特布他林短时间作用增强急性肺损伤大鼠肺泡液清除的机制与αENaC的相关性

目的 探讨β2受体激动剂特布他林短时作用增强成体大鼠肺泡液清除的机制与肺泡上皮钠离子通道α亚基(αENaC)的相关性.方法 建立油酸急性肺损伤(ALI)大鼠模型;以PaO2、氧合指数,肺组织HE染色,血管外肺水含量(EVLW)为指标验证特布他林经气管给药作用1h促进ALI大鼠肺泡液重吸收的效果:通过实时荧光定量RT-PCR、Western blot测定各组大鼠肺组织的αENaC mRNA、αENaC蛋白的表达并比较它们的差异.结果 特布他林治疗组大鼠的PaO2、氧合指数、EVLW较ALI组有显著差异;各组大鼠αENaC mRNA、αENaC蛋白表达差异无统计学意义.结论 特布他林经气管给药作用1 h能显著促进ALI大鼠肺泡液重吸收;特布他林短时作用增强成体大鼠肺泡液清除没有通过αENaC基因表达实现.     

分离纯化大鼠肺泡Ⅱ型细胞中水通道蛋白-4的表达

目的观察经分离纯化的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞水通道蛋白-4(AQP4)的表达。方法对大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞进行分离、纯化，绎过特殊染色及电镜鉴定，用免疫细胞化学及免疫电镜方法检测水通道蛋白-4存该单细胞上的表达。结果大鼠肺泡Ⅱ型细胞免疫细胞化学水通道蛋白1—4呈强阳性，免疫电镜结果细胞膜上可见高电子密度阳性反应。结论水通道蛋白-4存存于分离的大鼠肺泡Ⅱ型细胞膜上，对呼吸系统水转运可能起到重要作用。     

内毒素对鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞钠泵的影响及机制

目的观察内毒素对大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)钠泵的影响。方法 ATⅡ细胞成功分离纯化后随机分为两组:①对照组(PBS);②LPS组(1μg/mL)药物干预4 h后用逆转录聚合酶链反应法(RT-PCR)检测ATⅡ细胞上钠泵α1、β1亚基mRNA的表达;免疫组化法检测钠泵α1、β1亚基蛋白的表达;用高效液相法测定细胞ATP、ADP、AMP和腺嘌呤核苷酸总量(TAN),间接测得钠泵的活性。结果 RT-PCR结果显示:LPS组α1、β1亚基的mRNA表达较对照组明显降低(P<0.05);酶活性检测结果显示:LPS组钠泵活性较对照组明显增高(P<0.05);免疫组化结果显示:ATⅡ细胞上钠泵α1、β1亚基蛋白均有表达,各组亚基蛋白的表达量差异无统计学意义(P>0.05)。结论内毒素能下调ATⅡ细胞钠泵α1、β1亚基的mRNA表达,应激调节钠泵活性,但对蛋白表达无明显影响,提示钠泵的变化可能与内毒素性肺损伤有关。     

油酸肺损伤时肺泡II型细胞钠转运功能的变化

目的观察油酸肺损伤模型中肺泡Ⅱ型上皮细胞钠主动转运功能的改变。方法建立大鼠油酸急性呼吸窘迫综合征(ARDS)模型后,分离纯化肺泡Ⅱ型上皮细胞,利用膜片钳全细胞记录模式研究钠转运功能状态以及β2受体激动剂特布他林对其的影响。结果ARDS大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞钠主动转运功能明显减弱,但是特布他林可以使全细胞钠转运增加。结论ARDS时肺泡上皮细胞钠主动转运功能仍然存在,但较正常时明显减弱;而特布他林仍可增加上皮钠转运。     

分离纯化大鼠肺泡Ⅱ型细胞中水通道蛋白-4的表达

目的 观察经分离纯化的大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞水通道蛋白-4(AQP4)的表达。方法 对大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞进行分离、纯化,经过特殊染色及电镜鉴定,用免疫细胞化学及免疫电镜方法检测水通道蛋白-4在该单细胞上的表达。结果 大鼠肺泡Ⅱ型细胞免疫细胞化学水通道蛋白-4呈强阳性,免疫电镜结果细胞膜上可见高电子密度阳性反应。结论 水通道蛋白-4存在于分离的大鼠肺泡II型细胞膜上,对呼吸系统水转运可能起到重要作用。     

大鼠前庭上皮钠通道的表达

目的研究大鼠前庭组织中上皮钠通道α、β、γ亚基的表达及其意义。方法用兔抗大鼠上皮钠通道α、β和γ亚基的多克隆抗体,采用免疫组化SP法观察大鼠半规管、椭圆囊及球囊组织中α、β、y-ENαC的表达模式。结果在大鼠前庭组织中,α、β、γ亚基较一致地分布于椭圆囊斑、球囊斑和壶腹嵴的上皮细胞胞膜和基质细胞,而α亚基在壶腹嵴基质细胞的表达稍弱。结论ENαC的各个亚基分布于前庭的各个区域,形成功能性通道参与内耳内淋巴的调节,从而保持内耳内环境的稳定。     

肿瘤坏死因子-α通过激活A549细胞Wnt/β-catenin通路降低肺泡液体清除功能

目的 探讨炎症环境下Wnt/β-catenin通路对肺泡液体清除功能的影响。方法 用不同浓度(10、40、80、160 ng·mL^-1)肿瘤坏死因子-α(TNF-α)处理人肺泡上皮Ⅱ型细胞(A549)24 h,采用CCK-8法检测细胞存活率,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测炎性因子白介素(IL)-1β、IL-18、IL-6表达水平,Western blot检测钠水转运蛋白上皮细胞钠通道β亚型(βENaC)、NA⁺、K⁺-ATP酶(NKA)和水通道蛋白(AQP)4的表达,综合实验结果选取TNF-α最佳干预浓度;然后A549分为control组、TNF-α 40 ng·mL^-1组、Wnt通路抑制组(TNF-α+XAV939组),分别检测细胞存活率、凋亡率、炎性因子表达水平及β-连环蛋白(β-catenin)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、腺瘤息肉病基因蛋白(APC)、βENaC、NKA和AQP4的表达水平。结果 自TNF-α的40 ng·mL^-1起,A549细胞存活率逐...     

大鼠油酸性急性肺损伤初期水通道蛋白4在肺水代谢的实验研究

目的 测定油酸造成急性肺损伤(ALI)初期损伤程度及肺泡Ⅱ型上皮细胞(ATⅡ)上水通道蛋白4(AQP-4)的表达量以评估病理状态下ATⅡ细胞水通道水转运能力的状况.方法 血气分析、观察肺组织病理学、用重力法测定血管外肺水(EVLW)含量检测早期肺损伤的程度;急性分离纯化大鼠油酸ALI模型的ATⅡ细胞,显微镜及电子显微镜观察形态病理变化:免疫组化了解肺组织AQP-4的表达,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测肺泡Ⅱ型上皮细胞AQP-4的m-RNA表达的情况.结果 血气分析、光镜下肺损伤评分及EVLW油酸组严重程度显著高于对照组,显微镜下肺泡Ⅱ型上皮细胞的数量较对照组无明显减少,但电镜下细胞的超微结构改变,板层小体排空,线粒体损伤等改变;肺组织免疫组化观察到AQP-4明显表达增强,肺泡Ⅱ型上皮细胞AQP-4的m-RNA表达增多,AQP-4由胞浆向胞膜转运,胞膜的表达增多(P<0.05).结论 在肺损伤初期就有了肺损伤水肿的病理生理的改变,AQP-4在肺泡Ⅱ型上皮细胞上m-RNA及细胞膜的表达上调.很大程度调节肺泡腔及肺泡上皮细胞的水转运,在钠通道功能下降的情况下发挥了重要的代偿作用.     

油酸肺损伤时肺泡Ⅱ型细胞钠转运功能的变化

目的 观察油酸肺损伤模型中肺泡Ⅱ型上皮细胞钠主动转运功能的改变。方法 建立大鼠油酸急性呼吸窘迫综合征（ARDS）模型后,分离纯化肺泡Ⅱ型上皮细胞,利用膜片钳全细胞记录模式研究钠转运功能状态以及B2受体激动剂特布他林对其的影响。结果 ARDS大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞钠主动转运功能明显减弱。但是特布他林可以使全细胞钠转运增加。结论 ARDS时肺泡上皮细胞钠主动转运功能仍然存在,但较正常时明显减弱;而特布他林仍可增加上皮钠转运。     

γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、转化生长因子β1在吸烟大鼠肺组织中的表达

目的 观察不同吸烟时间大鼠支气管上皮细胞、肺泡巨噬细胞和肺组织中γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)和转化生长因子-β1(TGF-β1)mRNA及其蛋白的表达水平以及二者的相关性,探讨TGF-β1在吸烟所致慢性阻塞性肺疾病(COPD)氧化/抗氧化失衡中的作用.方法 自制大鼠实验性被动吸烟装置,建立吸烟引起COPD的动物模型,将40只大鼠随机分为不吸烟组、吸烟1月组、吸烟2月组、吸烟3月组,每组各10只.分别采用免疫组织化学法、免疫细胞化学法和原位杂交半定量技术检测支气管上皮细胞及肺泡巨噬细胞中γ-GCSh(重链亚单位)和TGF-131 mRNA及其蛋白的表达水平.逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测肺组织匀浆中γ-GCSh和TGF-β1 mRNA的表达水平.结果 吸烟3月组大鼠出现了肺气肿的病理改变.①吸烟1月、2月和3月组大鼠支气管上皮细胞γ-GCSh和TGF-β1 mRNA及蛋白表达水平、肺泡巨噬细胞γ-GCSh和TGF-β1蛋白表达水平明显高于不吸烟组(均P<0.01).②吸烟1月、2月和3月组大鼠肺组织匀浆中γ-GC-Sh和TGF-β1 mRNA表达水平明显高于不吸烟组(均P<0.05).③吸烟1月组和吸烟3月组大鼠支气管上皮细胞γ-GCShmRNA及其蛋白的表达水平与TGF-β1表达水平呈直线正相关,肺泡巨噬细胞γ-GCSh蛋白表达水平与TGF-β1表达呈直线正相关;吸烟3月组肺组织匀浆中γ-GCSh mRNA表达水平与TGF-β1表达呈直线正相关. 结论 随着吸烟时间的延长,支气管肺组织中γ-GCS和TGF-β1的mRNA及其蛋白表达水平逐渐增高,并且二者呈正相关;提示TGF-β1在吸烟所致COPD氧化/抗氧化失衡中可能发挥一定的作用.     

硫化氢中毒对大鼠肺钠水主动转运功能的影响

目的:观察硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)中毒对大鼠肺钠水主动转运功能的影响,并探讨其机制?方法:SD大鼠充分暴露于亚致命浓度(300 ppm)的H2S气体3 h,分别于暴露后6?12?24 h检测大鼠肺泡液体清除率(alveolar fluid clearance,AFC)和肺干湿比,光镜下观察肺组织HE染色,透射电镜下观察Ⅱ型肺泡上皮细胞的改变,real-time PCR检测肺组织α-上皮钠通道(epithelial sodium channel,ENaC)mRNA的表达,Western blot检测肺组织α-ENaC以及ERK1/2的蛋白表达?结果:SD大鼠暴露于H2S后,与对照组比较,AFC明显下降,在暴露后6 h最低;肺含水量在暴露后6 h最高,并在12 h恢复至正常水平;光镜下,暴露后24 h大鼠肺组织出现明显损伤性改变;大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞在暴露后出现线粒体脊断裂?板层小体崩解;大鼠肺组织中α-ENaC mRNA 在暴露后6 h表达增多,在12 h恢复至正常水平;α-ENaC的蛋白表达与对照组相比,则在暴露后6 h明显降低;大鼠肺组织ERK1/2磷酸化水平在暴露后6 h显著增高?结论:硫化氢中毒降低了大鼠AFC,其机制可能是下调了α-ENaC的表达,并且ERK1/2信号通路的激活可能参与了整个损伤过程?     

ARDS大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离纯化及电镜下特征

目的观察急性呼吸窘迫综合征(ARDS)大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞超微结构的改变。方法建立大鼠油酸性ARDS模型,对其肺泡Ⅱ型上皮细胞进行分离、纯化,电镜鉴定并观察其超微结构的变化。结果电镜下ARDS大鼠Ⅱ型上皮细胞胞浆内板层小体排空明显而致空泡化,细胞分离后IgG免疫黏附方法纯化可使纯度提高15%。结论先分离纯化细胞再进行电镜观察更易观察到Ⅱ型细胞的形态学改变,从板层小体的变化最为突出可观察到肺泡Ⅱ型上皮细胞在ARDS中的重要作用。     

急性呼吸窘迫综合征大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的超微结构观察

目的观察急性呼吸窘迫综合征(ARDS)大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的超微结构。方法建立大鼠油酸性ARDS模型,对其肺泡Ⅱ型上皮细胞进行分离、纯化,电镜鉴定并观察超微结构的变化。结果电镜下ARDS大鼠Ⅱ型上皮细胞胞质内板层小体排空明显而致空泡化。结论分离纯化细胞后更易观察到Ⅱ型细胞的形态学改变,板层小体的变化最为突出提示肺泡Ⅱ型上皮细胞在ARDS中可能起重要作用。     

肺泡上皮钠水主动转运功能的分子基础研究

肺泡上皮由Ⅰ型细胞和Ⅱ型细胞组成。Ⅰ型细胞构成肺泡壁 ,数量较少只有Ⅱ型细胞的一半 ,但却覆盖着肺泡总面积的 95 %。肺泡上皮细胞除了参与气体交换外 ,还具有主动转运钠水的能力。肺泡上皮细胞转运系统由上皮细胞上的钠通道 (epithelialsodiumchannel,ENaC)、Na+ K+ ATP酶 (Na ,K adenosinetriphosphatase ,NKA)、水通道 (aquaporin ,AQP)组成 ,即由肺泡上皮Ⅰ型和Ⅱ型细胞的肺泡腔侧钠通道摄取Na+ ,然后经基底侧表面的NKA将Na+ 泵至肺间质 ;由于NKA将Na+ 泵至细胞外 ,在细胞内造成了显著的电化学梯度 ,利于Na+ 通过细胞膜…     

肺纤维化形成过程中肺泡Ⅱ型上皮细胞对肺成纤维细胞的影响及相关机制的探讨

目的:探讨肺间质纤维化形成过程中肺泡Ⅱ型上皮细胞对肺成纤维细胞FSP1,TGF-β,HGFmRNA表达的影响和调控作用机制.方法:28只SD大鼠随机分为平阳霉素组和生理盐水组,平阳霉素组气管内给药复制大鼠肺纤维化动物模型,生理盐水组气管内注射等量生理盐水.分别于7,28天各处死平阳霉素组大鼠10只,生理盐水组大鼠4只,其中平阳霉素组3只及生理盐水组3只提取肺泡Ⅱ型上皮细胞,平阳霉素组6只提取肺成纤维细胞,分别进行培养.至2种细胞到亚汇合状态时,实验组即:用平阳霉素组肺泡Ⅱ型上皮细胞上清液培养平阳霉素组肺成纤维细胞48h;对照组即:用生理盐水组肺泡Ⅱ型上皮细胞上清液培养平阳霉素组肺成纤维细胞48h,然后用半定量RT-PCR法检测肺成纤维细胞FSP1,TGF-β,HGFmRNA表达量的变化.平阳霉素组及生理盐水组各余1只用作HE染色.结果:(1)实验组7天,28天FSP1mRNA,TGF-βmRNA,HGFmRNA表达均高于对照组(P＜0.01),(2)第7,28天实验组FSP1mRNA,TGF-βmRNA表达无明显差别(P＞0.05),实验组28天HGFmRNA表达高于第7天(P＜0.01).结论:平阳霉素诱导的肺纤维化大鼠的肺泡Ⅱ型上皮细胞能够促进肺成纤维细胞FSP1mRNA、TGF-βmRNA的表达,能够促进纤维化的进展.     

急性呼吸窘迫综合征大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的超微结构观察

目的 观察急性呼吸窘迫综合征(ARDS)大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的超微结构。方法 建立大鼠油酸性ARDS模型，对其肺泡Ⅱ型上皮细胞进行分离、纯化，电镜鉴定并观察超微结构的变化。结果 电镜下ARDS大鼠Ⅱ型上皮细胞胞质内板层小体排空明显而致空泡化。结论 分离纯化细胞后更易观察到Ⅱ型细胞的形态学改变，板层小体的变化最为突出提示肺泡Ⅱ型上皮细胞在ARDS中可能起重要作用。     

多巴胺对清醒血容量恒定大鼠肾上皮钠通道表达的影响

目的：研究多巴胺对清醒血容量恒定大鼠肾上皮钠通道(ENaC)表达的影响。方法：实验动物随机分为实验组(n=29)和对照组(n=16)。在维持大鼠清醒状态下,应用伺服控制系统维持其体液恒定,实验组大鼠经静脉给予左旋多巴(5 μg•kg^-1•min^-1),对照组大鼠给予等体积5%葡萄糖。在此期间,检测大鼠平均动脉压(MAP)、尿量、尿钠浓度及肾小球滤过率(GFR)。同时应用免疫印迹法检测肾组织ENaC 3个亚单位(αENaC、βENaC和γENaC)的表达。结果：与对照组比较,实验组在给予低剂量多巴胺后大鼠平均动脉压和肾小球滤过率无明显变化(P>0.05),但尿量及尿钠浓度明显增加(P<0.05)。多巴胺并不影响αENaC 和βENaC的表达,但下调γENaC的表达,与对照组比较差异有显著性(P<0.05)。结论：多巴胺在不影响血压及肾小球滤过率前提下能够引起持续的利钠利尿作用,其机制可能与其抑制γENaC表达有关。     

脂多糖下调过氧化物酶增殖体激活受体γ在大鼠原代肺泡Ⅱ型上皮细胞的表达

目的 观察脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作用下大鼠肺泡Ⅱ型上皮(type Ⅱ alveolar epithelial,AT-Ⅱ)细胞过氧化物酶增殖体激活受体γ(PPARγ)的表达变化情况.方法 通过酶消化分离和免疫黏附法纯化原代培养AT-Ⅱ细胞,并进行碱性磷酸酶、肺表面活性物质相关蛋白A(SP-A)和电镜鉴定.采用RT-PCR法检测细胞经LPS作用后PPARγ、TNF-α、SP-A mRNA的改变,Western blot法检测LPS作用后细胞PPARγ,表达,ELISA法检测TNF-α蛋白表达.结果 经碱性磷酸酶、SP-A和电镜鉴定,原代培养AT-Ⅱ细胞成功;在致炎因子LPS作用下,PPARγ,mRNA和蛋白表达均下降,这一变化伴随炎性因子TNF-α的升高.结论 在LPS作用下,AT-Ⅱ细胞内PPARγ表达降低,提示PPARγ参与炎症反应.     

自发性癫痫大鼠钠通道β1亚基DNA表达分析

目的:对照研究自发性癫痫大鼠(SER)和正常大鼠钠通道β1亚基外显子表达情况。方法:提取鼠尾DNA,根据β1亚基外显子设计引物,进行PCR反应,琼脂糖凝胶电泳检测反应产物。PCR反应产物试剂盒纯化,送基因公司测序。结果进行Blast比对。结果:SER钠通道β1亚基2-5外显子碱基序列与原序列的同源性为100%。结论:SER钠通道β1亚基2-5外显子表达与正常大鼠无差别。     

PI3K介导消退素D1上调脂多糖刺激的A549细胞钠离子通道

目的 研究促炎症消退介质消退素D1(resolvin D1,RvD1)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激的肺泡上皮A549细胞钠离子通道α亚基(epithelial sodium channel α-subunit,α-ENaC)和γ亚基(epithelial sodium channel-γ-subunit,γ-ENaC)蛋白表达的影响并探讨其机制.方法 不同时间点和不同剂量的LPS刺激A549细胞建立LPS刺激A549细胞模型.将A549细胞分为:空白对照组;LPS(1μg/ml)组;LPS+RvD1(100nmol/L)组;LPS+LY294002(10μmol/L)组.用Western blot检测A549细胞中α-ENaC和γ-ENaC蛋白表达及磷酸化的磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)水平.结果 LPS下调A549细胞α-ENaC和γ-ENaC蛋白表达,消退素D1抑制LPS对ENaC的下调作用,抑制LPS刺激的磷酸化PI3K.结论 消退素D1通过下调磷酸化PI3K,抑制LPS对A549细胞α-ENaC和γ-ENaC蛋白表达的下调作用.