NK细胞与K562细胞之间相互免疫编辑作用及其对NK细胞杀伤活性的影响

目的：探讨NK细胞与K562细胞混合培养前、后其杀伤活性的变化及分子机制。方法：流式细胞仪检测NK细胞与K562细胞混合培养前、后细胞表面相应分子的变化,LDH释放法测定效靶比20∶1时NK细胞对K562细胞的杀伤活性。结果：相互编辑前,K562细胞表面MICA/MICB的表达率为(79.90±0.87)%,NK细胞表面NKG2D、KIR2DL1和KIR3DL1的表达率分别为(98.27±0.67)%、(45.70±1.22)%和(35.60± 1.35)%。相互编辑后,K562细胞表面MICA/MICB和NK细胞表面NKG2D的表达率分别为（35.56±1.01）和（34.67±3.88）%,均明显低于编辑前（Ｐ=0.000）;NK细胞表面KIR2DL1和KIR3DL1的表达率分别为（47.20±1.08）%和（34.03±1.20）%,与编辑前比较差异均无显著性(Ｐ>0.05)。效靶比20∶1时,NK细胞对编辑后的K562细胞的杀伤活性为(24.07±0.58)%,编辑后的NK细胞对K562细胞的杀伤活性为(16.95±2.00)%,均明显低于编辑前NK细胞对K562细胞的杀伤活性［(54.03±3.46)%］(Ｐ＝0.000)。结论: NK细胞与K562细胞持续性接触后,双方发生了相互免疫编辑作用;NK细胞的杀伤活性下降,其分子机制是细胞表面相应的配受体发生了变化。     

NKG2D配体在耐药鼻咽癌细胞的表达及其对NK细胞杀伤活性的影响

目的 探讨NKG2D的主要活化性配体在鼻咽癌亲本细胞CNE2和多药耐药细胞CNE2/DDP的表达及其对自然杀伤(NK)细胞杀伤活性的影响.方法 流式细胞仪检测NKG2D的主要活化性配体MHC-Ⅰ类链相关蛋白A和B(MICA、MICB)、UL16结合蛋白1-3(ULBP1、ULBP2、ULBP3)在CNE2、CNE2/DDP细胞的表达情况;PCR-SSP法检测CNE2、CNE2/DDP细胞HLA-A、B、Cw分型和NK细胞KIR分型;LDH释放法测定5例健康者的NK细胞在不同效靶比时对CNE2、CNE2/DDP细胞的杀伤活性;效靶比20∶1时观察不同单抗对NK细胞杀伤CNE2、CNE2/DDP细胞活性的阻断作用.结果 CNE2、CNE2/DDP细胞HLA分型为A2,24,B18,35,Cw4,7;5例健康者的NK细胞表达KIR2DL1,KIR2DL3,KIR3DL1,KIR3DL2与CNE2、CNE2/DDP细胞表面的HLA-I类分子之间存在错配.CNE2、CNE2/DDP细胞均表达NKG2D的配体MICA、MICB、ULBP2,均不表达ULBP1、ULBP3;CNE2细胞MICA、MICB的表达率与CNE2/DDP细胞相比差异有统计学意义(P＜0.01).效靶比5∶1、10∶1、20∶1、30∶1时NK细胞对CNE2、CNE2/DDP细胞的杀伤活性分别是(10.50±2.17)%、(4.98±0.95)%;(27.68±1.47)%、(15.48±2.10)%;(36.99±3.13)%、(28.46±4.30)%;(55.00±2.20)%、(40.95±2.21)%.在各效靶比时NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性与CNE2/DDP细胞相比差异有统计学意义(P＜0.01);效靶比20∶1时anti-MICA、anti-MICB、anti-ULBP2单抗可明显抑制NK细胞对CNE2、CNE2/DDP细胞的杀伤活性,与阻断前相比差异有统计学意义(P＜0.05);anti-ULBP1、anti-ULBP3单抗不能阻断NK细胞对CNE2、CNE2/DDP细胞的杀伤活性.结论 NKG2D的主要活化性配体MICA、MICB在CNE2、CNE2/DDP细胞的表达差异与NK细胞的杀伤活性有关,肿瘤细胞在发生多药耐药的同时获得了免疫逃避能力.     

人鼻咽癌细胞株CNE2对NK细胞KIR/NKG2D受体的免疫编辑作用及其对NK细胞杀伤功能的影响

目的 探讨NK细胞与表达NKG2D配体的人鼻咽癌细胞株CNE2混合培养后4、24、48h时KIR、NKG2D的变化及其对NK细胞杀伤CNE2细胞活性的影响.方法 PCR-SSP法检测CNE2细胞HLA-A、B、Cw表型、NK细胞KIR表型(选择3例健康者为试验对象),流式细胞仪检测对照组(新鲜分离的NK细胞)KIR2DL1、KIR2DL3、KIR3DL1、NKG2D的表达情况.IL2组(IL2培养的NK细胞)、CNE2组(CNE2、IL2、NK细胞混合培养)培养后4、24、48 h时KIR2DL1、KIR2DL3、KIR3DL1、NKG2D的表达情况,LDH释放法测定IL2组及CNE2组培养24 h后的NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性.结果 CNE2细胞表面HLA-A、B、Cw表型为A2,24;B18,35;Cw4,7.3例健康者均表达KIR2DL1、KIR2DL3、KIR3DL1.CNE2组4、24、48 h时KIR2DL1、KIR2DL3表达较对照组、IL2组明显升高(P＜0.01),NKG2D表达较对照组、IL2组明显降低(P＜0.01),KIR3DL1表达与对照组、IL2组相比无明显变化(P＞0.05).IL2组4、24、48 h时KIR2DL1、KIR2DL3、KIR3DL1及NKG2D表达与对照组相比无明显变化(P＞0.05).IL2组、CNE2组培养24 h后的NK细胞对CNE2细胞的杀伤活性在效靶比10∶1时分别为(26.%±1.47)%和(2.74±1.64)%,两者相比差异有统计学意义(P＜0.01);效靶比20∶1时分别为(35.74±3.59)%和(4.57±2.41)%,两者相比差异有统计学意义(P＜0.01).结论 NK细胞与NKG2D配体阳性的肿瘤细胞持续性接触,下凋NK细胞表面NKG2D表达,上调NK细胞表面与HLAⅠ类分子相结合的KIR表达,导致NK细胞对靶细胞杀伤活性减低.本研究阐明了编辑后的NK细胞杀伤活性减低的分子基础,同时提示阻断HLAⅠ类分子与KIR的结合或者增强NK细胞表面NKG2D的表达将有利于提高NK细胞杀伤肿瘤细胞的活性.     

高原胃癌患者自然杀伤细胞活化性受体NKG2D的表达

目的研究高原胃癌患者外周血NK细胞表面活化性受体NKG2D的表达,并分析探讨宿主NK细胞受体NKG2D在胃癌中的作用及其与肿瘤免疫逃逸的关系。方法对41例高原胃癌患者及30例健康人,采用流式细胞术检测外周血NK细胞NKG2D的表达状况并行相关分析。结果高原胃癌患者及健康者外周血NK细胞NKG2D的表达水平分别为（13.26±7.51）%、（32.18±5.14）%,胃癌组明显低于正常组,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论高原胃癌的免疫逃逸可能与NKG2D表达下调有关。高原胃癌患者外周血NK细胞活性降低,其活化性受体NKG2D表达的下降是NK细胞活性下降的原因之一。     

宫颈癌患者自然杀伤细胞活性受体NKG2D及其配体MICA表达的初步研究

目的 研究宫颈癌、CIN及子宫肌瘤患者与正常人外周血NK细胞表面活化性受体NKG2D的表达及局部组织中相应配体MICA的表达情况,初步探讨NKG2D-MICA在宫颈癌中的抗肿瘤机制和肿瘤免疫逃逸机制.方法 采用流式细胞术检测宫颈癌、CIN及子宫肌瘤患者组与宫颈组织正常组外周血NK细胞NKG2D的表达状况,RT-PCR技术检测各组组织标本中MICA的表达.结果 宫颈癌、CIN及子宫肌瘤患者组与宫颈组织正常组外周血NK细胞受体NKG2D的表达分别为(76.87±9.39)%、(81.84±7.94)%、(86.77±8.68)%、(93.968±4.9)%,各病例组与正常对照组相比,均有统计学意义,但各病例组之间的两两比较无统计学意义.相应配体MICA mRNA的表达率在宫颈癌组织中明显高于正常组和子宫肌瘤组,其差异有统计学意义,而各病例组与对照组相比均有统计学差异. 结论 宫颈癌患者外周血NK细胞活性降低,其活化性受体NKG2D表达的下降是NK细胞活性下降的原因之一.NKG2D的配体MICA基因在宫颈癌组织中的表达上调,且随着病变进展其表达有升高趋势,可能与宫颈鳞状上皮损伤向宫颈癌的转化有一定的相关性,宫颈癌的免疫逃逸可能与NKG2D表达下调及其配体MICA的表达升高有关.     

麦考酚酸体外对肝脏自然杀伤细胞活性及其受体表达的影响

目的 探讨麦考酚酸(MPA)对肝脏自然杀伤(NK)细胞活性的影响及其机制.方法 分离C57BL/6小鼠肝脏NK细胞,用不同浓度MPA处理24 h后,3H-TdR释放法检测NK细胞杀伤活性,ELISA法检测培养上清IFN-γ,IL-2,IL-10含量,流式细胞术检测NK细胞受体NKG2D,NKG2A,Ly49A的表达情况.结果 不同浓度MPA处理后肝脏NK细胞杀伤活性较正常对照明显降低(P＜0.01),IFN-γ,IL-2分泌量降低,而IL-10分泌量增高,NK细胞活化性受体NKG2D和抑制性受体Ly49A的表达下调,抑制性受体NKG2A的表达上调,高浓度的MPA作用后结果更明显.结论 MPA通过下调肝脏NK细胞活化性受体NKG2D并上调抑制性受体NKG2A而抑制肝脏NK细胞活性并影响细胞因子的分泌.     

细胞因子诱导的杀伤细胞免疫表型及其对EC9706细胞杀伤活性的影响

目的:探讨体外培养细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)过程中CD3+ CD56+、NKG2D的动态变化及其与CIK细胞对EC9706杀伤活性的关系.方法:流式细胞仪检测EC9706细胞NKG2D配体的表达:体外分离健康供者外周血单个核细胞,干扰素-γ、向细胞介素-2、CD3单克隆抗体诱导培养.流式细胞仪检测0、7及14 d的细胞CD3+CD56+、NKG2D的表达,乳酸脱氢酶释放法测定0、7及14 d的细胞在效靶比20:1和30:1时对EC9706细胞的杀伤活性.结果:EC9706细胞表达MICA和ULBP2,不表达MICB、ULBP1和ULBP3.0、7及14 d细胞表面NKG2D表达率分别为(26.3±1.1)%、(38.3±0.4)%和(67.1±1.3)%,差异有统计学意义(F＝1 393.352,P＜0.001);CD3+CD56+细胞分别为(0.7±0.1)%、(12.2±1.4)%和(56.5±2.0)%,差异有统计学意义(F=1 301.226,P＜0.001);0、7及14 d细胞对EC9706细胞的杀伤活性:效靶比20:1时分别为(7.1±2.0)%、(17.4±1.4)%和(37.7±0.2)%,差异有统计学意义(F=354.250,P＜0.001);效靶比30:1时分别为(8.7±0.8)%、(27.2±1.6)%和(44.3±1.1)%,差异有统计学意义(F=648.070,P＜0.001).相关分析表明CIK细胞的杀伤活性与细胞表面NKG2D表达及CIK细胞中CD3+CD56+细胞数有关(r分别为0.992、0.965、0.939和0.929,P＜0.001).结论:体外CIK细胞培养增殖过程中,NKG2D分子表达逐渐上调,CD3+CD56+细胞逐渐增多,CIK细胞对EC9706细胞的杀伤活性逐渐增强.     

NK细胞免疫编辑后的人鼻咽癌细胞株CNE2 HLA Ⅰ类分子和MICA/MICB的表达及其对NK细胞杀伤活性的影响

目的: 探讨自然杀伤(NK)细胞与表达NKG2D配体的人鼻咽癌细胞株CNE2混合培养24 h时CNE2细胞表面HLA Ⅰ类分子及MHC Ⅰ类链相关分子(MICA/MICB)的变化及编辑前、后的CNE2细胞对NK细胞杀伤敏感性的差异. 方法:PCR-SSP法检测NK细胞KIR分型,流式细胞仪检测编辑前的CNE2细胞(单纯培养的CNE2细胞),编辑后的CNE2细胞(NK细胞与CNE2细胞10∶ 1混合培养24 h)表面HLA Ⅰ类分子及MHC Ⅰ类链相关分子(MICA/MICB)的表达情况,LDH释放法测定3例健康者的NK细胞在不同效靶比时对编辑前、后的CNE2细胞的杀伤活性. 结果:编辑前、后的CNE2细胞表面MICA/MICB的表达率分别为(88.67±2.81)%和(34.53±3.15)%,两者相比差异有统计学意义(P＜0.01);编辑前、后的CNE2细胞表面HLA Ⅰ类分子表达率分别为(99.77±0.12)%和(97.80±0.87)%,两者相比差异无统计学意义(P＞0.05). NK细胞对编辑前、后的CNE2细胞的杀伤活性在效靶比10∶ 1时分别为(26.96±1.47)%和(6.60±0.86)%,两者相比差异有统计学意义(P＜0.01);效靶比20∶ 1时分别为(35.74±3.59)%和(11.57±2.02)%,两者相比差异有统计学意义(P＜0.01). 结论: CNE2细胞与NK细胞持续性接触24 h,CNE2细胞表面HLA Ⅰ类分子表达无改变,MICA/MICB表达下调,导致编辑后的CNE2细胞激发NK细胞杀伤活性下降. 本研究初步证明了NK细胞对编辑后的肿瘤细胞杀伤活性下降的分子基础,同时为我们如何提高NK细胞的杀伤活性提供了新的干预的靶点.     

NK细胞体外培养及对HepG2细胞的杀伤活性研究

目的:研究NK细胞的体外培养及对HepG2的杀伤活性。方法:采集外周血,肝素抗凝,分离单个核细胞(PMBC),用NK细胞培养基(补加IL-2200U/ml)培养12d,用流式细胞仪检测其表面标志及细胞毒颗粒表达水平,并按效靶比5∶1、10∶1、20∶1加入HepG2细胞,比较其杀伤活性。结果:培养12d的NK细胞CD3~-CD56~+阳性率(73.6±11.3)%与培养前的阳性率(14.2±5.1)%相比有显著性差异(P<0.001),其穿孔素、颗粒酶B、CD107a的表达水平分别为(75.5±10.9)%、(62.2±8.9)%、(63.9±10.5)%。在5∶1～20∶1效靶比范围内,随着效靶比增加,NK对HEPG2细胞杀伤活性增强(P<0.05)。结论:NK细胞对肿瘤细胞具有杀伤活性,随着效靶比增加,杀伤活性增强。     

体外抗体功能修饰抑制性KIR对人NK细胞的影响

目的:检测抗体封闭抑制性受体KIR2DL1和KIR2DL2/2DL3对人NK细胞功能的影响.方法:应用Rosettesep人NK分选试剂盒分选外周血NK细胞,观察抗体封闭KIR2DL1和KIR2 DL2/2DL3受体后,NK细胞对不同白血病细胞(人肿瘤细胞株NB4、Raji和K-562)及同种异体的成熟树突状细胞(DC)的杀伤活性;检测混合淋巴细胞反应中NK细胞对T淋巴细胞增殖的影响;检测细胞因子TGF-β1的表达水平.结果:任何一个抗体封闭KIR后,NK细胞杀伤NB4细胞活性均增强,并与抗体浓度呈现量效关系(P＜0.05),2个抗体联用能增强NK细胞的杀伤活性;对Raji细胞的杀伤活性则改变较小;NK细胞对K-562细胞具有很强的杀伤活性,但经抗体封闭后,这种活性并没有提高.经抗体封闭KIR后,NK细胞对成熟DC的杀伤活性明显增强,并与抗体浓度呈现量效关系(2.20%±1.10% vs 37.59%±5.06%),各组间比较差异有统计学意义(P＜0.05).经抗体封闭后的NK细胞在混合淋巴细胞反应中能明显提高对T细胞的增殖抑制(77.85%±8.31% vs 43.05%±5.95%,P＜0.05),上清液中细胞因子TGF-β1的含量增加.结论:以抗体修饰抑制性KIR受体有助于提高NK细胞杀伤肿瘤及同种异体成熟DC的能力,活化的NK细胞通过分泌TGF-β1,抑制T细胞的增殖、活化.     

Study of vascular smooth muscle cell calcification induced by hyperphosphate and intervented by phosphonoformic acid

Objective:To evaluate the effects of different concentrations of phosphate on calcium deposition and osteocalcin level in cultured bovine aortic smooth muscle cell,investigate the mechanism of hyperphosphatemia to evoke calcification of vascular smooth muscle cell and observe the effects of phosphonoformic acid(PFA)in different concentrations on vascular calcification.Methods:The bovine aortic smooth muscle cells(BASMC)were cultured.Calcium deposition and the expression of osteocalcin of BASMC in different concentrations of phosphate(1.5mmol/Land2.0mmol/L)and PFA were determined by o-cresolphthalein complexone and radioimmunity methods,respectively.Osteocalcin mRNA expressions were determined by RT-PCR.Results:After six or nine days of BASMC cultured,the calcium deposition in Pi 2.0 mmol/L group was more than that in Pi 1.5 mmol/L group[(77.187±11.692)μg/(mg·protein)vs(25.768±1.750)μg/(mg·protein),P＜0.01 and(125.399±16.677)μg/(mg·protein)vs(29.046±2.635)μg/(mg·protein),P＜0.01 respectively].The calcium deposition was dependent on time and dosage of phosphate treatment.After 72 h culture the osteocalcin in Pi2.0 mmol/L group was more than that in Pi1.5 mmol/L group[in supernatant,(1.503±10-2±2.601×10-3)ng/(μg·protein)vs(2.981×10-3±8.382×10-4)ng/(μg·protein),P＜0.001],the same was found in osteocalcin mRNA expression[OC/GAPDH,(1.906±0.132)vs(0.748±0.037),P＜0.001].Compared to Pi 1.5mmol/L group,bovine smooth muscle cells(BSMC)cultured in media containing Pi 2.0 mmol/L phosphate levels increased calcium deposition[On day 6,(77.187±11.692)μg/(mg·protein)vs (25.768±1.750)μg/(mg·protein),P＜0.001].Elevated phosphate treamaent of BSMCs also enhanced the expression of the osteoblastic differentiation marker osteocalcin[On day 3,Pi 2.0 mmol/L group vs Pi 1.5mmol/L group,(1.503×10-2±2.601×10-3)ng/(μg·protein)vs(2.981×10-3±8.382×10-4)ng/(ug·protein),P＜0.001].PFA decreased ciacium deposition and osteocalcin expression statistically[Pi 2.0 mmol/L PFA1.0 mmol/L group vs Pi 2.0 mmol/L group,ciacium deposition,(37.729±5.899)μg/(mg·protein)vs(77.187±11.692)μg/(mg·protein),P＜0.001];Osteocalcin in supernatant,(4.529±10-3±1.250×10-3)ng/(μg·protein)vs(1.503×10-2±2.601×10-3)ng/(μg·protein),P＜0.001;osteocalcin mRNA expression,OC/GAPDH,(0.642±0.092)vs(1.89±0.165),P＜0.01].Conclusion:Hyperphosphate may directly promote calcium deposition and the osteocalcin expression of BASMCs.It may be a new explanation for the phenomenon of vascular calcification in hyperphosphatemic conditions.Hyperphosphatemia is an independent factor to stimulate vascular calcification.PFA can inhibit calcium deposition and osteocalcin expression induced by elevated phosphate.PFA may be a new medicine to treat vascular calcification induced by elevated phosphate.     

单个shRNA质粒同时抑制LNCaP细胞人端粒酶催化亚单位和雄激素受体的表达

目的 探讨单个shRNA质粒联合抑制LNCaP细胞人端粒酶催化亚单位(hTERT)和雄激素受体(AR)基因表达的可行性.方法 使用RNAi-DNA载体技术,将hTERT和AR siRNA的DNA模板同时插入到载体Pgenesil,构建成重组质粒Pgenesil-hTERT-AR-shRNA,转染至LNCaP细胞,与空白对照、Pgenesil-HK-shRNA(通用阴性质粒)、Pgenesil-hTERT-shRNA和Pgenesil-AR-shRNA比较,利用实时荧光定量PCR技术观察其对LNCaP细胞hTERT和AR基因mRNA表达的影响.采用Annexin V方法检测细胞凋亡,MTF比色分析法测定细胞增殖活性.结果 空白对照组、Pgenesil-HK-shRNA组、Pgenesil-hTERT-shRNA组、Pgenesil-AR-shRNA组和Pgenesil-hTERT-AR-shRNA组细胞的hTERT基因mRNA分别为(1.51±0.08)×108、(7.32±0.43)×107、(2.94±0.15)×106、(4.45±0.25)×107、(3.17±0.18)×106 (copies/ml),各组AR基因mRNA分别为(1.92±0.11)×105、(6.47±0.32)×105、(3.70±0.24)×104、(1.22±0.06)×104、(7.21±0.41)×103 (copies/ml),提示Pgenesil-hTERT-shRNA对hTERT基因mRNA有抑制作用,Pgenesil-AR-shRNA对AR基因mRNA有抑制作用,Pgenesil-hTERT-AR-shRNA对hTERT和AR基因mRNA都有抑制作用(P＜0.05).Pgenesil-hTERT-AR.shRNA与Pgenesil-hTERT-shRNA、Pgenesil-AR-shRNA比较,引起的细胞凋亡、细胞生长抑制更加明显(P＜0.05).结论 含有hTERT-shRNA和AR-shRNA DNA模板的重组表达质粒Pgenesil-hTERT-AR-shRNA能够明显抑制hTERT和AR基因的表达和前列腺癌细胞的生长.     

慢性乙肝患者外周血NK细胞NKp46和NKG2A的表达

目的检测免疫清除期和免疫耐受期慢性乙肝患者外周血中NK细胞频率和NK受体NKp46和NKG2A表达情况。方法分离患者和建康对照者外周血单个核细胞,流式细胞仪检测各组NK细胞频率和受体表达。结果慢性乙肝免疫清除期患者外周血NK细胞占淋巴细胞比例（10．91％±3．93％,n=21）较免疫耐受期患者（15．65％±5．58％,n=15,P=0．024）和健康者（14．23％±7．37％,n=25,P=0．011）下降,免疫清除期患者NK细胞的NKp46表达f45．45％±14．00％,n=19）较免疫耐受期患者（23．35％±6．56％,n=8,P〈0．001）和健康者（31．69％±13．07％,n=20,P=0．001）明显上升,NKG2A表达（35．62％±13．20％,n=19）较免疫耐受期患者（25．57％±5．56％,n=8,P=0．038）和健康者（26．80％±10．49％,n=20。P=0．0471上升。结论慢性乙肝患者外周血NK细胞频率下降,NKp46和NKG2A表达上调,这些改变与免疫清除病毒有关。     

CHC患者外周血T细胞免疫功能与丙型肝炎病毒表达的关系

目的 探讨慢性丙型肝炎(CHC)患者外周血T细胞免疫功能与丙型肝炎病毒(HCV)复制及核心抗原(HCV-cAg)表达的关系.方法 采用流式细胞术、荧光定量PCR和ELISA对63例健康体检者(对照组)和85例CHC患者(CHC组)的外周血T淋巴细胞亚群、血清HCV-RNA和HCV-cAg进行测定.结果 CHC组总T细胞、T4细胞、T8细胞、双阴性细胞(DNT )、双阳性细胞(DPT )水平依次为(67 .37 ± 10 .43)% 、(37 .11 ± 10 .28)% 、(21 .63 ± 8 .87)% 、(7 .80 ± 4 .57)% 、(0 .20 ± 0 .29)% ,T4/T8比值为(2 .18 ± 1 .26 )% ,绝对水平依次为(0 .70 ± 0 .44 ) × 109/L、(0 .37 ± 0 .22 ) × 109/L、(0 .22 ± 0 .17 ) × 109/L、(0 .08 ± 0 .06 ) × 109/L和(0 .19 ± 0 .68)× 107/L ;CHC患者T8细胞水平显著减少(P＜0 .01) ,致使T4/T8比值升高(P＜0 .05);CHC患者总T细胞、T4细胞、T8细胞和DNT的绝对值均显著减少(P＜0 .05);HCV-RNA和 HCV-cAg阳性时 ,T4细胞和DNT 水平显著升高(P＜0 .05).结论 CHC患者 HCV复制表达时 ,患者 T细胞亚群存在明显异常 ,T细胞免疫功能低下或免疫耐受是CHC迁延难愈的重要原因.     

1,25-二羟维生素D3处理的树突细胞在变应性气道炎症中的免疫调节作用

目的 探讨1,25-二羟维生素D,[1,25(OH)2D3]处理的树突细胞(DC)在变应性气道炎症中的免疫调节作用及其机制.方法 小鼠骨髓来源DC分2组,分别用1,25(OH):D,和磷酸盐缓冲液(PBS)处理,RT-PCR和蛋白质印迹法检测2组Dc Notch配体Mrna和蛋白表达.将2组DC和Notch配体中和抗体封闭的1,25(OH)2D3处理DC分别与小鼠脾脏来源CIM+T细胞共培养,流式细胞仪检测CD4+T细胞中CD4+CD25+Foxp3+T细胞百分比.将卵清蛋白(OVA)致敏小鼠分2组,每组5只,分别过继转移1,25(OH)2D3组DC[1,25(OH)2D3-DC组]和PBS组DC(PBS-DC组),以OVA激发气道炎症后行肺脏病理、支气管肺泡灌洗液(BALF)中自细胞介素4(IL-4)、IL-5、IL-13和干扰素γ(IFN-γ)水平以及脾脏CD4+T细胞中CD4+CD25+Foxp3+T细胞百分比检查.结果 1,25(OH)2D3组DC Notch配体Jaggedl和Jagged2 Mrna表达(0.376±0.029、0.564±0.018)和蛋白表达(0.786±0.034、0.632±0.026)均明显高于PBS组(分别为0.146±0.032、0.267±0.012和0.124±0.025、0.098±0.012,均P＜0.01).与CIM+T细胞共培养后,1,25(OH)2D3组CD4+T细胞中CD4+C1)25+Foxp3+T细胞百分比(22.49%±0.56%)明显高于PBS组(6.67%±0.60%,P＜0.01);经Jagged2中和抗体封闭组CIM4CD25+Foxp3+T细胞百分比(6.56%±1.89%)明显低于未封闭组(20.37%±1.64%,P＜0.01),1,25(OH)2D3-DC组小鼠气道炎症明显轻于PBS-DC组;BALF中IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ水平(pg/ml)分别为33±5、134±23、91±11和未检测到(＜12.5),均明显低于PBS-DC组(分别为55±7、332±49、152±19、23±6,均P＜0.01);脾脏CD4+T细胞中CIM+CD25+Foxp3+T细胞百分比(14.69%±1.14%)明显高于PBS-DC组(2.38%±0.14%,P＜0.01).结论 1,25(OH)2D3处理DC对变应性气道炎症有抑制作用,这种作用可能与1,25(OH)2D3处理DC通过Jaggect2介导的Notch信号途径诱导CD4+CD25+Foxp3+T细胞生成有关.     

重型再生障碍性贫血患者外周血自然杀伤细胞亚群百分比及功能变化

目的 分析重型再生障碍性贫血(SAA)患者免疫抑制治疗(IST)前、后外周血自然杀伤(NK)细胞亚群占淋巴细胞百分比、功能变化及其与造血功能相关性,探讨NK细胞在SAA发病机制中的作用.方法 用流式细胞术检测2010年4月至2010年12月天津医科大学总医院收治的12例初治(初治组)、30例IST后恢复(恢复组)的SAA患者的外周血NK细胞(CD3-CD56+/CD16+)及其亚群[CD3-CD56brightCD16-(CD56bright)、CD3-CD56dimCD16+(CD56dim)、CD3-CD56-CD16+]占淋巴细胞百分比、活化性受体(NKG2D和NKp46)、穿孔素、颗粒酶β表达,并与13名健康对照(对照组)比较;分析上述变化与外周血中性粒细胞比例(ANC%)、淋巴细胞比例、网织红细胞计数及骨髓造血功能(增生程度、粒系百分比、红系百分比、巨核细胞数量、淋系百分比)的相关性.结果 (1)初治组NK细胞、CD56bright细胞百分比(10.30%±6.08%、0.11%)均显著低于恢复组(16.47%±8.29%、0.68%,P＜0.05)和对照组(19.45%±6.88%、0.53%,均P＜0.05);初治组CD56dim细胞百分比(9.62%±6.04%)明显低于对照组(18.21%±7.16%,P＜0.05);恢复组CD3-CD56-CD16+细胞百分比(0.79%)显著高于初治组及对照组(0.37%、0.41%,均P＜0.05).(2)初治组与恢复组NK细胞NKp46、穿孔素表达[初治组(88.23%、64.97%±21.61%),恢复组(82.97%、66.14%±20.73%)]显著高于对照组(40.99%、42.11%±27.25%,均P＜0.05).(3)NK、CD56bright及CD3-CD56-CD16+细胞的百分比与SAA患者ANC%呈正相关(r分别为0.423、0.609、0.468,均P＜0.05),与骨髓粒系百分比呈正相关(r分别为0.357、0.517、0.434,均P＜0.05);NK、CD56bright、CD56dim和CD3-CD56-CD16+细胞的百分比与SAA患者骨髓增生程度呈正相关(r分别为0.455、0.412、0.404、0.451,均P＜0.05),与骨髓淋系百分比呈负相关(r分别为-0.522、-0.435、-0.411、-0.547,均P＜0.05);NK细胞NKG2D、NKp46、穿孔素、颗粒酶β表达与各造血指标无相关性(均P＞0.05).结论 SAA患者外周血NK细胞、CD56bright、CD56dim亚群占淋巴细胞百分比降低及穿孔素途径增强可能引起免疫耐受被破坏、T细胞功能亢进而导致造血功能衰竭.

Abstract：

Objective To analyze the percentage and functional changes of natural killer(NK)cell subsets in peripheral blood of severe aplastic anemia(SAA)patients before and after immunosuppressive therapy(IST)so as to evaluate the relationships between these changes and hematopoietic functions and explore the role of NK cells in the pathogenesis of SAA.Methods By flow cytometry,the percentages of NK cells(CD3-CD56+/CD16+)and its subsets[CD3-CD56brightCD16-(CD56bright),CD3-CD56dimCD16+(CD56dim),CD3-CD56-CD16+]in peripheral blood lymphocytes were detected in 12 untreated patients,30 recovered patients and 13 normal controls respectively from April 2010 to December 2010 in our hospital.NK cells activating receptors(NKG2D and NKp46),pofforin and granzyme-β of patients and normal controls were also detected.The correlation between these changes and hematopoietic functions,including the percentages of neutrophil granulocyte(ANC%),lymphocyte and reticulocyte absolute value in peripheral blood,and hyperplasia degree,percentage of granulocytes,erythrocytes,lymphocytes and megakaryocytes absolute value in bone marrow were evaluated.Results (1)The percentages of NK cells (10.30% ± 6.08%)and CD56 bright cells(0.11%)in untreated patients were significantly lower than those of recovered patients(16.47% ± 8.29%,0.68%,both P ＜0.05)or normal controls(19.45% ±6.88%,0.53%,both P ＜0.05).The percentage of CD56dim cells in untreated patients was significantly lower than that of normal controls(9.62% ±6.04% vs 18.21% ±7.16%,P ＜0.05).The percentage of CD3 CD56 CD16 + cells was significantly higher in recovered patients than that of untreated patients or normal controls(0.79% vs 0.37%,0.41%,both P＜0.05).(2)The expression of NKp46 and pefforin of NK cells in untreated(88.23%,64.97% ± 21.61%)and recovered patients(82.97%,66.14% ±20.73%)were significantly higher than those of healthy controls(40.99%,42.11% ±27.25%,all P ＜0.05).(3)The percentage of NK CD56bright and CD3-CD56-CD16+ cells of patients was positively correlated with ANC%(r=0.423,0.609,0.468 respectively,all P＜0.05)and the percentage of granulocytes in bone marrow(r=0.357,0.517,0.434 respectively,all P＜0.05).The percentages of NK,CD56bight,CD56dim and CD3-CD56-CD16+ cells were positively correlated with the hyperplasic degree of bone marrow(r=0.455,0.412,0.404,0.451 respectively,all P＜0.05),but they were negatively correlated with the percentage of lymphocytes in bone marrow(r =-0.522,-0.435,-0.411,-0.547 respectively,all P ＜0.05).The expression of NKG2D,NKp46,pefforin and granzyme-β of NK cells had no correlation with hematopoiesis(all P＞0.05).Conclusion The lowered percentage of NK CD56bright,CD56dim cells and a higher expression of pefforin may cause the over-function of T lymphocytes and thus lead to hematopoietic failure in SAA.     

rhIFN-γ对白血病K562细胞CD123表达的影响

［摘要］目的　检测重组人γ-干扰素（recombination human interferon gamma,rhIFN-γ）对白血病K562细胞生长的抑制作用及其对CD123表达的影响. 方法　应用MTT法检测白血病K562细胞在不同浓度rhIFN-γ作用72 h的增殖活力以及用流式检测其CD123的表达．结果　5×104～108 U/L rhIFN-γ作用K562细胞72 h,细胞生长抑制率随剂量增大而增高,而2×105 U/L rhIFN-γ使其抑制率降低．rhIFN-γ 2×105 U/L、107 U/L孵育K562细胞72 h, 流式检测到CD123在K562细胞的表达量分别为（7.2±2.50）%和（21.6±1.17）%;107 U/L rhIFN-γ组与对照组（4.10±1.46）%比较,其差异有统计学意义（P＜0.05）. 结论　rhIFN-γ对白血病K562细胞生长有双向作用（抑制或促增殖）,诱导CD123表达增加.     

重症71型肠道病毒感染手足口病患儿的免疫指标分析

目的 探讨71型肠道病毒感染手足口病患儿的免疫指标变化情况,分析其临床意义.方法 选取2013年5月至2016年5月我院收治的71型肠道病毒感染所致的手足口病患儿170例为研究对象,按照疾病程度的不同将其分为轻症组80例以及重症组90例,另取同期于我院进行体检的同龄健康儿童70例作为对照组.对三组儿童细胞免疫(免疫表型及炎性因子)以及体液免疫(免疫球蛋白及补体)各指标检测结果进行回顾性分析与比较.结果 重症组患儿CD3+T细胞数量为(59.41±6.08)％、CD3+ CD4+T细胞数量为(17.44±4.20)％,CD3+ CD8+T细胞数量为(26.25±4.58)％;均低于轻症组[分别为(66.33±7.52)％、(20.01±3.86)％、(39.66±4.93％]及对照组[(73.58±7.94)％、(23.75±3.11)％、(51.32±5.07)％]差异有统计学意义(P＜0.05),重症组CD19+B细胞数量为(19.24±8.05)％,高于轻症组(14.68±6.71)％及对照组(12.03±5.22)％,差异均有统计学意义(P＜0.05).三组儿童CD4+/CD8+以及CD16+ CD56+ NK细胞数量相比差异无统计学意义(P＞0.05).重症组患儿IL-6、IL-10以及TNF-α表达水平均高于轻症组及对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05).重症组患儿免疫球蛋白及补体表达水平高于轻症组及对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 重症71型肠道病毒感染手足口病患儿存在明显的细胞免疫及体液免疫功能紊乱,临床应根据患儿具体情况适当开展免疫治疗.     

慢性乙型肝炎免疫细胞NKG2D表达在肝病重型化中的作用

目的分析乙型肝炎免疫细胞NKG2D表达与肝病重型化的关系。方法应用免疫荧光技术和流式细胞术（FCM）分选20例慢性重型乙肝（FHB）、10例无症状表面抗原携带者（ASC）、10例健康对照的外周血NK细胞，并定量分析NKG2D表达。应用免疫组化SP法分析20例慢性乙肝（CHB）（轻度8例，其中G1级6例，G2级2例；中度7例，重度5例，其中G3级9例，G4级3例）、11例FHB肝组织内细胞毒细胞NKG2D的表达差异。结果经FACS可获得高纯度、高活性的NK细胞。FHB患者NK细胞的NKG2D蛋白表达量高于ASC和正常对照组，差异有显著性（P〈0．01）。免疫组化结果显示，FHB组肝脏免疫细胞NKG2D蛋白表达量分别高于CHB（G3、G4）组、CHB（G1、G2）组和正常对照组，差异有显著性（P〈0．01）。CHB（G3、G4）组高于正常对照组（P〈0．01），但CHB（G1、G2）组分别与CHB（G3、G4）组和正常对照组比较，差异无显著性（P〉0．05）。结论乙型肝炎外周血NK细胞和肝组织内细胞毒细胞NKG2D过度表达与重型肝炎发生相关。     

阿奇霉素对哮喘豚鼠气道炎症核因子-Kappa B的表达研究

目的研究不同剂量阿奇霉素（Azithromycin,AZM）对哮喘豚鼠肺组织核因子-Kappa B（NF-κB）的表达影响。方法将40只健康雄性豚鼠随机分成对照组（A组,n=8）、哮喘组（B组,n=8）、阿奇霉素低剂量治疗组（C组,n=8）、阿奇霉素中剂量治疗组（D组,n=8）、阿奇霉素高剂量治疗组（E组,n=8）。经鸡卵白蛋白（OVA）致敏后,给予OVA雾化吸入,制作哮喘动物模型。C组给予阿奇霉素25 mg/（kg.d）,D组及E组分别给予阿奇霉素50 mg/（kg.d）和100 mg/（kg.d）灌服。在末次雾化吸入OVA后,经动物呼吸机测定豚鼠呼吸道压力。用支气管肺泡灌洗液（BALF）和肺组织病理分析的方法检测肺组织炎症;用免疫组织化学的方法检测NF-κB亚单位P65在细胞核内的表达。结果肺组织病理切片显示C、D、E组肺组织炎症细胞浸润的范围较B组明显减小。B组BALF中白细胞总数为（72.25±5.73）×108/L,C组为（41.93±4.05）×108/L,D组为（12.16±1.53）×108/L,E组为（10.31±2.61）×108/L,组间比较差异有高度统计学意义（P〈0.01）。C组肺组织单位面积内细胞核表达NF-κB阳性的细胞数为（2.81±0.15）×103/mm2,D组为（1.40±0.07）×103/mm2,E组为（1.13±0.12）×103/mm2,B组为（4.32±0.16）×103/mm2,组间比较差异有高度统计学意义（P〈0.01）。结论阿奇霉素干预组BALF中白细胞总数较模型组降低,细胞核表达NF-κB阳性的细胞数明显减少,证明阿奇霉素可明显减轻哮喘引起的气道炎症。