纳他霉素高产菌株的链霉素抗性选育及其发酵工艺的优化

用紫外线对纳他霉素(Natamycin)产生菌褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvosporeus)ATCC13326菌株孢子进行诱变处理后，利用链霉素抗性突变选育得122株链霉素抗性突变株。其中纳他霉素产量高于出发菌株的有13株。突变株SG-56的生产能力达到出发菌株的146％，研究了其发酵性能，优化了培养基组成和发酵工艺条件，纳他霉素产量为2．81g／L，较出发菌株产量提高了170％。     

链霉素抗性筛选法在选育博来霉素A2组分高产菌株中的应用

应用链霉素抗性筛选法提高博来霉素产生菌Streptomycin verticillus SIPI 7011产博来霉素A2组分的产量，将经紫外线诱变处理过的博来霉素产生菌孢子涂布在含有链霉素最小抑制浓度（180μg／ml）的培养基平板上，获得了151株链霉素抗性突变株。其中博来霉素A2产量高于出发菌株的有19株，产量阳性效率达到12．6％，并获得一株产抗生素能力为出发菌株约1．25倍的突变株。     

高产纳他霉素的褐黄孢链霉菌选育

目的　以褐黄孢链霉菌 (Streptomyces gilvosporeus) S- 71为出发菌株 ,筛选纳他霉素的高产菌株。方法　紫外线对孢子悬浮液照射 4 0 s后 ,分别用链霉素抗性和琼脂块法进行筛选纳他霉素高产菌株 ,之后对高产菌株进行生产稳定性实验。结果　通过链霉素抗性法筛选获得了约 10 %的正选率突变株 ,其中突变株SG- 5 6摇瓶效价单位为 2 4 10μg/ ml,为出发菌株的 14 6 % ;通过琼脂块筛选法获得了约 1%的正选率突变株 ,其中突变株 SG- 2 0 0 2摇瓶效价单位为 2 6 5 0μg/ ml,为出发菌株的 16 1% ,该菌株无链霉素抗性标记。结论　链霉素抗性筛选和琼脂块筛选均可以获得纳他霉素的高产菌株 ,其中链霉素抗性筛选法效率高 ,琼脂块法筛选全面。     

链霉素抗性筛选法在柔红霉素产生菌S.coeruleorubidus var.zhengding SIPI 1482菌种选育中的应用

采用链霉素抗性筛选法,用含链霉素的高氏一号合成培养基筛天蓝淡红链霉菌ＳＩＰＩ１４８２菌株对链霉素的抗性自发突变株,检测突变株产抗生素水平。实验结果发现,在ＳＩＰＩ１４８２菌株的莲霉素抗性自发突变株中,正向突变的频率比较高（３４％）,同时获得了产抗生素能力是原菌株的１．５倍左右的突变株。     

核糖体工程技术选育米尔贝霉素高产菌株

本实验室中保存的一株从土壤中分离得到的米尔贝链霉菌(Streptomyces milbemycinicus)27号菌株所产米尔贝霉素A3和A4的初始产量分别为61.0和23.8μg/mL。以该菌株为出发菌株，采用核糖体工程技术，结合紫外诱变技术，对米尔贝霉素产生菌米尔贝链霉菌进行诱变，并以链霉素耐受为筛选压力进行筛选。经过诱变后对单菌落进行摇瓶复筛，其中正突变株中米尔贝霉素产量最高的菌株编号是R2-6-5，其米尔贝霉素A3和A4的产量分别是105.2和38.8μg/mL，较原始菌株分别提高了72.5%和63.3%，且遗传稳定。最后，对产量变化较大的11株突变株基因组中rsmG基因和rspL基因进行突变位点分析，发现在rspL基因内均未发生突变，rsmG基因均发生突变。本研究表明，链霉素抗性降低的突变菌株确实都在相关基因内发生突变，且核糖体工程结合紫外诱变的诱变方式效果良好，能够快速有效的提高米尔贝链霉菌生物合成米尔贝霉素的能力。     

纳他霉素产生菌基因组重排育种

Streptomyces gilvosporeus SG-1原生质体经紫外线诱变并筛选链霉素抗性菌株，获得纳他霉素高产菌株。在上述高产突变株中选择4株作为亲本进行基因组重排育种，筛选得到了高产重排菌株，其中一株重排菌株S．gilvosporeus GS-74的纳他霉素产量为3574mg／L。为产量最高的亲本菌株的153％，比原始出发菌株SG-1提高1.17倍。     

通过获得链霉素抗性基因(str)突变株筛选梅岭霉素高产菌株

本文通过链霉素对梅岭霉素（meilingmycin）产生菌南昌链霉菌NS－41－80菌株孢子致死浓度的测定，采用诱变剂EMS四种不同诱变剂量对菌株的孢子进行诱变处理，诱变处理的孢子涂布在含链霉素致死浓度的高氏平板上，获得了大量的链霉素抗性基因（str）突变株。然后从链霉素抗性基因突变株进一步筛选到梅岭霉素高产菌株80－5．11－221，在摇瓶条件下，只产梅岭霉素不产南昌霉素，梅岭霉素活性效价达1500μg/ml，比出发菌株NS－41－80的摇瓶发酵效价855μg/ml提高了77．9％，该菌株连续传代六代进行摇瓶发酵，其F2代和F3代梅岭霉素发酵效价稳定，F4代至F6代随着传代数增加，其梅岭霉素发酵效价急速下降。通过EMS诱变剂量分别与抗药性突变率和链霉素抗性基因突变株产梅岭霉素产量的产势统计分析表明，菌株抗药性突变与产抗生素突变密切相关，产抗生素突变的EMS诱变剂量高于链霉素抗性基因突变诱变剂量。在0．03mol/L的EMS剂量作用下，菌株致死率为99．43％，而抗药性突变率为0．0440％，建立了梅岭霉素产生菌链霉素抗性基因突变筛选方法，为南昌链霉菌高产菌种选育研究作了有益的尝试，并有助于其它链霉菌属的抗生素产生菌育种研究。     

链霉素抗性突变-万古霉素高产菌株的选育研究

以东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)AO-4为出发菌株，经紫外线(15w，253．7nm，距离30cm)诱变处理，筛选链霉素抗性突变株(链霉素浓度1000μg／ml)，从中获得万古霉素高产变株Amycolatopsis orientalis AO-29，其发酵效价较出发菌株提高170%。传代实验表明该变株的高产性能遗传特性较稳定。     

ARTP诱变结合抗性筛选选育西索米星高产菌株

目的 利用等离子体诱变,结合抗生素抗性筛选,获得西索米星高产菌株。方法 首先通过链霉素抗性筛选,获得一株比出发菌株产抗能力高的S4;随后以S4为出发菌株,经等离子体处理40s,借助巴龙霉素抗性筛选,得到双重抗性菌株。最后对突变株进行再次诱变,并结合高浓度链霉素抗性筛选。结果 获得一株高产突变株M. inyoensis SAAP22,比出发菌株效价提高了38.18%,具有稳定的遗传性能。结论 通过等离子体诱变,结合抗生素抗性筛选,可有效提升伊尼奥小单孢菌的西索米星合成能力,所得高产菌株具有潜在应用价值。     

组合链霉素和利福平抗性突变去甲基万古霉素高产菌株的选育

在去甲基万古霉寨生产菌株东方拟无枝酸菌的菌种选育中。利用核糖体工程育种方法，筛选得到的新菌株在发酵水平以及改善气丝及孢子生长贫瘠方面均有较大提高。首轮采用链霉素抗性筛选，得到突变株3．30，斜面外观丰满程度明显好于原对照株，发酵效价提高11．9％；第二轮组合链霉素和利福平抗性结合高能电子诱变育种，进一步巩固了育种成效，得到一系列代谢特点呈多样性的菌株，其中04-102发酵水平较原出发菌株提高45．8％，代谢速度加快，传代稳定性亦得到显著改善。     

Induction of streptomycin-inactivating enzyme by A-factor in Streptomyces griseus

The effect of A-factor on streptomycin resistance and productivity in Streptomyces griseus and S. bikiniensis was studied using A-factor-negative mutants. Resistance of several of these mutants was markedly increased by adding A-factor to the growing medium, as also was their streptomycin productivity. The A-factor induced resistance was due to inactivation by streptomycin-6-phosphotransferase, and enzyme synthesis in these mutants was completely dependent on the presence of A-factor. In the case of S. griseus 2247 where streptomycin productivity was independent of A-factor, resistance and synthesis of the inactivating enzyme were also independent of A-factor. A-Factor-negative mutants of S. griseus showed a decreased level of NADP-glycohydrolase and an increased level of several NADP-linked dehydrogenases, but these enzymes did not return to parental levels in cultures supplemented with A-factor. A-Factor seems to regulate streptomycin biosynthesis, not through an indirect metabolic sequence involving these enzymes but, more likely, by directly stimulating synthesis of enzyme(s) in the biosynthetic pathway.     

多杀菌素产生菌复合诱变选育及发酵培养基优化

目的 利用诱变结合抗性筛选方法选育多杀菌素高产菌株,并通过发酵培养基优化进一步提高多杀菌素产量。方法 分别确定链霉素、安普霉素和鼠李糖3种抗性的最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC),然后以S.s1-4为出发菌株,通过紫外(UV)结合链霉素、安普霉素、鼠李糖抗性因子诱变选育,在此基础上利用亚硝基胍(NTG)结合上述抗性因子诱变选育,并利用响应面实验设计对发酵培养基中葡萄糖、糊精、棉籽蛋白3种成分进行优化。结果 出发菌株经过紫外照射30s,涂布于抗性平板上,筛选得到S.s2-21,S.s2-21再用NTG处理30min,涂布于抗性平板上,最终获得1株遗传性状稳定的菌株S.s3-37,产量为78.26mg/L,提高了45.71%;发酵培养基优化后,其产量达83.00mg/L。结论 利用紫外和NTG结合抗性复合诱变选育获得多杀菌素高产菌株是有效的,通过发酵培养基优化,其产量较出发菌株提高了54.55%,获得良好的效果。     

维吉尼亚链霉菌物理诱变及外源添加氯化镧对VGM产量的影响

目的 利用物理诱变结合链霉素抗性筛选维吉尼亚霉素(VGM)高产菌株维吉尼亚链霉菌,并考察外源添加稀土元素氯化镧对维吉尼亚链霉菌发酵的影响。方法 一方面,以链霉素为筛选剂建立孢子致死突变标志的微波及紫外诱变两种筛选模型,采用管碟法获得抑菌圈直径较大的作为初筛菌株,再通过摇瓶复筛进一步确定高产菌株。另一方面,在发酵培养基中外源添加3~30mg/L的氯化镧,考查其对链霉菌合成VGM的影响。结果 比较两种筛选模型,基于链霉素的微波诱变效果较好,正突变率高达32.83%;并获得一株高产菌株MW 178(146.72±11.80)μg/mL,较出发菌株(21.24±1.34)μg/mL提高了约6倍。在发酵初始时,外源添加10mg/L氯化镧,VGM的产量由146.72μg/mL提高到180.01μg/mL,提高了约22.69%。结论 采用微波诱变结合链霉素抗性筛选的方法可以获得VGM高产突变株;在发酵初始时,外源添加适量氯化镧可以显著提高VGM产量。     

硝吡咯菌素菌种选育

目的把一种新的方法应用于提高硝吡咯菌素工业生产菌株的生产能力。方法在硝吡咯假单胞菌中引入氨基糖苷类抗生素抗性突变 ,以提高硝吡咯菌素的生产能力。结果从含 3倍和 1 0倍MIC抗生素的GYM筛选平板上挑取抗性突变株 ,挑选出产抗能力提高 5倍以及 1 0倍以上的突变株 ;引入链霉素抗性突变对提高硝砒咯菌素的生产能力的效果最佳 ;Geniticin和庆大霉素的抗性突变对提高抗生素生产能力的效果较差 ;潮霉素抗性突变对提高抗生素生产能力具有一定的效果。结论引入氨基糖苷类抗生素抗性突变 ,可以有效提高硝吡咯菌的生产能力。     

Mutational biosynthesis of a new antibiotic, streptomutin A, by an idiotroph of Streptomyces griseus.

Microorganisms producing antibiotics have been genetically converted by earlier workers to mutants which cannot produce antibiotic without supplementation with a moiety of the antibiotic. These antibiotics include neomycin, kanamycin, paromomycin, butirosin, sisomicin, ribostamycin and novobiocin. Success has not been reported for organisms producing guanidinocyclitol antibiotics such as streptomycin. We mutagenized conidia of the streptomycin-producing Streptomyces griseus strain 7-455F3 with nitrosoguanidine at pH 7.0. Non-producers of streptomycin were visually selected by the agar-plug technique using Bacillus subtilis. We successfully isolated mutant MIT-A5 which produces no streptomycin unless streptidine is added to the agar medium. The streptidine-dependent phenotype was confirmed in submerged culture in flasks. Attempts to produce new antibiotics by feeding aminocyclitols to mutant MIT-A5 failed. However a new antibiotic (streptomutin A) was produced by supplementation with the guanidinocyclitol, 2-deoxystreptidine. We propose the term "mutational biosynthesis" for the production of new metabolites by the use of mutants blocked in the biosynthetic pathway to the secondary metabolite. We further propose the term "idiotroph" to properly describe such mutants.