疟疾的实时荧光PCR快速检测方法

目的:建立疟疾的实时荧光PCR检测方法并用于疟疾的快速检测。方法:设计了疟原虫通用型实时荧光PCR检测的引物和探针,建立了疟疾的实时荧光PCR检测方法。对40份疟疾镜检阳性样本和20份镜检阴性样本进行实时荧光PCR检测,并和巢式PCR方法检测结果进行了比较。结果:疟疾实时荧光PCR检测速度快,20分钟即可完成。40份镜检阳性样本的荧光PCR检测均为阳性,2份样本的巢式PCR结果为阴性;20份镜检阴性样本中有3份样本为实时荧光PCR阳性,其余17份样本为实时荧光PCR阴性,与疟疾巢式PCR检测结果相同。结论:该实时荧光PCR方法检测速度快,特异性强,准确性高,阳性率高,不易漏检,适用于疟疾的快速检验,这对防止该病在国境口岸的传入提供了技术依据。     

单细胞五重巢式PCR检测DMD基因

目的:探索建立单细胞多重巢式PCR检测杜氏肌营养不良症(DMD)基因外显子17、19、44、45、48的技术,及应用于植入前遗传学诊断(PGD)的前景。方法;获取正常男性单个淋巴细胞和无DMD家族史的单个胚胎细胞,行DMD基因外显子17、19、44、45、48的五重巢式PCR,分析扩增成功率、假阳性率和假阴性率。结果:20个单个淋巴细胞5个外显子扩增成功率为97％(97/100)、假阳性率为4％(1/25)、假阴性率为0％(0/25),20个单个胚胎细胞5个外显子扩增成功率为80％(80/100)、假阳性率为0％(0/25)。结论:本文建立的单细胞DMD基因外显子17、19、44、45、48的五重巢式PCR技术具有较高扩增成功率和特异性,应用于DMD的PGD具有现实的可能性。     

3种检测方法在疟疾实验室诊断中的比较分析

目的比较3种实验室检测方法在疟疾诊断中的优缺点,为疟疾诊断提供参考依据。方法分别采用镜检、快速诊断试剂和巢氏PCR 3种检测方法对收集到的222份疟疾样本进行检测,并对检测方法及结果进行比较分析。结果综合3种检测方法,222份疟疾样本最终确诊220例,阳性率为99.10%,其中镜检阳性率为93.24%,快速诊断试剂检测阳性率为94.59%,巢氏PCR检测阳性率为96.40%。以最终诊断结果为金标准,镜检、快速诊断试剂和巢式PCR灵敏度分别为94.09%,95.45%,97.27%。结论镜检、快速诊断试剂和巢氏PCR 3种检测方法各有优缺点,建议三者结合起来提高疟疾诊断的效率。     

巢式PCR在输入性疟疾诊断和分型中的应用价值

目的评价巢式PCR方法用于输入性疟疾病例检测的应用价值。方法引用Snounou and Perandin F等人描述的引物,对本实验室所冻存标本进行巢式PCR检测,并与厚薄血膜显微镜镜检结果进行比较。结果两种方法结果差异有统计学意义,似然比χ2=21.801,P=0.010,且在分型上较厚薄血膜显微镜镜检方法容易被操作者接受。结论在当前应对输入性疟疾的特殊时期,采用巢式PCR对输入性疟疾进行实验室检测和分型,不仅可以作为显微镜检查的有效补充,并且能够发挥其灵敏度和特异性高的优势。     

2015年大连市疟疾病例实验室检测结果分析

目的:分析大连市疟疾病例实验室检测结果,为疟疾诊断方法的选择提供理论依据。方法 :收集2015年大连市疟疾患者的血片和血液样本,应用镜检,RDT和巢氏PCR(Nest-PCR)分别对血片和血样进行检测。结果:17份样品镜检检出恶性疟原虫10例,卵形疟原虫1例,阴性6例;RDT检出恶性疟原虫13例,共同抗原阳性者1例,阴性3例,与镜检结果一致率为82.4%(14/17);巢式PCR检出恶性疟原虫13例,阴性4例,与镜检结果一致率为82.4%(14/17),与RDT结果的一致率为94.1%(16/17)。结论:采用镜检和RDT联合应用的方法,能够提高检测的敏感性,巢式PCR可提高虫种鉴定的准确性。     

肉及肉制品中肠致病性大肠杆菌两重PCR检测方法的建立

目的　建立肉及肉制品中(EPEC)的快检方法。方法　以EPEC特异的微绒毛粘连基因(eaegene)和菌毛束形成编码基因(bfpgene)作为模板,设计两对引物对肉及肉制品中的EPEC进行特异性扩增。结果　该方法特异性好,对肉及肉制品中EPEC的最低检出量为10cfu g ,检出时间为8～17小时。结论　建立了可检测肉及肉制品中EPEC的快速、敏感、特异PCR方法。     

食品中志贺菌特异性二重PCR检测方法的研究

目的:建立二重PCR方法快速检测食品中的志贺菌(Shigella spp.)。方法:以侵袭性质粒抗原H基因ipaH和铁载体基因iuc为靶基因,筛选引物,建立二重PCR体系。对3株志贺菌和28株非志贺菌进行特异性检测。梯度稀释志贺菌基因组DNA,以不同稀释度DNA作PCR扩增。在孜然牛肉中以不同菌量人工污染,不同增菌时间培养,提取DNA进行PCR扩增。应用该方法检测实际样品。结果:以ipaH、iuc为靶基因的2对引物对志贺菌的检出有很好的特异性。PCR检测的灵敏度在DNA水平上达到78.73 pg。人工污染样品,当起始污染量为0.56 cfu/g时,37℃增菌培养10 h即可检出。一共检测了18份样品,未检出志贺菌,与传统方法一致。利用该方法检测了一份盲样冻干样品,检出志贺菌,与实际结果相符。结论:建立了适用于食品中志贺菌检测的特异灵敏二重PCR方法。     

西尼罗病毒PCR检测方法的建立

[目的]应用通用引物建立快速、敏感、特异的PCR检测方法,用于西尼罗病毒感染相关疾病的实验室监测和早期诊断。[方法]以西尼罗病毒感染者血清分离得到的病毒RNA逆转录cDNA为检测样本,通过对多株病毒基因组序列各区段保守性进行分析比较,在基因组非编码区设计引物和探针,分别用巢式PCR和荧光定量PCR方法对样本进行扩增。[结果]以西尼罗病毒RNA逆转录cDNA为模板,采用所建立的两种PCR方法,均可得到阳性检测结果。[结论]本研究设计的PCR扩增引物具有较好的通用性;建立的实时荧光定量PCR结合巢式PCR用于检测WNV的分析方法具有互补性,为研制成熟的西尼罗病毒检测试剂盒提供实验基础。     

3种实验室检测方法在疟疾诊断中的应用比较

目的探讨3种实验室检测方法在疟疾诊断方面的应用价值。方法分别采用传统镜检法、Opti MAL法及巢式PCR法,对辽宁省2011-2013年的102份疟疾疑似病例血样进行检测。结果镜检法、Opti MAL法和PCR法阳性率分别为54.90%、63.73%和70.59%,三者两两比较,只有镜检法和PCR法差异有统计学意义(χ2=4.718,P=0.030)。3种方法中,PCR法的敏感性和特异性最好。结论镜检法结合Opti MAL法和PCR法会提高疟疾病例的诊断水平。     

狂犬病毒TaqMan PCR检测方法的建立

目的建立检测狂犬病毒（RV）核蛋白（N）基因片段的TaqMan PCR检测方法。方法针对RVN基因保守区域设计特异性引物与探针；优化检测体系中引物与探针的浓度；以体外转录的RV完整的N基因RNA作为定量分析模型；考核检测体系灵敏性、特异性、稳定性；初步用于RV的检测。结果引物和探针具有良好的特异性，使用浓度分别为0．6μmol／L和0．2μmol／L，可检测到2700个RNA拷贝数，较传统RT-PCR检测方法敏感性提高了10倍；同一样品Ct值重复检测5次，变异系数均〈5％，表明检测体系具有较好的稳定性；通过所建立的检测体系，绘制了以模板拷贝数为分析指标的RV定量检测标准曲线，对实验室内保存毒株的检测结果显示TaqMan PCR检测比普通PCR检测更快捷、敏感。结论所建立的RV TaqMan PCR可以用于RV的实验室检测，并且比普通PCR检测方法更灵敏、特异。     

复式PCR检测疟原虫的应用研究

[目的 ]建立适合于疟疾流行区现场应用的复式 PCR检测系统。 [方法 ]采用生理盐水处理样本 ,设计针对恶性疟原虫 (P.f) p BPK1- 14基因和间日疟原虫 (P.v)线粒体细胞色素 C氧化酶基因 CO 合成引物 ,混合一次扩增检测P.f 和 P.v。[结果 ]P.f 及 P.v模板分别被扩增出一条 2 10 bp和 370 bp的片段 ,与食蟹猴疟原虫 (P.c)、鼠伯氏疟原虫(P.b)及正常人白细胞无交叉 ,且可检测不同地理株的 P.f 和 P.v,P.f 和 P.v的敏感度分别为 5 .5× 10 - 7和 1.5×10 - 6 ,检测 146份疟区发热病人 ,与镜检结果相比 ,其敏感性和特异性 P.f为 97.9%和 98.7% ,P.v为 10 0 %和 98.7%。[结论 ]该复式 PCR检测系统适应于现场疟疾流行病学监测 ,防治效果考核 ,疑似疟疾病人的诊断及虫种鉴定。     

半套式PCR检测军团菌方法的建立及应用

目的建立检测军团菌的分子生物学方法。方法采用常规PCR对军团菌属16SrRNA编码区域和嗜肺军团菌巨噬细胞感染增强子(mip)基因编码区域进行扩增,同时采用半套式PCR对常规PCR的扩增结果进行确证。结果采用常规PCR对军团菌属16SrRNA编码区域进行扩增,5种军团菌(包括3种嗜肺军团菌)扩增产物均可见654bp的特异性扩增带,非军团菌菌株PCR结果为阴性,采用半套式PCR对常规PCR扩增产物进行验证,扩增产物均可见430bp扩增带;同时采用常规PCR对嗜肺军团菌mip基因编码区域进行扩增,3种嗜肺军团菌扩增产物均可见649bp扩增带,非嗜肺军团菌菌株均为阴性,采用半套式PCR对常规PCR扩增产物进行验证,3种嗜肺军团菌扩增产物均可见399bp扩增带。敏感性为10CFU/ml.并且应用此方法成功检测环境水样中分离的疑似军团菌菌株。结论半套式PCR经济、简便、快速、敏感、特异,为军团菌的早期检测、环境监测、控制暴发流行提供了有效手段。     

巢式PCR检测人乳头状瘤病毒的方法学建立及临床应用

目的建立巢式PCR(nPCR)检测人乳头状瘤病毒的方法学及作临床应用。方法以MY09/MY11为外引物,GP5+/GP6+为内引物建立nPCR,优化体系,评价其特异性和灵敏度,同时检测了54例HPV DNA阳性、4例弱阳性、42例阴性的标本,与基因导流杂交法作一致比较。结果检测到单一目的片段;最低能检测到1∶16 384稀释的HPV18阳性对照品,明显高于MY09/MY11方法;nPCR法检测到60例HPV DNA阳性标本,40例HPV DNA阴性的标本,与基因导流杂交法具有较好的一致性(χ2=39.518,P0.001;Kappa=0.628,P0.001)。结论所建立的nPCR具有较好的特异性和灵敏度,与基因导流杂交法具有较好一致性。     

综合医院分枝杆菌气溶胶采样及巢式PCR检测方法研究

目的:调查综合医院空气中分枝杆菌的污染状况。方法:于2010年7月选取广东省4家综合医院,采用Bio-Sampler生物冲击式采样器采集内科和儿科侯诊室的空气和集中空调系统送风气溶胶,巢式PCR扩增结核分枝杆菌复合群IS6110和分枝杆菌Hsp65基因,琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。结果:空气中结核分枝杆菌复合群的阳性率为10.2%(5/49);分枝杆菌的阳性率为26.5%(13/49)。内科侯诊室空气中结核分枝杆菌复合群和分枝杆菌的阳性率高于儿科侯诊室但差异无统计学意义。集中空调系统送风中结核分枝杆菌复合群的阳性率为11.4%(4/35)。结论:液体冲击式气溶胶采样器可用于采集分枝杆菌气溶胶,我国综合医院侯诊室空气和集中空调系统存在分枝杆菌包括结核分枝杆菌污染。     

四种食源性致病菌多重PCR检测方法的建立

目的建立一种多重PCR检测方法同时检测食品中沙门菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌。方法参考沙门菌侵袭蛋白A(invA)基因序列,志贺菌侵袭性质粒抗原(ipaH)基因序列,金黄色葡萄球菌引物设计参考耐热核酸酶(nuc)基因序列,单增李斯特菌引物设计参考溶血素蛋白(hly)基因序列设计引物,通过多重PCR对4种食源性致病菌的目的基因进行扩增,并对反应体系进行优化。结果对15株目标菌和17株非目标菌的检测未出现假阳性和假阴性结果,产物分子量与预期一致;4种菌的检测灵敏度分别至少达到10pg/μl;对产物的测序分析表明所得序列与目的基因序列吻合;对319份样品的检测结果显示,其中4份生鲜乳中检出金黄色葡萄球菌,1份生猪肉中检出沙门菌。结论该方法具有良好的检测特异性,可供食源性致病菌的快速检测。     

多重PCR特异检测布鲁氏菌方法的建立

目的建立一种快速检测布鲁氏菌的多重PCR方法,为临床快速检测、准确诊断布鲁氏菌提供依据。方法针对布鲁氏菌外膜蛋白31 kD、22 kD和2a基因,各设计一对引物,扩增片断大小分别为427 bp3、17 bp和830 bp。利用纯培养物和模拟标本,分析这3对引物的特异性和敏感性。结果3对引物均能特异扩增布鲁氏菌的DNA,31 kD、22 kD和2a,扩增纯培养物的敏感性分别为2.8×103、4.6×103和2.1×104cfu,将3对引物组合在一起建立了多重PCR方法,能从模拟的细胞和血液标本中扩增出特异的产物,对模拟的细胞感染标本的敏感性为1×105cfu,对模拟的血标本的敏感性为1.2×106cfu。结论针对外膜蛋白基因,建立了能特异地检测标本中布鲁氏菌的多重PCR检测方法。     

人副流感病毒HPIV多重RT—PCR快速检测方法的建立

目的建立快速检测人副流感病毒的多重PCR方法。方法通过查阅文献获取副流感病毒的PCR引物序列，并利用分子生物学软件对其进行评估，同时设计合成半巢式PCR引物。提取分离病毒的总RNA，以RNA抽提物为模板，一步法一次反转录扩增HPIV-1，2，3，4等4种型别的副流感病毒。以多重RT—PCR产物作为模板，用半巢式PCR进一步扩增确认。结果利用多重RT—PCR方法一次扩增出人副流感病毒的4个不同型别，条带大小分别是317、507、189和451bp，与目的片段大小一致；半巢式PCR扩增出相应的特异条带，条带大小分别是261、340、145和390bp，扩增结果与目的片段大小一致。结论人副流感病毒多重RT—PCR快速检测方法已初步建立。     

艾伯特埃希菌多重PCR检测方法的建立

目的 建立一种快速检测艾伯特埃希菌的多重PCR检测方法。方法 根据lysP和EA0134基因建立多重PCR反应体系,并对引物浓度、反应时间及温度等反应条件进行优化,同时评价其灵敏性和特异性。运用该方法对实验室分离的63株艾伯特埃希菌菌株及增菌液和非艾伯特增菌液进行了检测。 结果 两对引物均能特异性扩增相应的基因,其灵敏性均为25 CFU/反应(500 CFU/ml)且非常特异。对本实验分离的艾伯特埃希菌增菌液和非艾伯特埃希菌增菌液的检测结果与之前传统方法的一致。结论 本研究建立的多重PCR方法可用于艾伯特埃希菌的初步筛查和分离株的鉴定,为艾伯特埃希菌的快速鉴定和鉴别提供了一种新的检测方法。     

PCR快速检测猪链球菌2型方法的建立

目的建立一种快速、特异且敏感的猪链球菌菌型的检测方法。方法从疑似猪链球菌感染患者血液（抗凝血）中提取DNA为模板，并合成引物检测猪链球菌特异性16 Sr RNA基因片段、2型猪链球菌特异性荚膜多糖编码基因片段cps2J、溶菌酶释放相关蛋白编码基因片段mrp、细胞外蛋白因子编码基因片段ef。结果PCR扩增结果证实是猪链球菌2型。结论PCR反应体系是一种检测和鉴定猪链球菌2型的快速、特异且敏感的方法。