骨细胞羟自由基氧化损伤的影响

目的：在H2O2胁迫下，研究虾青素增强成骨细胞抗自由基损伤的作用。方法：用H2O2作用MC3T3-E1成骨细胞，建立自由基损伤细胞模型。培养的成骨细胞分为对照组、模型组、虾青素低剂量组（1×10^-7mol／L）、虾青素中剂量组（1×10^-6mol／L）和虾青素高剂量组（1×10^-5mol／L）。测定不同处理组细胞活力、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、活性自由氧（reactive oxygen species，ROS）含量、脂质过氧化物（lipid oxygen，IJP0）含量，同时利用荧光偏振法测定细胞膜流动性。结果：模型组细胞活力、SOD活性、细胞膜流动性均比各剂量虾青素组显著降低（P〈0．01），而ROS、LPO含量均比各剂量虾青素组显著升高（P〈0．01）。结论：H2O2摄入会导致大鼠成骨细胞的氧化损伤，而虾青素可以预防或降低此类损伤对细胞的影响。     

脱氢表雄酮在体外对成骨细胞代谢和IL-1β的影响

目的探讨脱氢表雄酮（dehydroepiandrosterone，DHEA）对离体大鼠成骨细胞和IL-1β的影响。方法体外分离培养大鼠成骨细胞，取传一代细胞，分别给予10^-5mmoL／L、10^-7mmoL／L、10^-9mmol／LDHEA培养72h，以10^-8mmoL／L雌二醇（estradiol，E2）为阳性对照，另设空白对照组。碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色鉴定成骨细胞，MTT法检测成骨细胞的增殖能力，PNPP法测定ALP活性。ELISA法测定不同浓度DHEA培养液中IL-1β的水平。结果不同浓度DHEA组成骨细胞增殖能力和ALP的活性均有上升，其中以10^-7mmoL／LDHEA组最显著（P〈0．01），其作用和E2相似（P〉0．05）；10^-9mmoL／LDHEA组单位细胞数的ALP活性高于空白对照组（P〈0．05）。不同浓度的DHEA组IL-1β呈下降趋势，成骨细胞增殖能力及ALP活性和IL-1β成负相关。结论DHEA在体外促进大鼠成骨细胞生长和增殖，提高ALP活性，其作用可能和抑制IL-1β有关。     

激酶4抑制因子家族基因表达的激活对肠癌细胞增殖侵袭的影响

目的探讨激活激酶4抑制因子（INK4）家族（P15ink4b和P16ink4a／CDKN2）基因表达对结肠癌细胞增殖和迁移能力的影响。方法应用1×10^-7、5×10^-7及1×10^-6mol／L不同浓度的特异性DNA甲基转移酶抑制剂（5-Aza-CdR）对结肠癌RKO细胞进行去甲基化处理（分别为A、B、C3个实验组）,另设阳性对照组（未经处理的RKO细胞）。Western blot法检测INK4家族基因的蛋白表达：软琼脂克隆细胞集落实验评估体外致瘤情况;Transwell小室实验评估体外迁移情况。将各组RKO细胞注射BALB／c裸鼠（每组10只）,通过称量瘤体的重量和体积评估体内成瘤情况。结果A、B、C3组实验组细胞中P15ink4b和P16ink4a／CDKN2蛋白表达分别为阳性对照组的1．13、1．38、1．92倍和1．11、1．45、2．14倍。体外实验显示,B组和C组的细胞集落数明显少于阳性对照组（P〈0．05）;3组实验组的细胞迁移数均明显少于阳性对照组（P〈0．05）。体内实验显示,相对于阳性对照组,3组实验组裸鼠的抑瘤率分别为2．1％、16．8％和26．2％,差异有统计学意义（P〈0．01）。结论激活INK4家族基因的表达能有效抑制结肠癌细胞的增殖和迁移。     

胰岛素和睾酮对Ishikawa细胞HOXAIO基因表达的影响

目的观察胰岛素（INS）和睾酮（T）对子宫内膜腺癌细胞HOXA10基因表达的影响。方法免疫细胞化学检测HOXA10蛋白在Ishikawa细胞定位表达;体外培养Ishikawa细胞,予不同浓度INS（90、60、30、3、0．3U／L）或T（10^-3、10^-4、10^-5、10^-5、10^-7mol／L）刺激Ishikawa细胞48h,MTT法检测INS、T对Ishikawa细胞生长的作用;最后分别以30U／LINS和10^-5mol／LT刺激Ishikawa细胞48h,逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法测定INS和T对Ishikawa细胞HOXA10mRNA表达的影响。结果（1）HOXA10蛋白定位表达于Ishikawa细胞的细胞浆内。（2）不同浓度的INS均可促进Ishikawa细胞的生长,随着浓度的增加作用越强,INS浓度达60、90U／L时,细胞生长状况与浓度为30U／L相似。不同浓度的T均可抑制Ishikawa细胞的生长,随浓度增加抑制作用越明显,浓度达10^-4、10^-3mol／L时,细胞生长抑制状况与浓度为10^-3mol／L相似。（3）RT-PCR检测结果显示INS组和T组Ishikawa细胞中HOXA10mRNA表达均较对照组减弱（P〈0．01或P〈0．05）。结论不同浓度INS和T均可影响Ishikawa细胞生长,高浓度的INS和T降低细胞上HOXA10mRNA的表达。     

辛伐他汀对人牙髓干细胞增殖和分化的影响

目的:研究辛伐他汀对人牙髓干细胞(dental pulpstem cells,DPSCs)增殖和成骨分化的影响。方法:将第3代人DPSCs在矿化培养液中诱导培养,同时加入不同浓度的辛伐他汀(1×10-5mol/L、1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L),噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)法检测细胞增殖情况,碱性磷酸酶试剂盒检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,茜素红染色鉴定成骨分化。结果:各浓度辛伐他汀均抑制人DPSCs增值,辛伐他汀浓度为1×10-5mol/L时,抑制作用最明显。适宜浓度辛伐他汀(1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L)促进人DPSCs向成骨细胞分化,其中,1×10-7mol/L的辛伐他汀促进ALP活性的作用最明显。结论:辛伐他汀抑制人DPSCs的增值,适宜浓度的辛伐他汀可有效促进人DPSCs的成骨分化。     

莫诺苷对黑素瘤细胞与角质形成细胞共培养模型黑素合成的影响

目的:探讨莫诺苷对黑素瘤细胞与角质形成细胞共培养模型黑素合成的影响。方法:将黑素瘤细胞(A375)与角质形成细胞(Hacat)以1:2比例建立共培养模型,以不同浓度莫诺苷进行干预,通过MTT法测定细胞增殖率;NaOH裂解法测定黑素含量;多巴氧化法测定酪氨酸酶活性。结果:与阴性对照组相比,10-4mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L和10-7mol/L莫诺苷均对细胞增殖无影响(P>0.05),10-5mol/L、10-6mol/L和10-7mol/L莫诺苷均对共培养体系酪氨酸酶活性和黑素合成有极显著差异(P<0.01);与阳性对照药熊果苷组相比,10-5mol/L、10-6mol/L和10-7mol/L莫诺苷均对共培养体系酪氨酸酶活性和黑素合成有差异(P<0.05或P<0.01)。结论:莫诺苷可能通过抑制酪氨酸酶活性来抑制共培养模型的黑素合成。     

地塞米松对成牙骨质细胞增殖和矿化功能的调节作用

目的:研究不同浓度地塞米松对成牙骨质细胞增殖、矿化能力的影响。方法:本研究设3个实验组和1个对照组,对体外培养的成牙骨质样细胞OCCM-30分别加入1×10-5mol/L、1×10-6mol/L、1×10-7mol/L的地塞米松作为实验组,对照组不加药。72h后提取细胞总RNA,用实时荧光定量PCR(Q-PCR)方法检测成牙骨质细胞矿化相关基因mRNA表达的变化。CCK-8法检测地塞米松对成牙骨质细胞增殖的影响,采用碱性磷酸酶活性检测、茜素红染色对地塞米松作用后成牙骨质细胞生物学特性作初步观察。结果:地塞米松在高浓度时有抑制成牙骨质细胞增殖的作用。和对照组相比,实验组ALP活性增高,矿化结节形成明显增多,Q-PCR结果显示与细胞矿化相关基因ALP、BSP、OCN、Runx-2 mRNA表达与对照组相比明显增高。结论:地塞米松可以增加成牙骨质细胞矿化功能,并可能由此影响牙根吸收和修复过程。     

外源性褪黑素在人类未成熟卵母细胞体外成熟中的应用研究

目的通过在体外成熟（IVM）培养基中加入褪黑素,探索外源性褪黑素在人类未成熟卵母细胞IVM中的作用,以期优化人类未成熟卵母细胞IVM的培养体系。方法在人类未成熟卵母细胞IVM培养体系中添加不同浓度的褪黑素,以排出第一极体作为判断其核成熟的标准,比较不同浓度下的核成熟率。结果与对照组（褪黑素0mol／L）相比,外源性褪黑素在10^-11mol／L、10^-9mol／L和10^-7mol／L时人类未成熟卵母细胞的核成熟率有提高,但只有褪黑素在10^-9mol／L时人类未成熟卵母细胞的核成熟率呈显著性提高（63．6％VS．40．9％,87．7VS．54．2％,68．2％VS．45．5％,90．4VS．69．4％）（P〈0．05）;当外源性褪黑素浓度增加到10。mol／L和10。mol／L时,人类未成熟卵母细胞的核成熟率显示稍低于对照组,差异无统计学意义（P〉0.05）,但与10^-11mol／L、10^-9mol／L和10^-7mol／L组相比则呈显著性降低（P〈0．05）。结论外源性褪黑素在适当浓度时可以促进人类未成熟卵母细胞的核成熟,而在浓度超出一定范围时,则可能对卵母细胞的核成熟造成负面影响。     

丹参酮ⅡA对肾成纤维细胞增殖及胶原合成的影响

目的研究丹参酮ⅡA（TSN）对结缔组织生长因子（CTGF）诱导肾间质成纤维细胞增殖及胶原合成的作用，探讨TSN抗肾纤维化的可能机制。方法体外培养大鼠肾成纤维细胞株NRK／49F，分别以2．5、5．0、10ng／ml CTGF刺激细胞；或先用不同浓度（10^-6、10^-5、10^-4mol／L）TSN预处理再以5ng／ml CTGF刺激细胞。四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测细胞增殖情况，酶联免疫吸附法（ELISA）测定细胞培养液中Ⅰ、Ⅳ型胶原含量。结果CTGF在一定范围内以剂量依赖方式诱导NRK／49F细胞增殖及胶原合成。不同浓度TSN预处理的作用强度有所不同：10^-6mol／LTSN预处理后，细胞增殖和Ⅰ、Ⅳ型胶原合成几乎不受影响；10^-5和10^-4mol／LTSN预处理后，细胞增殖率分别降低31．82％、40．91％，Ⅰ型胶原含量下降36．10％、54．13％，Ⅳ型胶原含量下降29．73％、49．15％。结论TSN抗肾纤维化作用可能与其抑制CTGF诱导的肾间质成纤维细胞增殖和细胞外基质（ECM）的合成有关。