HBx activates FasL and mediates HepG2 cell apoptosis through MLK3-MKK7-JNKs signal module

AIM: To investigate the possible mechanism by which hepatitis B virus X protein (HBx) mediates apoptosis of HepG2 cells.METHODS: HBx expression vector pcDNA3.1-X was transfected into HepG2 cells to establish an HBx high-expression cellular model as pcDNA3.1-X transfected group. The pcDNA3.1-X and pSilencer3.1-shHBX (HBx antagonist) were cotransfected into HepG2 cells to establish an HBx low-expression model as RNAi group. Untransfected HepG2 cells and HepG2 cells transfected with negative control plasmid were used as controls. Apoptosis rate, the expression of Fas/FasL signaling pathway-related proteins and the phosphorylation levels of MLK3, MKK7 and JNKs, which are upstream molecules of death receptor pathways and belong to the family of mitogen-activated protein kinases (MAPKs), were measured in each group.RESULTS: Compared with HepG2 cell group and RNAi group, apoptosis rate, the expression of Fas and FasL proteins, and the activation of MLK3, MKK7 and JNKs were increased in the pcDNA3.1-X transfected group. The activation of JNKs and expression of FasL protein were inhibited in the pcDNA3.1-X transfected group when treated with a known JNK inhibitor, SP600125. When authors treated pcDNA3.1-X transfected group with K252a, a known MLK3 inhibitor, the activation of MLK3, MKK7 and JNKs as well as expression of FasL protein was inhibited. Furthermore, cell apoptosis rate was also significantly declined in the presence of K252a in the pcDNA3.1-X transfected group.CONCLUSION: HBx can induce HepG2 cell apoptosis via a novel active MLK3-MKK7-JNKs signaling module to upregulate FasL protein expression.     

Transfection and expression of hepatitis B virus x gene and its effect on apoptosis in HL-7702 cells

AIM: To investigate the effects of hepatitis B virus x gene and its protein product HBxAg on apoptosis in hepatocyte line HL-7702. METHODS: The reconstituted plasmid pcDNA3-x was established through recombination DNA technique; pcDNA3-X was transfected into HL-7702 cells by lipid-mediated trasfection. Positive clones were screened by G418, and HL-7702/HBx cells were analysed by the RT-PCR to confirm the steady expression of X gene in HL-7702 cells. The apoptosis rate in HL-7702 cells was determined by flow cytometry, TUNEL technology, electronic microscope. At the mean time, pcDNA3-X was transfected transiently into HL-7702 cells, and total RNA from HL-7702 cells was extracted 24, 48, 72, 96 and 120 h after the transient transfection, and semi-quantitative analysis was performed by RT-PCR to detect the expression of HBV X gene. Furthermore, apoptosis rate in HL-7702 cells was determined by flow cytometry analysis at the different times. RESULTS: RT-PCR analysis showed that HBV X gene could be expressed stably in HL-7702 cells. Both flow cytometry and TUNEL technology revealed that the apoptosis rates of HL-7702/HBx cells were much higher than those of HL-7702/pcDNA3 and HL-7702 cells. Furthermore, the apoptotic phenomena and apoptotic body were observed in HL-7702/HBx cells under electronic microscope, but not in HL-7702/pcDNA3 and HL-7702 cells. In the experiment of transient transfection, RT-PCR reveals that X gene was expressed most at 72 h after transfection; and the apoptosis rate reached the highest at the same time. After that, the apoptosis rate was reduced with the decrease of the X gene expression. CONCLUSION: HBV X gene and X protein can promote the apoptosis in hepatocyte. And there exist a quantity-effect relationship between the X gene expression and apoptosis rate in hepatocyte.     

Possible mechanism for hepatitis B virus X gene to induce apoptosis of hepatocytes

AIM: To investigate the possible mechanism for HBV X gene to induce apoptosis of hepatocyte HL-7702 cells. METHODS: HBV X gene eukaryon expression vector pcDNA3-X was established and transfected into HL-7702 cells by Iipid-mediated transfection, including transient and stable transfection. Positive clones were screened by incubating in the selective medium with 600 μg/mL G418 and named HL-7702/HBV-encoded X protein (HBx) cells. The expressions of Fas/FasL, Bax/Bcl-2, and c-myc mRNA were measured by semi-quantitative RT-PCR in HL-7702/HBx and control group, respectively. RESULTS: RT-PCR analysis confirmed that HBV X gene was transfected into HL-7702 cells successfully. By semi-quantitative RT-PCR analysis, Bax and c-myc mRNA levels in HL-7702/HBx cells of transient transfection were significantly higher than those in control, FasL and c-myc mRNA levels in HL-7702/HBx cells of stable transfection were significantly higher than those in control, whereas the Bcl-2 mRNA levels in HL-7702/HBx cells of transient and stable transfection were significantly lower than those in control. CONCLUSION: HBV X gene may promote the apoptosis of hepatocytes by regulating the expressions of Fas/FasL, Bax/Bcl-2, and c-myc gene in a dose-dependent manner.     

乙型肝炎病毒HBx蛋白抑制阿霉素诱导的HepG2细胞凋亡

目的探讨乙型肝炎病毒HBx蛋白对阿霉素诱导的肝癌细胞凋亡的影响。方法将adr亚型HBx基因片段定向插入绿色荧光蛋白（GFP）真核表达载体pEGFPCl，构建重组体pGFP—HBx。将pEGFPCl、pGFPHBx转染HepG2细胞，采用G418筛选抗性克隆、荧光显微镜观察及RT—PCR检测HBx基因表达情况以建立稳定表达细胞株HepG2／GFP、HepG2／GFPHBx。用阿霉素（2．5μg／m1）分别处理HepG2、HepG2／GFP、HepG2／GFPHBx细胞，处理后不同时间在显微镜下观察细胞形态变化，并用锥虫蓝染色计数死亡细胞；流式细胞仪检测阿霉素处理36h后细胞凋亡率。结果HepG2／GFP、HepG2／GFPHBx细胞传70代后，仍表达强的GFP；RTPCR检测显示在HepG2／GFP—HBx细胞有HBx基因转录表达。锥虫蓝染色检测表明阿霉素处理的HepG2、HepG2／GFP细胞发生了明显的时间依赖性细胞死亡，而在HepG2／GFPHBx和对照组细胞未见明显细胞死亡；流式细胞仪检测显示阿霉素处理36h后，HepG2／GFP—HBx细胞凋亡率为3．94％，明显低于HepG2（59．03％）、HepG2／GFP细胞（61．38％）（P〈0．01），而与未处理对照组细胞凋亡率（2．12％，2．78％，2．55％）差异无统计学意义（P〉0．05）。结论成功建立了稳定表达GFP、GFPHBx的HepG2细胞株；HBx能够抑制阿霉素诱导的HepG2细胞凋亡。     

乙型肝炎病毒X基因对肝细胞系细胞凋亡及端粒酶活性的影响

目的探讨乙型肝炎病毒x基因对肝细胞恶性变的作用机制.方法将带C基因、S基因的载体电转染导入HepG2细胞,筛选表达细胞克隆,复苏带X基因的HepG2细胞.PCR-ELISA检测各株细胞的端粒酶活性.用反义寡核苷酸诱导细胞凋亡,流式细胞仪观测转染了x基因、C基因、S基因细胞的凋亡情况.结果表达细胞克隆经同步化处理,39.50%转染X基因的细胞进入细胞S周期,其端粒酶活性指数395±0.07明显高于其它各组细胞.反义寡核苷酸诱导后,转染X基因细胞凋亡峰明显减小,凋亡率仅1.75%;其细胞活性与反义寡核苷酸浓度成反比.结论乙型肝炎病毒X基因上调肝源细胞端粒酶活性,抑制细胞凋亡,这可能是诱导肝细胞恶性变的又一机制.     

乙型肝炎病毒X蛋白对HepG2细胞中细胞色素P450同工酶3A4诱导的影响

目的 观察乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)对1α,25-(OH)2D3诱导的HepG2细胞色素P450(CYP)3A4的影响.方法 将重组HBx真核表达质粒pcDNA3-X与pEGFP-N1质粒(转染对照)瞬时共转染HepG2细胞,分为空白细胞对照组(对照组)、转染pEGFP-N1组、转染pEGFP-N1+1α,25-(OH)2D3组、共转染pEGFP-N1+pcDNA3-X+1α,25-(OH)2D3组.同时以0.35 μmol/L1α,25-(OH)2D3诱导HepG2细胞CYP3A4表达72 h,分别以RT-PCR法和Western印迹法,在mRNA水平和蛋白水平检测CYP3A4的表达.组间比较行F检验.结果共转染pEGFP-N1+pcDNA3-X+1α>,25-(OH)2D3组CYP3A4 mRNA表达量是空白对照组的1.52倍,而转染pEGFP-N1+1α,25-(OH)2D3组为3.97倍(F=4.72,P<0.05);共转染pEGFP-N1+pcDNA3-X+1α,,25-(OH)2D3组CYP3A4蛋白诱导倍数是2.1,而转染pEGFP-N1+1α,25-(OH)2D3组是5.9(F=4.68,P<0.05).结论 HBx干扰1α,25-(OH)2D3对HepG2细胞CYP3A4的诱导,提示HBx对CYP3A4的表达调控有抑制作用.     

乙型肝炎病毒X基因下调miR-192对人肝癌细胞株HepG2凋亡的影响

目的 探讨乙型肝炎病毒X基因(HBx)通过调节人肝癌细胞株HepG2中miR-192的表达而抑制其凋亡的机制.方法 设立3个细胞组:稳定转染HBx基因的HepG2细胞(HepG2/HBx),稳定转染空载体pcDNA3.1的HepG2细胞(HepG2/pcDNA3.1)以及未作转染的HepG2细胞.用流式细胞术分析3个细胞组的凋亡率差异,用Taqman探针荧光定量PCR检测3组细胞中miR-192的表达水平.转染miR-192后,用流式细胞术检测HepG2细胞凋亡率的变化,同时用SYBR Green荧光定量PCR和Western blot检测细胞中p53、PUMA表达的变化.计量资料均数的比较用单因素方差分析.结果 HepG2/HBx细胞的凋亡率为2.37％±0.35％,较HepG2/pcDNA3.1、HepG2细胞(11.46％±0.69％、12.50％±0.66％)明显降低(F=171.722,P＜0.01).miR-192表达在HepG2/HBx细胞中为49.1％±5.9％,较HepG2/pcDNA3.1、HepG2细胞(98.0％±8.9％,100％)也明显下调(F=14.319,P＜ 0.05).转染miR-192后HepG2细胞的凋亡率(15.74％±1.17％)较转染相应阴性对照的HepG2细胞的凋亡率(10.74％±1.15％)显著升高(F=18.415,P＜0.05),同时,p53、PUMA基因在mRNA (953:1.68±0.12比0.90±0.09,F=43.115,P＜0.05 ; PUMA:1.66±0.10比0.98±0.06,F=22.541,P＜0.05)和蛋白质水平(p53:3.07比1,PUMA:2.13比1)的表达均显著上升.结论 miR-192促进HepG2细胞凋亡,HBx通过下调miR-192抑制HepG2细胞凋亡.     

乙型肝炎病毒X基因转染人肝癌细胞株双向凝胶电泳图谱分析

目的 研究转染HBV X基因的人肝癌细胞株中蛋白质表达谱的改变,为筛查在HBV相关性肝细胞癌发生中发挥重要作用的关键蛋白质分子奠定基础.方法 利用分子生物学方法建立稳定表达HBV X蛋白(HBx)的肝癌细胞株HepG2+HBx,同时设空载体peDNA3转染细胞HepG2-pcDNA3及HBV全基因转染的人肝癌细胞株HepG2.2.15为对照.PCR法扩增Neo基因检测质粒DNA片段的插入,免疫印迹法检测HBx蛋白的表达.利用固相pH梯度双向凝胶电泳分离3种肝癌细胞株HepG2-pcDNA3、HepG2-HBx和HepG2.2.15的总蛋白,用图像分析软件比较、分析、识别细胞间的差异表达蛋白质.统计学分析采用t检验.结果 获得分辨率高、重复性好的3种细胞的双向电泳(2-DE)图谱.软件分析表明,HepG2-pcDNA3、HepG2-HBx和HepG2.2.15细胞的2-DE凝胶可识别蛋白点分别为(2 095±137)、(2 188±105)和(2 109±20)个.比较HepG2-pcDNA3与HepG2-HBx细胞的2-DE图谱发现37个差异显著的蛋白点,其中21个在HepG2-HBx表达上调,16个下调.6个表达量差异在5倍以上(t=0.027,P＜0.05);HepG2.2.15与HepG2-HBx细胞相比,有38个差异显著的蛋白点,其中35个在HepG2-HBx细胞中上调,3个下调,14个表达量差异在5倍以上(t=0.031,P＜0.05).结论 HBx基因转染引起人肝癌细胞株蛋白质表达谱的变化,可能与感染的肝细胞发生恶性转化的分子生物学机制有关.     

乙型肝炎病毒X基因对痉挛性截瘫蛋白21表达的影响

目的 探讨HBV X基因对痉挛性截瘫蛋白(SPG)21表达的影响.方法 采用RT-PCR和Western blot检测HepG2和HepG2.2.15细胞mRNA和蛋白表达的差异,将带有SPG21基因启动子的报告质粒pGL3-SPG21分别与表达HBV基因组的单个基因的质粒共转染HepG2细胞,测定荧光色素酶的活性,以相对光单元(RUL)表达;RT-PCR和Western blot分别检测SPG21 mRNA和蛋白表达的变化.组间比较采用t检验.结果 HepG2.2.15细胞中SPG21 mRNA和蛋白的表达水平明显高于HepG2细胞,相对表达量(与β-肌动蛋白的灰度比值)为0.36±0.06对比0.21±0.05,P＜0.05.转染pCMV-S、pCMV-E、pCMV-C、pCMV-X、pCMV-P和pCMV-ag2B后的HepG2细胞中,荧光素酶的活性分别为每微克蛋白(86±12)RUL、(75±12)RUL、(69±11)RUL、(875±27)RUL、(104±16)RUL和(67±12)RUL;与转染pCMV-tag2B组细胞相比,转染X基因者荧光素酶活性明显升高(P＜0.01).HBV X基因在mRNA和蛋白水平上调SPG21的表达,这种激活作用随着X基因浓度的增加而增强.结论 HBV X基因能特异性地激活SPG21的表达.     

慢病毒介导HBV X基因稳定表达HepG2细胞系的建立

目的:构建乙型肝炎病毒X基因(HBV X)重组慢病毒表达载体,建立稳定表达HBVX蛋白(HBx)的HepG2细胞系.方法:应用PCR法从质粒pIERES2-EGFP-HBV中扩增X基因片段,克隆至慢病毒载体pZac2.1,应用PCR、酶切和测序鉴定正确后,经病毒包装,感染HepG2细胞,经嘌呤霉素筛选稳定表达细胞株,RT-PCR、免疫组织化学、Western blot鉴定HBx的表达.结果:酶切鉴定和基因序列测定证实长度为489bp的HBx基因成功克隆至慢病毒表达载体pZac2.1-HBx;重组慢病毒经包装、纯化后获得滴度为1×108TU/mL,通过感染HepG2细胞株和嘌呤霉素筛选,8-10d形成生长形态良好的单克隆细胞株HepG2-HBx;RT-PCR鉴定显示细胞株HepG2-HBx在3d,14d,30d和2mo后均可见稳定表达的HBx mRNA;利用免疫组织化学和蛋白免疫印迹法鉴定,细胞株HepG2-HBx可稳定表达HBx蛋白.结论:成功构建了HBV X重组慢病毒载体,获得稳定表达HBx的HepG2细胞系,为进一步研究HBx的生物学功能及致病机制提供细胞模型.     

应用shRNA研究乙型肝炎病毒X基因表达和三氧化二砷对HepG2细胞p53表达和活性的影响

目的应用短发夹状RNA介导的RNA干扰研究乙型肝炎病毒X基因（HBX）和三氧化二砷（As2O3）对HepG2细胞p53表达和活性的影响。方法以2μmol／L As2O3处理HepG2细胞和表达HBX的HepG2-X，以未处理细胞为对照，提取细胞裂解物或胞核裂解物，采用改进的酶联免疫吸附法检测p53总量和相对活性吸光度。应用脂质体介导具有HBX序列特异性短发夹状RNA表达载体Xi-S1、Xi-S2和序列无关对照Xi-S3转染HepG2-X，再次观察As2O3处理对D53表达和活性的影响。结果As2O3作用使HepG2和HepG2-X细胞p53蛋白水平上调和p53相对活性比增强。表达HBX后As2O3诱导的p53蛋白水平有所上调，但显著抑制p53相对活性。短发夹状RNA抑制HBX的表达后其对p53的活性抑制得以解除。结论As2O3使HepG2细胞p53表达上调和活性增强。应用短发夹状RNA介导的RNA干扰有利于研究HBX的表达对p53表达和活性的影响。HBX表达上调As2O3诱导的p53蛋白水平，但显著抑制p53的结合与转录调节活性。     

乙型肝炎病毒X蛋白对HepG2细胞脂代谢相关基因表达的影响

目的 探讨乙型肝炎病毒X蛋白(HBX)对脂质代谢相关基因的影响及其在肝细胞脂肪变性发生中的作用. 方法 将质粒pIRES2-eGFP-HBX转染入HepG2细胞中,建立表达HBX的HepG2/HBx细胞模型;以转染空载体pIRES2-eGFP (HepG2/pIRES2细胞)及未转染的HepG2细胞作为对照.转染后24、48、72 h,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达;检测细胞内甘油三酯含量;RT-PCR方法检测固醇调节元件结合蛋白1(SREBP-1)和肝X受体(LXR)αmRNA表达水平;Western blot检测HBX,LXRα及脂肪酸合成酶(FAS)蛋白表达的变化.多组间比较采用成组设计的方差分析,多组间的两两比较采用q检验;各基因表达量之间的关系采用Pearson相关分析.结果 在转染后24、48、72 h,HepG2/HBx细胞和HepG2/pIRES2细胞中有GFP的表达并随时间延长而增多、增强,仅在HepG2/HBx细胞内有HBx表达,并且随时间的延长而逐渐增加,差异有统计学意义(F= 32.21,P＜0.05),提示成功建立HepG2/HBx细胞模型;在转染后24、48、72h,HepG2/HBx细胞内LXRαmRNA相对表达量分别为0.386±0.055、0.505±0.071、0.649±0.058,SREBP-1 mRNA相对表达量分别为0.395±0.055、0.548±0.047、0.795±0.058; LXRα蛋白的相对表达量分别为0.178±0.036、0.263±0.047、0.347±0.058,FAS蛋白相对表达量分别为0.436±0.055、0.608±0.053、0.827±0.046,各相同时间点均较对照组明显增加(P＜0.05或P＜ 0.01),并均随时间的延长而逐渐增多(P＜ 0.05或P＜0.01),且与HBX表达量均呈正相关(rLXPα= 0.994,rSREBP-1= 0.984,r' LXRα=0.989,rFAS=0.991,P＜0.05).HepG2/HBX细胞内TG含量与对照组相比,差异无统计学意义(P＞ 0.05).结论 HBx-LXR α -SREBP- 1/FAS通路可能参与了调节脂质代谢相关基因的转录和表达,可能是引起肝细胞脂肪变发生的重要分子机制之一.     

乙型肝炎病毒X蛋白对肝细胞癌生长因子激活作用的研究

目的研究乙型肝炎病毒Ｘ（hepatitisBvirus,HBx）蛋白对生长因子激活作用,探讨HBx蛋白对肝细胞癌生长的影响。方法构建Ｘ基因真核表达载体,转染入HepG2细胞后,细胞组织化学和免疫印迹法检测胰岛素样生长因子－Ⅰ受体（insulin-likegrowthfactorⅠreceptor,IGF-ⅠR）和血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）表达。结果转染HBx基因HepG2细胞（X细胞）IGF-ⅠR表达阳性率为84%±3%,转染空载体对照细胞（X0细胞）为26%±4%;免疫印迹法检测Ｘ细胞有明显条带。VEGF表达Ｘ细胞阳性率为83%±5%,X0细胞为28%±6%,差异有非常显著意义;Ｘ细胞IGF-ⅠR表达增高近1.5倍。结论HBx蛋白可同时激活IGF-ⅠR和VEGF,在肿瘤恶性生长、转移中起有重要作用。     

乙型肝炎病毒X蛋白和环氧合酶-2与乙型肝炎相关肝癌微血管生成和转移的关系及其可能机制

目的 探讨乙型肝炎病毒X蛋白(HBX)、环氧合酶-2(COX-2)在乙型肝炎相关性肝细胞肝癌(HCC)组织微血管生成和转移中的关系及其可能的调节机制. 方法选择84例乙型肝炎相关性肝细胞肝癌组织和22例非乙型肝炎相关性肝细胞肝癌组织,免疫组织化学法检测HBX、COX-2及血管内皮细胞表面抗原(CD34)的表达,光镜下记录微血管计数(MVD).Spearman相关性分析HBX、COX-2与乙型肝炎相关性HCC组织微血管生成及转移中的关系; Western blot和RT-PCR检测稳定转染HBX肝癌细胞HepG2(HepG2-X)中COX-2的变化;酶联免疫吸附法检测HepG2-X培养上清液中前列腺素E2(PGE2)表达水平及不同浓度(10、30、50 μ mol/L和70 μmol/L)COX-2选择性抑制剂塞来昔布作用后PGE2的表达水平;锥虫蓝拒染法检测细胞生长速度.结果 乙型肝炎相关性HCC组织中HBx、COX-2均高表达,HBx阳性表达组中COX-2阳性率为88.87%(55/62),明显高于HBx阴性组的31.82%(7/22,x2=27.188,P＜0.01)和非乙型肝炎相关性HCC组40.91%(9/22,x2=20.453,P＜0.01);HBx阴性表达的乙型肝炎相关性HCC组和非乙型肝炎相关性HCC组中COX-2阳性表达率差异无统计学意义(x2=0.393,P=0.531); HBx和COX-2在转移组表达高于无转移组(P＜0.01);HBx及COX-2的阳性表达组平均MVD值均明显高于HBx阴性组和非乙型肝炎相关性HCC组(P＜0.05),且转移组MVD高于无转移组(P＜0.01);门静脉侵犯组高于非侵犯组(P＜0.01);Spearman相关性分析结果提示HBx、COX-2在乙型肝炎相关性HCC组织微血管生成及转移中的表达呈正相关(Rs=0.568,P＜0.01);在HepG2-X细胞中,COX-2蛋白及mRNA表达水平与转染空载体的对照肝癌细胞HepG2 (空载体转染HepG2细胞,HepG2-PC)相比,均显著提高,并且细胞培养上清液中PGE2表达水平也显著提高;和转染空载体的对照细胞相比,塞来昔布对转染HBx基因的细胞分泌PGE2具有更强的抑制作用.结论 HBx、COX-2在乙型肝炎相关性HCC中有较高的表达水平,二者呈正相关,与HCC微血管生成和侵袭转移密切相关.COX-2可能是HBx促使肝癌组织微血管生成和转移的一个重要中间分子,其可能的调节机制是通过HBx、COX-2及PGE2作为信号转导通路在HCC的浸润与迁移,在微血管生成与转移的过程中发挥双重作用.     

乙型肝炎病毒/P22蛋白对HepG2细胞凋亡的影响

目的研究HBV／P22蛋白对肿瘤坏死因子（TNF）α诱导的HepG2细胞凋亡的影响。方法用放线菌素D和TNFo【分别诱导表达HBV／P22蛋白的HepG2细胞（实验组）、表达空载体的HepG2细胞（阴性对照组）和HepG2细胞（空白对照组）凋亡，雅培试剂检测细胞上清液中HBeAg的表达，Westernblot及免疫细胞化学法检测HBV／P22蛋白表达，流式细胞仪和末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记（TUNEL）法检测细胞凋亡。体内实验：将前述三种细胞分别注射入裸鼠皮下，放线菌素D、TNF仅注射瘤体后，免疫组织化学法检测组织HBV／P22蛋白的表达，TUNEL法检测组织细胞凋亡率。结果实验组细胞培养上清液中HBeAg表达阳性，两对照组阴性；Westernblot及免疫细胞化学法检测均显示实验组细胞有HBV／P22蛋白表达，两对照组均为阴性；流式细胞仪和TUNEL结果均显示实验组细胞凋亡率明显低于两对照组（P〈0．05）。体内实验：实验组瘤体组织免疫组织化学检测结果显示HBV／P22蛋白表达阳性，TUNEL检测结果显示接种表达HBV／P22蛋白的HepG2细胞裸鼠瘤组织细胞凋亡率明显低于两对照组（P〈0．05）。结论HBV／P22蛋白在体内外均可抑制TNFα诱导的HepG2细胞凋亡。     

乙型肝炎病毒x蛋白对肝细胞FasL表达的激活作用

目的探讨ＨＢｘ蛋白对肝细胞Ｆａｓ配基（ＦａｓＬ）表达的调控作用。方法构建ＨＢｘ基因的真核表达载体ｐＣＥＰ４ｘ,电击法转染ＨｅｐＧ２细胞,潮霉素筛选阳性克隆细胞ＨｅＰＧ２Ｘ。用免疫细胞化学染色和免疫蛋白印迹法检测转染ＨＢｘ基因的ＨｅｎＧ２ｘ细胞ＦａｓＬ蛋白的表达。结果逆转录ＰＣＲ祛分析表明,ＨＢｘ基因在转染细胞内可有效转录;ＨｅｐＧ２ｘ细胞出现新的ＦａｓＬ蛋白表达。结论乙肝病毒ｘ蛋白可激活肝细胞表达ＦａｓＬ。     

乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP13的克隆

目的克隆乙型肝炎病毒（HBV）x蛋白反式激活新型靶基因。方法以HBVX蛋白表达质粒pcDNA3、1（－）-X转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1（－）为平行对照,提取总RNA进行逆转录,对产物行基因表达谱芯片分析,确定新基因编码序列后,以逆转录多聚酶链反应（RT—PCR）技术扩增新基因序列。结果获得新基因的全长序列,并测序证实,命名为X蛋白反式激活蛋白13（XTP13）。结论成功克隆XTP13,为进一步阐明HBxAg在HBV感染中的分子生物学机制奠定基础。     

低密度cDNA Macroarray对干扰素α抗病毒蛋白的筛选

目的 基于低密度cDNA Macoarray技术筛选出差异表达的干扰素(IFN)α抗病毒基因,以探讨IFN α抗病毒蛋白的表达与HBV复制的关系. 方法 以一定浓度的IFN α处理肝胚瘤细胞株HepG2和HepG2.2.15细胞6h,用cDNA Macroarray分析比较两细胞株IFN α抗病毒基因表达谱,并筛选出差异表达的IFNα抗病毒基因.将表达HBV核心蛋白(HBc)的质粒pHBc-EGFP转染HepG2细胞,RT-PCR法分析HBc对IFN α抗病毒基因表达的影响.将表达抗黏病毒A蛋白(MxA)的表达质粒pcDNA3.1-Flag-MxA转染HepG2.2.15,以酶联免疫吸附试验、Dot blot、Southern blot等方法分别检测HepG2.2.15细胞表达释放的HBsAg与HBeAg、细胞外HBV DNA和细胞内HBV DNA复制中间体(松弛环状DNA、双股线性DNA),以判断HBV复制情况.两组间数据比较采用t检验,组间不同时间点数据比较采用单因素方差分析.结果 cDNA Macroarray分析显示HepG2和HepG2.2.15细胞的抗病毒基因表达谱具有差异性:IFNa抗病毒基因中干扰素诱导跨膜蛋白(IFITM)1、IFITM2、IFITM3、RING4等在HepG2.2.15细胞的表达被部分抑制,而重要的抗病毒蛋白MxA表达被完全抑制.HBc转染组细胞中MxA mRNA表达的相对水平为0.31±0.05,低于空白对照组的0.74±0.04,差异有统计学意义,P＜0.05.MxA蛋白转染HepG2.2.15细胞48、72 h后,MxA转染组细胞上清液中HBsAg的S/CO值分别为1.42+0.21和1.58±0.18,HBeAg的S/CO值为1.44±0.14和2.28±0.24,而空白对照组细胞上清液中HBsAg的S/CO值为1.92±0.19和2.79±0.25,HBeAg的S/CO值为2.31±0.46和3.37±0.29,两组细胞上清液中HBV抗原的S/CO值差异均有统计学意义,P值均＜0.05.细胞外HBV DNA、胞内HBV复制中间体DNA均无明显变化.结论 HBV及其抗原成分的复制和表达影响着IFNα抗病毒蛋白的表达;HBV通过抑制IFN α抗病毒蛋白的表达而发挥拮抗IFNα的抗病毒活性.     

HBx-GFP DN突变子长期稳定表达抑制2.2.15细胞乙型肝炎病毒基因的表达

目的　探索和寻找更有效的乙型肝炎治疗新的靶点和新的治疗方法 ,研究其抗病毒基因表达作用。方法　运用基因工程技术 ,建立了HBx GFP及其作对照的表达野生X蛋白、绿色荧光蛋白 (GFP)的长期稳定表达细胞克隆 ,Northernblot检测细胞内的乙型肝炎病毒相关基因RNA转录 ,应用RIA检测细胞上清液中HBsAg和HBeAg表达 ,观察对乙型肝炎病毒基因表达的影响。 结果所构建的X GFP突变子 ,Xwt,GFP质粒均能在 2 .2 .15细胞株中稳定高效表达并使细胞上清液中HBsAgHBeAg表达水平分别较 2 .2 .15组的 ( 10 1± 5.5)ng/ml、 ( 12 1± 8.6)ng/ml显著降低为平均( 7.6± 11.5)ng/ml、 ( 3 5± 3 .5)ng/ml (P <0 .0 1) ,细胞内的病毒 3 .5kb ,2 .1kb及 2 .4kb的RNA与各对照组比较均有显著降低 ,以 2 .1kb及 2 .4kb的mRNA下降最为显著。结论　乙型肝炎X基因DN突变子X GFP能显著抑制乙型肝炎病毒基因转录和S ,C基因的表达。提示 ,X基因亦是乙型肝炎治疗的一个靶基因