张应力刺激下人牙周膜成纤维细胞纤连蛋白、整合素、细胞骨架的变化

目的:研究不同动态张应力刺激下体外培养的人牙周膜成纤维细胞纤连蛋白、整合素β1和细胞骨架的变化.方法:刮取牙根中1/3牙周膜组织,采用Ⅰ型胶原酶消化结合组织块贴附法进行人牙周膜成纤维细胞(hPDLF)原代培养并传代.用四点弯曲加载装置,通过对体外培养的hPDLF分别施加不同动态的张应力,采用实时荧光定量PCR法研究机械力对人牙周膜成纤维细胞纤连蛋白和整合素β1亚单位mRNA表达的影响.经荧光倒置显微镜观察施加不同动态张应力后细胞形态的变化.采用SPSS 13.0软件包对荧光定量PCR所得数据取常用对数后行ANOVA分析.结果:张应力的大小及加力时间都对hPDLF纤连蛋白mRNA表达产生影响.加力后,hPDLF整合索β1亚单位mRNA表达下调,这种下调变化与所施加应力大小和作用持续时间相关.机械力刺激越强,整合素β1表达越明显.加力后,细胞骨架形态发生变化.加力前呈梭形,排列呈漩涡状,F-actin纤维粗且分布均匀;加力后,形态不规则,沿力的方向排列整齐,F-actin纤维细且分布不均匀;加力12h后,形态恢复到加力前形态,细胞F-actin荧光染色强度也由正常到下降再到正常.结论:动态张应力刺激在本实验提供的微应力范围内可以促进纤连蛋白、整合素βmRNA表达改变,hPDLF细胞骨架的形态结构也发生一定规律的变化.     

机械应力对人牙周膜成纤维细胞整合素β1mRNA表达的调节

目的观察机械力刺激对人牙周膜成纤维细胞整合素β1 mRNA表达的影响。方法用Forcel四点弯曲加载装置通过对体外培养的人牙周膜成纤维细胞分别施加不同动态张、压应力（强度为1 000、2 000、4 000 μstrain，加力时间为0、0.5、1、4、8、12 h），采用实时荧光定量PCR法研究机械力对人牙周膜成纤维细胞整合素β1 mRNA表达的影响。结果施加动态的张、压应力后，人牙周膜成纤维细胞整合素β1 mRNA表达量下调，这种下调变化与所施加应力的性质、大小和作用持续时间相关。人牙周膜成纤维细胞整合素β1对张、压应力刺激的感应不完全一致，机械力刺激越强，整合素β1表达越明显。结论动态张、压应力刺激在本实验提供的微应力范围内可以促进目的基因mRNA表达改变，不同的机械力对细胞整合素β1效应不同。     

大鼠骨髓间充质干细胞和颅骨成骨细胞在张应力下细胞骨架的改变

目的　探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)和颅骨成骨细胞(OB)在机械张应力刺激下的反应和细胞骨架蛋白F-actin的变化。方法　体外分离培养大鼠骨髓MSCs和颅骨OB,应用四点弯曲加力系统对细胞施加2 000με 的机械张应力,加力时间分别为0 h、2 h、6 h、12 h。采用激光共聚焦显微镜观察特异性荧光染料标记的微丝蛋白 F-actin和细胞核,并用图像分析软件对细胞形态学参数进行测量。结果　MSCs和OB荧光强度减弱,F-actin纤维束稀疏,排列紊乱;胞核轮廓模糊,部分细胞可观察到凋亡小体;MSCs体积明显变小,OB体积变化不明显。定量分析表明, MSCs的细胞总面积、总荧光密度、绿色荧光(F-actin)密度均显著降低(P<0·05或P<0·01);OB的总荧光密度、绿色荧光密度和胞核红色荧光密度也显著下降(P<0·05或P<0·01)。结论　机械张应力刺激可引起MSCs和 OB细胞骨架F-actin解聚和重排,部分细胞发生凋亡;MSCs对机械力刺激的反应比OB更敏感。     

周期性张应力作用下成骨样细胞MG-63中c-fos基因和丝状肌动蛋白相互关系的研究

目的探讨成骨样细胞MG-63中c-fos基因和细胞骨架丝状肌动蛋白（F-actin）的相互关系。方法对MG-63细胞施加周期性张应力,频率为0.5 Hz,细胞应变为2 000 μstrain,按3、6、12 h不同时间段进行加载,采用荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测c-fos mRNA的变化,筛选最佳加载时间点,并作为实验组和0 h组进行对比,检测在细胞松弛素D作用下c-fos mRNA和F-actin的表达变化。结果周期性张应力可以诱导c-fos mRNA的表达增加,至3 h达到峰值;在周期性张应力作用下,MG-63细胞中F-actin的结构、排列发生改变,但荧光强度无明显变化;经细胞松弛素D处理后,张应力作用下的MG-63细胞的应力纤维明显减少,F-actin荧光强度降低,c-fos mRNA表达受抑制。结论周期性张应力作用下,F-actin的量并没有明显变化,只是出现了结构上的重组,且重组的是既有的F-actin。F-actin重组是应力诱导c-fos基因高表达的一个重要环节。     

成骨细胞在机械力刺激下细胞骨架及细胞形态改变的体外研究

目的:探讨大鼠颅骨成骨细胞(OB)对机械力刺激的反应及细胞骨架F-actin的变化。方法:体外分离培养大鼠颅骨OB细胞;应用四点弯曲加力系统,对第3代细胞施加2000με的机械牵张力,加力时间分别为0h、2h、6h、12h,应用特异性荧光染料分别标记微丝蛋白F-actin和细胞核;在激光共聚焦显微镜下观察并进行形态计量学测量。应用TUNEL法进行原位凋亡检测。结果:在机械张力刺激下,OB荧光强度减弱,F-actin纤维束变得稀疏而排列紊乱;胞核轮廓模糊,并可观察到凋亡小体。定量分析表明,OB的荧光总强度、绿色荧光强度(F-actin)和红色荧光强度(胞核)均显著下降(9<0.05或P<0.01)。TUNEL检测也表明,随着加力时间延长,凋亡细胞数明显增加,但明显少于F-actin发生改变的细胞数。结论:机械牵张刺激可引起OB细胞骨架F-actin解聚和重排,并诱发部分细胞发生凋亡。     

Rho信号通路在周期性张应力诱导人牙周膜细胞骨架重排中的作用

目的探讨周期性张应力对人牙周膜细胞（human periodontal ligament cells,hPDLCs）骨架重排的影响及Rho信号通路在其中的作用。方法应用FX-5000T细胞应变加载系统,对体外培养的hPDLCs施加周期性张应力,幅度为10%,频率为0.1 Hz,加载时间为6 h和24 h。以未加载的细胞作为对照组。应用倒置显微镜观察细胞形态变化,细胞免疫荧光染色和共聚焦显微镜观察细胞骨架蛋白F-actin的变化,并应用Western blot检测Rho通路相关蛋白的表达变化。用Rock的特异性抑制剂Y-27632预处理细胞后,在0.1 Hz,10%幅度条件下,加载6 h和24 h,检测细胞骨架蛋白F-actin的变化和Rho信号通路相关蛋白的表达变化。结果与静态组相比,周期性张应力诱导hPDLCs细胞骨架重排差异有统计学意义,Rho信号通路Rock和p-cofilin蛋白表达增加（P〈0.05）。Rock的特异性抑制剂Y-27632可以降低Rock（P〈0.05）和p-cofilin蛋白表达和细胞骨架重排。结论周期性张应力可促进体外培养的hPDLCs细胞骨架重排,Rho信号通路参与了此过程。     

兔脂肪源干细胞与牙周膜成纤维细胞共培养的实验研究

目的:研究脂肪源干细胞能否与牙周膜成纤维细胞直接共培养,在共培养状态下,脂肪源干细胞能否促进牙周膜成纤维细胞胶原特异基因的表达。方法:分别从新西兰白兔皮下脂肪和牙周膜组织中分离出脂肪源干细胞和牙周膜成纤维细胞,体外常规培养;将两种细胞等量混合共培养,利用光镜和F-actin染色标记细胞骨架的方法观察共培养细胞的形态变化,并与单纯培养的细胞比较;利用DAPI染色标示细胞核细胞计数法检测共培养细胞的增殖情况;利用定量PCR法检测特异基因I型胶原在单纯培养和共培养细胞中的表达。结果:脂肪源干细胞和牙周膜成纤维细胞能直接共培养;共培养细胞形态近似牙周膜成纤维细胞;共培养对细胞增殖无明显影响;脂肪源干细胞可提高牙周膜成纤维细胞I型胶原基因的表达。结论:脂肪源干细胞可与牙周膜成纤维细胞共培养,并促进牙周膜成纤维细胞的胶原分泌。     

应力对人牙周膜成纤维细胞Ⅰ型胶原和纤连蛋白mRNA表达的影响

目的 探讨机械应力下人牙周膜成纤维细胞(human periodontal ligament fibroblasts,hPDLF)Ⅰ型胶原和纤连蛋白mRNA表达的变化,为阐明力信号的细胞内转导机制提供依据. 方法 对体外培养的hPDLF分别施加不同动态张、压应力(强度为1000、2000、4000 μstrain,加力时间为0、0.5、1、4、8、12 h),定量聚合酶链反应(PCR)检测Ⅰ型胶原和纤连蛋白mRNA表达. 结果 随时间延长1000 μstrain张应力和压应力均使Ⅰ型胶原和纤连蛋白mRNA表达增强,2000 μstrain和4000 μstrain张应力均使Ⅰ型胶原mRNA表达先增强1 h后减弱,而2000 μstrain和4000μstrain压应力均使Ⅰ型胶原mRNA表达持续减弱,2000 μstrain张应力和压应力均使纤连蛋白mRNA表达持续增强,而4000 μstrain张应力和压应力均使纤连蛋白mRNA表达先增强4 h后减弱. 结论 本项实验提供的应力范围内动态张应力和压应力刺激可改变hPDLF Ⅰ型胶原和纤连蛋白mRNA的表达.     

静态张应力作用下人牙周膜成纤维细胞β-catenin和Wnt3a蛋白的表达

目的:研究人牙周膜成纤维细胞在不同大小机械张应力作用下Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin和Wnt3a蛋白的表达变化。方法:运用酶解组织块法体外培养人牙周膜成纤维细胞,将细胞按加力时间的不同(2 h、4 h、6 h)分为3组,每组再按形变率不同将其分为8%、12%和16%3个亚组,并取加力时间0h、形变率0%作为对照组。用western blot技术检测细胞在不同时间点和不同形变率作用下Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin和Wnt3a蛋白的表达变化。结果:Western blot结果显示,人牙周膜成纤维细胞在机械力加载后β-catenin 和Wnt3a蛋白表达显著减少(P<0.05)。在加力时间相同的组内(2 h、4 h、6 h),β-catenin 和Wnt3a蛋白表达随着形变率的增大而逐渐减少(P<0.05)。结论:β-catenin和 Wnt3a参与了静态张应力作用下牙周膜成纤维细胞的代谢,机械力对牙周膜成纤维细胞中Wnt/β-catenin信号通路有抑制作用。     

机械应力刺激对成牙骨质细胞骨桥蛋白表达影响的研究

目的研究机械应力刺激对成牙骨质细胞矿化相关基因骨桥蛋白（osteopontin,OPN）mRNA表达的影响。方法本研究设3个实验组和1个对照组,利用四点弯曲细胞力学加载装置,对体外培养的成牙骨质样细胞OCCM-30施加2 000μstrain张应力2、000μstrain压应力和4 000μstrain压应力,对照组不加力。分析加力3 h、6 h、12 h、24 h时成牙骨质样细胞OCCM-30 OPN mRNA表达差异,对数据进行统计学分析。结果和对照组相比,2 000μstrain压应力组和4 000μstrain压应力组在加力初期（3 h）OPN的mRNA表达增加,加力后期（24 h）其mRNA表达受到抑制,差异有统计学意义（P〈0.05）;2 000μstrain张应力组在加力3 h、6 h和对照组相比,OPN mRNA的表达差异无统计学意义（P〉0.05）,加力12 h、24 h OPN mRNA的表达受到抑制,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论机械应力刺激可以调节成牙骨质细胞OPN mRNA的表达,可能由此影响牙根吸收和修复过程。