血管内皮生长因子重组DNA的构建及体外表达

目的:以质粒PCNDA3.0为载体,研究血管内皮生长因子(VEGF)目的基因在体外真核细胞中的表达.方法:将编码人可溶性VEGF165的目的基因克隆于带有CMV启动子/增强子的PCNDA3.0载体上,重组为PCNDA3.0-VEGF165质粒载体.直接以质粒DNA形式应用脂质体介导的方法转染人脐静脉内皮细胞ECV304,收取细胞上清,用ELISA和Western blot方法检测上清中VEGF165可溶性表达产物.结果:VEGF165基因在CMV启动子/增强子的调控下,可在ECV304细胞高效表达,且在转染后72 h表达量明显高于转染后48 h的表达.结论:以质粒PCNDA3.0为载体,VEGF165基因可以在体外真核细胞中表达,为治疗缺血性疾病提供一个新的基因治疗途径.     

FUS1基因原核表达质粒构建与诱导表达

目的 构建FUS1基因原核表达质粒,在大肠杆菌[Rosetta(DE3)2 plys]中高效表达重组蛋白.方法 采用PCR技术从人脐带来源的间充质干细胞中扩增出FUS1基因,并将其接入pET-32a( ),经PCR、测序鉴定后,转化Rosetta(DE3)2 plys细菌,并用IPTG诱导表达.结果 经过PCR、测序鉴定,克隆了pET32a( )-FUS1重组子;在低浓度IPTG(25μmol/L)诱导3 h,Rosetta DE3可以高效地表达重组蛋白,约占细菌总蛋白的40%.结论 成功地克隆到FUS1基因,并使其在原核系统中高效表达.     

pCMV-Myc-PIASxβ重组质粒的构建与蛋白表达

目的:通过基因重组方法构建pCMV-Myc-PIASxβ质粒,在真核细胞中高效表达重组蛋白并进行检测。方法:用SalⅠ和NotⅠ将PIASxβ片段从pGADT7载体中酶切后,利用DNA重组技术将其定向插入pCMV-Myc载体中。获得正确重组质粒后,瞬转CHO细胞系,用Western blotting检测Myc-PIASxβ重组融合蛋白表达。结果:经过酶切,片段回收,连接转化,获得重组质粒。重组pCMV-Myc-PIASxβ克隆通过酶切和测序鉴定其正确性。EcoRⅠ酶切鉴定,pCMV-Myc-PIASxβ为一条大小5 641 bp的条带;XbaⅠ酶切鉴定,pCMV-Myc-PIASXβ为2条大小分别为3 291和2 349 bp 的条带,符合预计大小。Western blotting检测证实,在相对分子质量68 000处（PIASxβ融合蛋白）有特异的蛋白表达条带,与重组质粒相符。结论：成功构建了pCMV-Myc-PIASxβ重组质粒,为深入研究PIAS家族的功能奠定良好的基础。     

Fas基因siRNA表达质粒的构建及鉴定

目的构建肿瘤凋亡基因Fas小干扰RNA(siRNA)表达质粒,研究其对人肺腺癌A549细胞Fas基因表达的阻抑作用,探索Fas/FasL途径在肺癌转移中的作用机制。方法设计有小发夹结构的3条Fas siRNA对应模板DNA序列,退火处理后克隆至pGCsi-U6质粒,构建重组质粒pSi-Fas。将pSi-Fas转染人肺癌A549细胞,采用Western blot检测Fas表达。结果酶切及测序证实质粒pSi-Fas构建成功,可显著抑制A549细胞Fas蛋白表达。结论成功构建的Fas siRNA表达质粒pSi-Fas能抑制人肺癌A549细胞Fas蛋白表达。     

pGEX-4T-1/HSV2-gG重组质粒的构建及表达

目的 通过基因工程技术,构建含有目的 基因的重组质粒(pGEX-4T-1/HSV2-gG).方法 用PCR技术扩增HSV2-gG基因的免疫优势表位片断;将PCR产物与质粒表达载体pGEX-4T-1连接;然后鉴定含有目的 基因的重组表达载体;并转化大肠杆菌DH5α,诱导表达目的 蛋白;以免疫印迹法检测表达的目的 蛋白.结果 PCR法扩增出1 242 bp的DNA片断;通过PCR法及测序法证实重组质粒中含有1 242 bp的DNA片断.SDS-PAGE和免疫印迹法证实重组蛋白在大肠杆菌中的表达.结论 重组质粒HSV2-gG-pGEX-4T-1的成功构建及表达,为制备HSV-2血清诊断试剂奠定了基础.     

AFP基因SiRNA表达质粒的构建及鉴定

目的：构建针对人甲胎蛋白(AFP)基因siRNA表达质粒，为进一步研究AFP基因功能奠定基础。方法：选择RNA干涉靶序列，体外合成两段互补的寡核苷酸，通过与线性化的pSilencer3．0-H1连接、转化大肠杆菌，扩增、纯化得到所需质粒，通过琼脂糖凝胶电泳及基因测序鉴定其分子量及插入片段的序列。结果：纯化的质粒的分子量为2．8Kb，插入的寡核苷酸序列与设计的序列完全相符。结论：成功构建了针对AFP基因的siRNAs表达质粒。     

人TGFβ1cDNA高表达重组质粒的构建

目的为了得到基因工程制备的人重组TGFβ1,构建人TGFβ;cDNA高表达重组质粒。方法从人血小板中提取总RNA,经RT－PCR得到TGFβ;cDNA基因,并克隆到表达质粒pBLMVL2中,构建了在PL启动控制基因表达质粒pBLMVL2－TGFβ;,使其在大肠杆菌中进行温敏诱导表达。结果RT－PCR得到的TGFβcDNA经DNA序列分析与文献报道一致,pBLMVL2－TGFβ1在大肠杆菌中表达产物人重组TGFβ1经还原型SDS－PAGE电泳,呈一条蛋白条带,分子量12．5kd,表达产物约占全菌蛋白20％。结论构建的重组质粒pBLMVL2－TGFβ1能高表达人重组TGFβ1。     

pCD-rbFGF重组质粒的构建及其在成骨细胞中的表达

为了构建碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)真核表达质粒,并探讨应用bFGF基因治疗骨科各种疾患的可能性,将鼠碱性成纤维细胞生长因子cDNA克隆至真核表达载体pcDNA3中,构建了重组质粒pCD-rbFGF.通过Liofectin介导将pCD-rbFGF转染兔成骨细胞,经免疫组化检测证实兔成骨细胞获得了bFGF的瞬时表达.提示该bFGF真核表达质粒有效,可用于进一步基因治疗研究.     

hLMO1编码基因重组质粒的构建及蛋白的表达和定位

目的 构建hLMO1真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位.方法 以人胎脑文库cDNA为模板,PCR扩增hLMO1基因cDNA全长,亚克隆至pEGFP表达载体中.将构建的重组质粒进行酶切测序鉴定,并转染到人上皮细胞---HEK293细胞中,提取细胞蛋白进行Western blot检测.利用激光扫描共聚焦显微镜观察pEGFP-hLMO1在HEK293细胞内的定位.结果 hLMO1基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP中,酶切鉴定片段为471 bp.Western blot检测到了融合蛋白表达,分子量约为45 kDa.pEGFR-LMO1在人HEK293细胞核与细胞质均有表达.结论 成功构建了hLMO1基因cDNA全长的真核表达载体,pEGFP-LMO1蛋白定位于HEK293细胞的细胞质和细胞核内.     

Construction and Expression of Recombinant Plasmid pCD-rbFGF in Osteoblasts

Basicfibroblastgrowth factor(b FGF) exertsbi-ological effects on a wide range of mesoderm- andneuroectoderm- derived cells,acting as morphogensand mitogens.In addition,b FGF plays a crucial rolein wound- healing process.It stimulatesthe prolifera-tion ofalltypes ofcellsinvolved in the wound- healingprocess both in vitro and in vivo.In tissues such ascartilage and bone,b FGF has been reported to pro-mote chondrossification and play a role in the growthof osseous tissue[1] .To explore the po…     

电离辐射诱导pEgr-hPTEN 表达增强其体外抗肿瘤作用

目的：研究辐射诱导表达载体pEgr-hPTEN体外稳定转染联合X射线照射对恶性胶质瘤细胞SHG-44增殖和诱导细胞凋亡的作用。 方法：以脂质体介导携有外源野生型PTEN基因的表达载体pEgr-hPTEN转染人胶质瘤SHG-44细胞,筛选稳定转染细胞克隆并扩增培养,以Western blotting法检测PTEN基因的辐射诱导表达情况,应用流式细胞仪及生长曲线测定稳定转染联合0~10 Gy X射线照射对胶质瘤细胞增殖、凋亡的影响。 结果：SHG-44-hPTEN稳定转染细胞PTEN蛋白的相对表达量可被辐射诱导增强,5 Gy以内呈剂量依赖性增加。稳定转染联合辐射可明显抑制肿瘤细胞的恶性增殖并诱导肿瘤细胞凋亡,照射后第8天稳定转染不同剂量组细胞数仅为稳定转染0 Gy假照组的30.0%~50.0%和未转染0 Gy假照组的7.7%~13.0%;稳定转染不同剂量照射组早期凋亡细胞百分数分别为稳定转染0 Gy假照组的1.5~2.3倍、未转染照射组的1.9~4.4倍及未转染0 Gy假照组的3.4~5.1倍。 结论：体外基因-放射联合作用可诱导肿瘤细胞凋亡明显增多,具有显著的肿瘤抑制作用。     

pGFP-FL质粒的构建及其在FL基因修饰性肿瘤疫苗中的应用

目的　构建一个含有绿色荧光蛋白（GFP）报告基因,并能够用于Ⅲ型酪氨酸激酶受体Flt3的配体（FL）基因修饰性肿瘤疫苗研究的质粒载体。方法　利用常规分子生物学方法设计并构建含有一个FL基因和一个GFP基因的pGFP-FL质粒。在该质粒中,以CMV启动子驱动FL基因,同时以肽链延长因子（EF-1α）启动子驱动GFP基因,并引入原核和真核选择基因KanR/neo。对所获得的pGFP-FL质粒以限制性内切酶酶切鉴定后,再将其导入Hepa1-6细胞内,直接在荧光显微镜下观察GFP基因的表达情况,同时以RT-PCR和PCR产物测序的方法对GFP阳性细胞内FL基因的表达进行检测。结果　质粒的酶切鉴定结果表明所构建的pGFP-FL与预期的结构一致,FL和GFP两者能同时在Hepa1-6细胞内表达。结论　本研究构建了一种新型的FL基因修饰肿瘤疫苗研究载体,位于该载体上的GFP的表达能够反映FL基因的转录表达情况,可以作为FL基因表达的报告基因。     

新基因s-lap编码区的克隆及其重组表达质粒PHB/s-lap的构建

目的：克隆新基因s-lap编码区序列并构建其重组表达质粒。 方法：利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法,以可见光损伤早期的培养的猪视网膜色素上皮（RPE）细胞ds cDNA为模板,扩增新基因s-lap编码区序列;利用基因重组技术构建PHB/s-lap重组表达质粒。 结果：经测序证实获得了正确的新基因s-lap编码区序列,酶切鉴定及DNA序列分析表明已经将s-lap基因编码区序列克隆到PHB表达载体, 成功地构建了PHB/s-lap重组表达质粒。结论：成功地克隆了新基因s-lap编码区序列,并构建了其重组表达质粒PHB/s-lap。     

丙型肝炎病毒核心区与IgG Fc段融合基因疫苗的构建及表达

目的：构建能同时表达丙型肝炎病毒核心区与IgG Fc段的融合基因真核表达载体pcDNA3 HCV C-Fe，为下一步修饰和转染树突状细胞，制备能高效表达HCV C和Fc基因的树突状细胞疫苗做准备。方法：用分别含有Xhol I和Xba I初位点的人免疫球蛋白(IgG)Fc区基因上、下游引物，以含有人IgG基因序列的质粒pCMVsFc为模板，通过PCR扩增获得Fc区基因片段，基因片段回收后，以Xhol I和Xba I双酶切，定向插入到含HCV C基因的质粒PcDNA3 HCV C下游双粘端位点之间，获得重组表达质粒pcDNA3 HCVFc。通过酶切、PCR及插入片段序列测定对质粒进行鉴定。以抗HCV C和抗Fc单克隆抗体为一抗，利用间接免疫荧光法检测pcDNA3 HCV-Fc在人肝癌细胞7721中的瞬时表达。结果：酶切、PCR及测定鉴定证实，pcDNA3 HCV—Fc插入片段为Fc区基因片段，免疫荧光法检测表明其可以在7721细胞中瞬时表达。结论：构建的质粒pcDNA3 HCV—Fc可以在7721细胞中瞬时表达Fc基因，为研究HCV C—Fc融合基因修饰的树突状细胞的功能奠定了基础。     

肾上腺髓质素真核表达质粒的构建及其在大鼠近端肾小管上皮细胞中的表达

目的构建大鼠肾上腺髓质素(ADM)真核表达质粒,观察其在大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52E)中的表达。方法提取大鼠肾上腺组织总RNA,RT-PCR扩增ADM全长cDNA;将扩增产物连接于pMT-18T载体,双酶切及测序鉴定重组质粒。用限制性内切酶BamHⅠ/EcoRⅠ分别对pMT-18T-ADM和真核表达质粒pcDNA3.1双酶切;将目的基因定向克隆到pcDNA3.1载体上;对重组质粒进行双酶切鉴定。将重组质粒通过脂质体介导转染NRK-52E,RT-PCR检测ADM表达。结果特异扩增出ADM片段,大小为585 bp;片段成功插入pcDNA3.1载体中。RT-PCR方法证明NRK-52E中存在ADM高表达。结论成功构建大鼠ADM真核表达质粒,并将其成功转染NRK-52E。     

辐射诱导表达载体pEgr-hTRAIL的构建及其对肿瘤细胞的体外诱导凋亡作用

目的：构建携带人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（hTRAIL）基因的辐射诱导表达载体pEgr-hTRAIL,并研究其在人肺腺癌细胞株A549中的表达及促凋亡作用。 方法：采用常规分子生物学方法构建表达质粒pEgr-hTRAIL,体外通过脂质体转染A549细胞,经G418筛选稳定转染细胞A549-shTRAIL,利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）法检测目的基因的表达,采用Annexin-V-FITC凋亡检测试剂盒检测细胞早期凋亡。 结果：经限制性内切酶酶切鉴定pEgr-hTRAIL表达质粒构建正确;稳定转染细胞A549-shTRAIL的hTRAIL mRNA表达量明显增加;稳定转染细胞A549-shTRAIL的凋亡细胞百分数明显增加,是A549细胞的1.8倍（P<0.05）。 结论：成功构建pEgr-hTRAIL表达质粒,体外稳定转染细胞A549-shTRAIL具有明显诱导凋亡作用。     

含小鼠分泌型内皮抑素基因重组质粒的构建及表达

目的:克隆小鼠分泌型内皮抑素(sEndostatin)cDNA,构建pCMV-分泌型内皮抑素和pEgr-分泌型内皮抑素重组质粒,检测重组质粒在B16细胞中的表达. 方法:用RT-PCR方法从鼠肝脏中扩增出内皮抑素cDNA,经测序证实后,连入信号肽,构建pCMV-分泌型内皮抑素和pEgr-分泌型内皮抑素重组质粒,以脂质体转染小鼠B16细胞,用Western blot方法检测B16细胞上清中内皮抑素的表达.结果:测序表明扩增的分泌型内皮抑素序列与报道完全一致, Egr-1启动子和分泌型内皮抑素cDNA正确插入表达载体pcDNA3.1,Western blot证实转染B16细胞上清中有目的蛋白表达.结论:小鼠内皮抑素基因成功地被克隆和表达,为今后检测pEgr-分泌型内皮抑素的辐射诱导表达和恶性肿瘤的基因-放射治疗奠定基础.     

NNMT基因重组表达质粒的构建以及在大肠杆菌中的表达

目的利用p GEX—4T-2表达系统表达制备尼克酰胺N-甲基转移酶（NNMT）抗原。方法根据NCBI核苷酸数据库编码为gi：12652950人NNMT cDNA序列，设计合成编码NNMT的DNA引物，并分别在5’端和3’端设计BamHI和XhoI位点，利用RT-PCR从人肝组织中克隆NNMT基因，经T—A克隆、亚克隆至p GEx-4T-2表达载体，重组质粒转化到大肠杆菌BL-21-STAR（DE3），经异丙基-β—D-硫代乳糖苷诱导表达，Glutathione Sepharose 4B亲和层析制备融合蛋白（GST-NNMT）。通过DNA测序来证实质粒p GEX-4T-2／NNMT的正确性，SDS—PAGE电泳以及Western—blot判断GST-NNMT蛋白的准确性。结果限制性内切酶和DNA测序结果表明，编码NNMT蛋白的DNA序列准确插入到 p GEX-4T-2多克隆位点，成功构建表达质粒p GEX-4T-2，NNMT。菌液超声破碎后，融合蛋白主要存在于裂解上清液中，表达量约占菌体总蛋白表达量的20％，每升菌液可表达融合蛋白约4．5mg。Western-blot证实制备的蛋白为GST-NNMT。结论成功地利用基因重组技术制备了NNMT，为制备抗NNMT单克隆抗体和ELISA试剂盒打下基础。     

结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT-6基因测序质粒及真核表达重组质粒的构建

目的 构建结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT—6基因测序质粒及真核表达重组质粒，为结核病的诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测打下基础。方法 以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板，用PCR法对基因ESAT—6进行扩增，将扩增的产物连接于测序载体pUCm—T上，经测序反应确定无误，再将PCR反应产物经酶切后，克隆于真核表达载体pcDNA3．1( )上。结果 构建了结核杆菌基因ESAT—6的重组测序质粒，并对其进行了测序。真核表达重组质粒pcDNA3．1( )—ESAT—6亦构建成功。结论 结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT—6真核表达重组质粒的成功构建为结核病的诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测以及相应抗原、抗体的制备打下基础。