青石棉诱导A549细胞ERK1/2及Elk1激活的研究

目的　研究细胞外信号调节蛋白在青石棉致肺部疾病的作用。方法　用Western免疫印迹、免疫沉淀等对石棉刺激A5 4 9细胞后细胞外信号调节蛋白及其下游Elk1蛋白磷酸化等进行了研究。结果　石棉刺激细胞后 ,磷酸化ERK1 2、Elk1等高表达 ,差异有显著性 (P <0 0 5 )。结论　ERK1 2、Elk1磷酸化可能参与青石棉的致病过程     

青石棉诱导A549细胞表达IL-8的研究

目的　研究青石棉纤维作用于A5 4 9细胞后IL 8蛋白和基因表达水平及酪氨酸激酶抑制剂PD980 5 9对IL 8表达的影响。方法　用定量RT PCR法测定青石棉诱导A5 4 9细胞后的IL 8mRNA水平 ;用免疫反应法测定A5 4 9细胞培养上清中IL 8蛋白水平。结果　不同浓度青石棉刺激A5 4 9细胞后 ,培养上清中IL- 8释放量明显增加 ,细胞中A5 4 9IL- 8mRNA表达显著上升 ,使用酪氨酸激酶抑制剂PD980 5 9可明显抑制IL- 8的蛋白及mRNA表达水平。结论　青石棉可诱导IL- 8的高表达 ,而这种表达可为PD980 5 9所抑制 ,提示IL -8的表达源于胞浆中MAPKs信号通路。     

青石棉诱导BEAS-2B细胞ERK1/2磷酸化表达的研究

目的 了解青石棉在致癌过程中引起信号转导蛋白变化的特点.方法 使用人呼吸道上皮细胞株（human bronchial epithelial cell line,BEAS-2B）体外培养,以终浓度100 μg/ml的青石棉和100nmoL/L表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）分别刺激BEAS-2B细胞30和120min,使用特异性抗磷酸化细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase,ERK1/2）、ERK激酶（ERK kinase,MEK1/2）和抗总ERK1/2、MEK1/2抗体进行Western免疫印迹,检测相应的蛋白表达水平.结果 青石棉刺激BEAS-2B细胞30 min后,可诱导磷酸化ERK1/2的快速高表达,且此高表达可持续至120 min,与对照组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）;EGF作为诱导磷酸化ERK1/2的阳性刺激物,在30和120 min两时段内均可诱导ERK1/2的激活,与对照组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）;任何时间段刺激BEAS-2B,在对照、青石棉和EGF组间,总ERK1/2表达差异无统计学意义（P＞0.05）.青石棉刺激BEAS-2B细胞30、120 min后,可诱导磷酸化MEK1/2的快速高表达,与对照组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 青石棉可快速诱导BEAS细胞产生磷酸化ERK1/2、MEK1/2蛋白的高表达,提示MAPKs参与了青石棉所致疾病的过程.     

温石棉对A549细胞细胞色素P4501A1和谷胱甘肽S转移酶活性的影响

目的：探讨温石棉对体外培养细胞中外源性化合物代谢酶活性的影响。方法：采用不同剂量的UICC温石棉（UC）和国产茫崖温石棉（MC）分别作用于A549细胞,测A549细胞中细胞色素P4501A1（CYPA1）和谷胱甘肽S转移酶（GST）活性,并用苯并（a)芘对酶活性进行诱导,再测定温石棉对2种酶诱导活性的影响。结果：UC与A549细胞作用24h,乙氧基异酚恶唑－O－去乙基酶（EROD）活性随剂量增加呈缓慢递趋势,200mg/L UC可使EROD活性升高40％,但200mg/L UC作用48h则使其活性下降32％,提示UC对A549细胞EROD活性的影响呈现低剂量短时间诱导,而高剂量长时间抑制的趋势,MC对EROD活性的影响呈现多向性,无论作用24h还是48h,25mg/L UC作用48h则使其活性下降32％,提示UC对A549细胞EROD活性的影响呈现低剂量短时间诱导,而高剂量长时间抑制的趋势,MC对EROD活性的影响呈现多向性,无论作用24h还是48h,25mg/L的MC诱导作用最强（分别为对照组的1．86和1．28倍）,但随MC剂量增大和作用时间延长,EROD活性也随之下降,最低仅为对照组的35％,UC作用对GST的影响不明显,最高仅使GST活性升高20％,MC在25mg/L时驿GST的诱导最强,为对照组的1．4倍,但随着剂量的增加,对GST活性的上诱导转为抑制,200mg/L时GST活性下降了18．7％,先用温石棉与A549细胞作用24h,再加入苯并(a)芘对酶活性进行诱导,发现无论是UC还是MC,均未对苯并(a)芘诱导的EROD活性产生明显影响。但200mg/L的UC和100mg/L的MC均可增加GST的诱导活性。结论：不同剂量温石析对EROD和GST活性表现出不同的效应,其原因可能与2种温石棉的物理化学特性及表面活性有关。     

青石棉诱导呼吸道上皮BEAS-2B细胞表达白细胞介素-8的研究

目的研究青石棉纤维作用于呼吸道上皮BEAS-2B细胞后白细胞介素-8(IL-8)蛋白和基因的表达水平及酪氨酸激酶抑制剂PD98059对IL-8表达的影响。方法用定量聚合酶链反应法测定青石棉纤维诱导BEAS-2B细胞后的IL-8mRNA水平;用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定BEAS-2B细胞培养上清液中IL-8蛋白水平。结果不同浓度青石棉刺激BEAS-2B细胞后,细胞培养上清液中IL-8释放量明显增加,同样BEAS-2B细胞中IL-8mRNA表达显著上升,使用酪氨酸激酶抑制剂PD98059可明显抑制IL-8的蛋白及mRNA表达水平。结论青石棉可诱导IL-8的高表达,而这种表达可为PD98059所抑制,提示IL-8的表达受丝裂原活化蛋白激酶信号通路中磷酸化ERK蛋白表达的控制。     

青石棉诱导小鼠胃肠道肿瘤的实验研究

石棉可诱发肺癌和间皮瘤已得到国内外学者的公认 ,但与胃肠道肿瘤的关系却未达成共识。云南大姚县部分地区因青石棉暴露造成空气、水的污染 ,居民患肺癌和间皮瘤的危险明显增高 ,但消化道肿瘤的差异却未能显示出来。为了探讨石棉污染水源是否能诱发胃肠道肿瘤发病率增高 ,我们采用小鼠灌饲石棉的方法进行了观察 ,结果报道如下。一、材料与方法1.材料 :选用云南大姚青石棉 ,经高速粉碎机粉碎 ,纤维长度 :<5 μｍ :36 .1%、5～ 2 0 μｍ :5 7.5 %、>2 0 μｍ :6 .4% ;纤维直径均 <3μｍ。华西医科大学动物中心提供的昆明种 4周龄健康小鼠雌雄…     

姜黄素对H2O2诱导A549细胞氧化损伤的保护作用及机制研究

目的 探究姜黄素对H2O2诱导A549细胞氧化损伤的保护作用及其作用机制。方法 使用不同浓度的H2O2对A549细胞进行不同时长的刺激,使用CCK-8法筛选A549细胞存活率约为50%时的H2O2浓度及刺激时间作为建模条件;通过Hoechst 33258染色及Western blot对模型进行验证;实验分为模型组（Model）、VC组（VC）和姜黄素组（CCM）;采用流式细胞术对细胞凋亡情况进行检测,采用Western blot法对凋亡及氧化应激信号通路相关蛋白进行检测。结果 CCK-8实验结果显示,采用600μmol/L的H2O2对A549细胞进行24h刺激,其存活率为56.45±5.33%,Hoechst 33258染色及Western blot结果证实了模型的可靠性。流式细胞术结果显示,VC组和CCM组细胞的凋亡率与Model组相比均降低（P＜0.05,P＜0.01）,且CCM组降低更加明显（P＜0.01）。Western blot结果显示,与Model组相比,VC组和CCM组Bax、Caspase-3和Keap1表达降低,Bcl-2和Nrf2表达升高,且CCM组较VC组改变更加明显,差异均有统计学意义（P＜0.01）。结论 姜黄素对H2O2诱导的A549细胞急性损伤具有保护作用,可能与其激活Keap1-Nrf2/ARE信号通路,抑制细胞凋亡有关。     

青石棉诱导AL细胞CD59基因突变和DNA氧化损伤的研究

目的　研究谷胱甘肽合成酶抑制剂buthioninesulfoximine(BSO)和自由基清除剂二甲亚砜 (DMSO)对青石棉诱导人鼠杂交瘤 (AL)细胞CD59基因突变率的影响以及青石棉引发细胞内 8 羟基脱氧鸟苷 (8 OHdG)产生的规律。方法　细胞毒性、遗传毒性检测分别采用克隆法 ;8 OHdG检测采用ABC酶免疫染色法 ;非蛋白巯基化合物 (NPSH)检测采用改进后的Tietze法。结果　 2 5μmol/LBSO预处理AL 细胞 2 4h后的细胞内NPSH含量降为 2nmol/ 10 7细胞 ,仅为对照组的 5%。青石棉单独处理组AL 细胞CD59基因突变率为 2 0 8± 18。BSO预处理 2 4h后与青石棉继续共同孵育组细胞突变率可达到 3 97± 55,是青石棉单独处理组的 2倍左右 ,差异有显著性 (P <0 .0 5) ;而DMSO存在时 ,青石棉诱导的CD59基因突变率仅为 57± 8,比青石棉单独处理组降低 72 .6%。细胞内 8 OHdG的产生随着青石棉处理剂量的增加而线性增加 (y =150 2 0x ,r =0 .962 1)。当青石棉处理剂量为 6μg/cm2 时 ,细胞内 8 OHdG含量由对照组的 13 7± 9提高到 2 89± 6,是对照组的 2倍以上。DMSO存在时 ,可使 6μg/cm2 石棉诱导的细胞内 8 OHdG含量由 2 89± 6降低到 170± 3。结论　自由基是青石棉诱导基因突变和DNA损伤过程中重要的调节物 ,具有剂量 -效应关系     

萝藦果壳多糖诱导人肺癌A549细胞凋亡的研究

目的 探究萝藦果壳多糖（MJP-1’）诱导人肺癌A549细胞凋亡的作用。方法 采用CCK8法检测萝藦果壳多糖对A549细胞活力的影响;采用比色法检测A549细胞内乳酸脱氢酶的释放量变化情况;通过TUNEL实验探究萝藦果壳多糖对A549细胞凋亡的影响;通过JC - 1荧光探针探究萝藦果壳多糖对A549细胞线粒体膜电位的影响;通过蛋白质分子印迹法探究萝藦果壳多糖作用后A549细胞凋亡相关蛋白表达的变化。结果 CCK8法显示萝藦果壳多糖抑制A549细胞的增殖,并呈剂量依赖趋势（125 μg/ml组:t = 3.092,P = 0.015;250 μg/ml组:t = 3.929,P = 0.004;500 μg/ml组:t = 5.626,P＜0.001;1 000 μg/ml组:t = 7.512,P＜0.001;2 000 μg/ml组:t = 9.677,P＜0.001;4 000 μg/ml组:t = 12.290,P＜0.001;8 000 μg/ml组:t = 16.000,P＜0.001）;比色法显示A549细胞乳酸脱氢酶释放量增加（2 mg/ml组:t = 8.233,P = 0.001;4 mg/ml组:t = 12.640,P＜0.001;8 mg/ml组:t = 27.530,P＜0.001）;TUNEL实验显示萝藦果壳多糖可促进A549细胞凋亡（2 mg/ml组:t = 7.803,P＜0.001;4 mg/ml组:t = 12.460,P＜0.001;8 mg/ml组:t = 39.340,P＜0.001）;JC - 1探针实验结果显示萝藦果壳多糖导致A549细胞线粒体膜电位降低（2 mg/ml组:t = 24.120,P＜0.001;4 mg/ml组:t = 28.530,P＜0.001;8 mg/ml组:t = 31.600,P＜0.001）;蛋白质分子印迹法结果显示萝藦果壳多糖可以下调Bcl - 2蛋白表达（2 mg/ml组:t = 3.790,P = 0.019;4 mg/ml组:t = 6.598,P = 0.003;8 mg/ml组:t = 12.840,P＜0.001）,并使Bax、cleaved - caspase - 3蛋白表达增加（Bax组:2 mg/ml组:t = 17.280,P＜0.001;4 mg/ml组:t = 36.040,P＜0.001;8 mg/ml组:t = 22.520,P＜0.001;cleaved - caspase - 3组:2 mg/ml组:t = 6.487,P = 0.003;4 mg/ml组:t = 9.326,P＜0.001;8 mg/ml组:t = 22.380,P＜0.001）。结论 本研究发现萝藦果壳多糖可以诱导人肺癌A549细胞凋亡,为进一步开发利用萝藦果壳多糖奠定了基础。     

脂多糖促进肺癌A549细胞表达HMGB1

目的 探讨脂多糖（LPS）促进肺癌A549细胞表达高迁移率族蛋白B1（HMGB1）机制及意义。方法 体外培养肺癌A549细胞,分组：A组（对照组）,B组（100 ng/ml LPS）,C组（150 ng/ml LPS）,D组（200ng/ml LPS）,培养12 h、24 h、48 h、72 h后,Western blot检测肺癌A549细胞HMGB1蛋白表达,ELISA检测细胞上清液HMGB1浓度。结果 Western blot、ELISA检测示HMGBl蛋白表达及浓度在A、B、C、D四组中逐渐增强（P〈0.05）;培养12 h、24 h、48 h、72 h有显著差异（P〈0.05）。结论 LPS促进肺癌A549细胞表达HMGB1,有时间-量效关系,为临床防治肺癌提供了新思维。     

香烟烟雾对A549与A549-R细胞的氧化损伤

目的探讨hOGG1基因低表达对香烟烟雾作用下细胞氧化损伤效应的影响。方法不同浓度香烟烟雾暴露A549细胞和hOGG1基因低表达的A549-R细胞,MTT实验检测两种细胞存活率,彗星实验观察两种细胞DNA损伤,荧光法测定两种细胞内活性氧(ROS)含量,高效液相色谱-电化学法(HPLC-ECD)检测细胞基因组DNA中8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)的含量。结果随着香烟烟雾暴露浓度的增加,两种细胞的存活率均下降,且A549-R细胞IC50显著小于A549细胞,差异有统计学意义(P<0.05);两种细胞ROS生成量与香烟烟雾浓度呈剂量-效应关系,当香烟烟雾浓度≥1.25支/升时,A549-R细胞ROS含量显著高于A549细胞(P<0.05);不同香烟烟雾浓度下,A549-R细胞拖尾率、尾长、OTM值均大于A549细胞,差异有统计学意义(P<0.05);A549细胞与A549-R细胞基因组DNA8-OHdG含量随香烟烟雾浓度的增加而升高,当香烟烟雾浓度为2.5支/升和5支/升时,A549-R细胞8-OHdG含量显著高于A549细胞(P<0.05)。结论香烟烟雾可导致A549细胞与A549-R细胞的氧化损伤,hOGG1基因低表达可增加A549-R细胞对香烟烟雾引起的氧化损伤的敏感性。     

青蒿琥酯联合热疗诱导肺腺癌A549细胞凋亡作用

目的 探讨青蒿琥酯联合热疗诱导肺腺癌A549细胞凋亡的线粒体途径作用机制。方法 150μmol/L青蒿琥酯、青蒿琥酯联合热疗(43℃,1h)作用A549细胞24h,流式细胞技术检测细胞周期和凋亡率情况。荧光显微镜观察线粒体膜电位变化。免疫组化、western blot检测细胞色素c、Bcl-2和caspase-3表达,CaspACETM检测试剂盒检测活性caspase-3表达。结果 青蒿琥酯、青蒿琥酯联合热疗作用A549细胞24h后,G0/G1期细胞数增多,S期和G2/M期细胞数减少(P<0.01);凋亡率分别是16.77%和28.90%(P<0.01)。线粒体膜电位下降率分别为18.05%,50.98%(P<0.01)。细胞色素c蛋白、caspase-3表达增加而Bcl-2蛋白表达减少(P<0.01)。活性caspase-3蛋白水平增加A值分别为0.2641±0.0027,0.3613±0.0019,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 青蒿琥酯、青蒿琥酯联合热疗可诱导肺腺癌A549细胞凋亡,激活线粒体途径可能是诱导凋亡重要作用机制。     

构建siRNA慢病毒载体抑制A549细胞株VEGF受体KDR基因的表达

目的构建针对血管内皮生长因子(VEGF)受体KDR基因的siRNA慢病毒载体,鉴定其对肺癌细胞株A549基因干扰效果。方法设计合成针对KDR编码区的三条siRNA序列及阴性对照序列,克隆到PGCL-GFP载体,构建重组质粒,行PCR鉴定、DNA测序分析;转染人肺癌细胞株A549,Real-Time PCR及Western blot分别检测KDR mRNA、蛋白水平变化;细胞计数法绘制细胞生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期。结果成功构建pGCL/KDR-siRNA重组质粒。A549干扰组KDR mRNA表达率下降,KDR蛋白表达量明显减少,细胞周期改变。结论构建的pGCL/KDR-siRNA表达载体可在mRNA和蛋白水平上有效抑制A549细胞株KDR基因的表达。     

顺铂对A549细胞DNA修复酶MGMT和DNA-PKcs表达的影响

[目的]探讨在DNA损伤剂顺铂作用下，A549细胞内DNA修复基因六氧甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)和DNA依赖的蛋白激酶复合物催化亚单位(DNA-PKcs)的表达变化。[方法]MTT法分析顺铂对A549细胞生存力的影响；彗星实验研究顺铂对DNA损伤的程度；RT-PCR分析不同顺铂作用时问修复酶mRNA水平的变化。[结果]顺铂对A549细胞的生长有明显的抑制作用，且为剂量依赖性。低浓度(IC20剂量)顺铂作用下，DNA损伤程度的变化与作用时间成正比，且伴随MGMT和DNA-PKcs的表达上升。停止作用后，DNA损伤程度减轻，修复基因的表达也逐渐恢复至正常水平。[结论]短期顺铂染毒所导致的急性DNA损伤对MGMT和DNA-PKcs的表达有明显的正性诱导作用。     

抗菌肽merecidin通过ERK/mTOR 信号通路对肺癌A549细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响

目的 探讨抗菌肽merecidin通过ERK/mTOR 信号通路对肺癌A549细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响。方法 实验分为对照组Control、抗菌肽Merecidin干预组和雷帕霉素Rapamycin干预组。通过CCK-8 法检测A549细胞的增殖能力,通过流式细胞术检测A549细胞凋亡和周期,通过平板划痕试验和Transwell检测A549细胞的迁移和侵袭能力,通过 Western blot 法检测A549细胞中MAPK1、MEK2、mTOR、PRAS40、EIF4EBP1 磷酸化蛋白的表达量。结果 抗菌肽merecidin能够明显抑制A549的增殖能力,处理24 h后的 IC50值为10.01 μmol /L(P<0.05)。与control组比较,抗菌肽merecidin处理后促进细胞凋亡(P<0.05),阻滞细胞周期于S期(P<0.05),细胞的迁移及侵袭能力均降低(P<0.05)。同时抗菌肽merecidin可抑制p-MAPK1和p-MEK2蛋白的表达,并且降低了mTOR、PRAS40和EIF4EBP1 的磷酸化水平(P<0.05)。结论 抗菌肽merecidin可抑制肺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡,阻滞细胞周期于S期,该作用可能与其抑制ERK/mTOR通路有关。     

百草枯对A549细胞中解整合素-金属蛋白酶17表达的影响

目的构建体外百草枯（paraquat,PQ）细胞纤维化模型,观察PQ对A549细胞中解整合素-金属蛋白酶17（ADAM17）表达的影响,探讨ADAM17在PQ中毒致肺纤维化中的作用。方法体外培养A549细胞,分为正常对照组、不同浓度PQ组,应用CCK-8检测细胞活力,筛选PQ浓度和时间,显微镜下观察细胞形态,ELISA测定各组纤维化标志物I型胶原（type I collagen,Col I）和纤连蛋白（fibronectin,FN）的表达,建立细胞纤维化模型;免疫细胞化学检测A549细胞中ADAM17的分布情况,RT-PCR和Western blot分别半定量检测ADAM17 mRNA及蛋白水平的表达情况。结果（1）随着PQ浓度增加及作用时间延长,A549细胞活力呈下降趋势,差异有统计学意义（P〈0.05）,呈剂量依赖性和时间依赖性。（2）正常的A549细胞融合呈铺路石样生长,排列比较紧密,经PQ诱导后细胞排列较松散,细胞间连接变疏松,部分细胞溶解、死亡。（3）ELISA显示,随PQ浓度增加,Col I和FN表达增强,差异有统计学意义（P〈0.05）;随PQ时间延长,Col I和FN表达也逐渐增强,差异有统计学意义（P〈0.05）,成功建立PQ细胞纤维化模型。（4）免疫细胞化学显示,ADAM17在A549细胞胞浆表达。（5）RT-PCR和Western blot表明,随着PQ浓度增加,ADAM17 mRNA及蛋白水平表达明显增加,差异有统计学意义（P〈0.05）,以PQ 200 umol/L时最为明显。随着PQ作用时间延长,ADAM17 mRNA及蛋白表达水平也明显增加,差异有统计学意义（P〈0.05）,在24 h达到高峰。结论百草枯可引起肺泡上皮细胞形态学改变,导致细胞损伤,成功建立细胞的纤维化模型,对A549细胞的毒性作用具有剂量和时间依赖性。ADAM17在PQ诱导的A549细胞中过表达,可能参与了百草枯诱导的肺纤维化过程。