HBV基因组表达对I,Ⅲ型胶原转录的调控作用

目的 阐明肝炎后肝纤维化发生机制。方法 以ＨＢＶ基因组转染细胞和转基因小鼠为模型，应用原位杂交技术和斑点杂交技术，研究ＨＢＶ基因组的表达对Ｉ，Ⅲ型胶原ｍＲＮＡ含量的影响。结果 ＨＢＶ基因组的表达能量显著提高转染细胞内Ｉ，Ⅲ胶原ｍＲＮＡ的水平。结论 ＨＢＶ感染能促进Ｉ，Ⅲ型胶原的转录，诱导肝纤维化的发生。     

HBV基因组表达对TGFβ及其Ⅱ,Ⅲ型受体的转录调控作用

ＨＢＶ基因组表达对ＴＧＦβ及其Ⅱ、Ⅲ型受体的转录调控作用谭龙益，王皓，孔宪涛乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）感染是人类肝纤维化发生的主要病因之一［１，２］，其机理尚不清楚。ＴＧＦβ是目前已知具有强烈的促纤维化基质产生能力的细胞因子［３，４］，本文以ＨＢＶ基因组...     

肥大细胞对平滑肌源性泡沫细胞Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达的影响

目的　检测大鼠腹腔肥大细胞(mastcell,MC)对平滑肌源性泡沫细胞Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达的影响。方法　SD大鼠体重约2 0 0g ,雌雄不限,供采集MC和原代培养平滑肌细胞(smoothmusclecell,SMC)。采用梯度密度离心分离MC ,提取MC上清液(含MC释放的各种炎症介质)。用MC上清液和氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)处理SMC ,实验分四组:对照组SMC在5mL含10 %小牛血清的DMEM中培养4 8h ;oxLDL组SMC在5mL含10 %小牛血清的DMEM中(含oxLDL ,终浓度为10 0mg L)培养4 8h ;MC上清液组SMC在5mL含10 %小牛血清的MC上清液(由含1×10 6 个MC的细胞悬液提取)中培养4 8h ;MC上清液+ox LDL组SMC在5mL含10 %小牛血清的MC上清液(由含1×10 6 个MC的细胞悬液提取)中(含oxLDL ,终浓度为10 0mg L)培养4 8h。采用油红O染色检测SMC泡沫化。RT PCR检测SMCⅠ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA的表达,PCR引物序列Ⅰ型胶原为5′GACACTGAACCCTTTGTAATG 3′和5′GTGAAACTCCCGTCTGCT 3′,扩增片段长度为399bp ;Ⅲ型胶原引物序列为5′AGCGGAGAATACTGGGTT 3′和5′TGTAATGTTCTGGGAGGC 3′,扩增片段长度为2 88bp ;内参照采用βactin ,引物序列为5′GTGGGGCGCCCCAGGCACCA 3′和5′CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC 3′,扩增片段长度为5 4 8bp。免疫细胞化学染色检测SMCⅠ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白表达。结果　油红O染色显示MC上清液可加速SMC泡沫化。RT PCR结果发现,与对照组SMC相比,用oxLDL或MC上清液分别单独处理SMC 4 8h后,Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的mRNA表达均降低,用oxLDL和MC上清液同时处理SMC 4 8h后,Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的mRNA表达降低更明显。免疫细胞化学染色显示,对照组SMC细胞浆内有大量棕色颗粒,颗粒粗大而染色深,说明对照组Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的蛋白表达为强阳性;用oxLDL或MC上清液分别单独处理SMC 8h后,细胞浆内棕色颗粒少而染色浅,说明Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的蛋白表达均明显降低;用oxLDL和MC上清液同时处理SMC 4 8h后,Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的蛋白表达降低更明显。结论　MC在体外抑制SMCⅠ型胶原和Ⅲ型胶原表达,并且能协同oxLDL对Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达的抑制作用。因此MC释放的炎症介质也许参与了动脉粥样斑块纤维帽的重构。     

肥大细胞对平滑肌源性泡沫细胞Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达的影响

探讨大鼠腹腔肥大细胞对平滑肌源性泡沫细胞Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达的影响。用大鼠腹腔肥大细胞上清液和氧化型低密度脂蛋白处理平滑肌细胞48h后，逆转录聚合酶链反应检测平滑肌细胞Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA的表达，免疫细胞化学染色检测平滑肌细胞Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原蛋白的表达。结果发现，与对照组相比，处理组平滑肌细胞Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的mRNA表达降低，免疫细胞化学染色后，处理组细胞浆内棕色颗粒比对照组少且染色浅。结果提示，肥大细胞在体外抑制平滑肌细胞Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达，并且能协同氧化型低密度脂蛋白对Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达的抑制作用。肥大细胞释放的炎症介质可能参与了动脉粥样斑块纤维帽的重构。     

肝脏细胞胶原合成及其Ⅰ型胶原mRNA的稳定性

目的:为了明确贮脂细胞(Fat Storing Cell,FSC)和肝细胞(Hepatocyte,HC)在肝纤维化胶原合成中的作用.方法:本文在分离培养大鼠FSC和HC的基础上,用~3H-Proline掺入结合胶原酶消化法和定量斑点杂交法,分析了体外培养的FSC和HC胶原和非胶原蛋白的合成以及Ⅰ型前胶原mRNA的稳定性.结果:发现FSC合成胶原蛋白的能力较HC强,而非胶原蛋白则与此相反;FSC中Ⅰ型前胶原mRNA较HC中稳定,且半衰期较长.结论:FSC在ECM胶原合成中可能起主要作用,但HC的作用也不容忽视.     

肥大细胞对平滑肌源性泡沫细胞Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达的影响

目的　检测大鼠腹腔肥大细胞 (mastcell,MC)对平滑肌源性泡沫细胞Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达的影响。方法　SD大鼠体重约 2 0 0g ,雌雄不限 ,供采集MC和原代培养平滑肌细胞 (smoothmusclecell,SMC)。采用梯度密度离心分离MC ,提取MC上清液(含MC释放的各种炎症介质 )。用MC上清液和氧化型低密度脂蛋白 (oxLDL)处理SMC ,实验分四组 :对照组SMC在 5mL含10 %小牛血清的DMEM中培养 4 8h ;oxLDL组SMC在 5mL含 10 %小牛血清的DMEM中 (含oxLDL ,终浓度为 10 0mg L)培养 4 8h ;MC上清液组SMC在 5mL含 10 %小牛血清的MC上清液 (由含 1× 10 6 个MC的细胞悬液提取 )中培养 4 8h ;MC上清液 +ox LDL组SMC在 5mL含 10 %小牛血清的MC上清液 (由含 1× 10 6 个MC的细胞悬液提取 )中 (含oxLDL ,终浓度为 10 0mg L)培养4 8h。采用油红O染色检测SMC泡沫化。RT PCR检测SMCⅠ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA的表达 ,PCR引物序列Ⅰ型胶原为 5′ GACACTGAACCCTTTGTAATG 3′和 5′ GTGAAACTCCCGTCTGCT 3′ ,扩增片段长度为 399bp ;Ⅲ型胶原引物序列为 5′ AGCGGAGAATACTGGGTT 3′和 5′ TGTAATGTTCTGGGAGGC 3′ ,扩增片段长度为 2 88bp ;内参照采用β actin ,引物序列为 5′ GTGGGGCGCCCCAGGCACCA 3′和 5′ CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC 3′,扩     

Ⅰ型胶原的生物学功能及其基因转录调控

1　Ⅰ型胶原的分子结构和功能胶原是细胞外基质 (ＥＣＭ)的主要成份 ,在体内广泛分布 ,有极其重要的生物学功能 ,又与很多疾病的病理变化密切相关 ,是一类结构复杂 ,既有免疫原性又有生物活性的蛋白质。根据胶原在体内的分布和功能特点分为三大类 :间质胶原、基膜胶原和细胞外周胶原。间质胶原包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原等 ,主要分布在细胞或组织之间 ,由成纤维细胞、网织细胞、巨噬细胞和血管平滑肌细胞所生成[1] 。基膜胶原为一种分布在基膜不是纤维状而呈薄网状的胶原。如Ⅳ型胶原等 ,是基膜的支架结构。Ⅳ型胶原是典型的基膜胶原 ,比间质胶原…     

压力负荷增高性心肌肥厚大鼠心肌胶原网络重构及Ⅰ, Ⅲ型胶原mRNA表达的变化

目的 :探讨压力负荷增高性心肌肥厚时心肌胶原网络的重构及心肌 , 型胶原基因表达的变化。方法 :腹主动脉部分结扎术致大鼠心肌肥厚 ,VG染色和图象处理观察心肌胶原网络重构 ,Northern杂交测定心肌 , 型胶原基因表达。结果 :手术组大鼠术后 1周即呈现心肌肥厚 ,其程度随时间进展而加重。与假手术组比较 ,左室心肌总胶原容积百分比 （CVF- T）于术后 2周增高 ,CVF- T和无小血管视野胶原容积百分比 （CVF- NV）于术后 4,8周均显著增高 （P<0 .0 1）。左室心肌组织 , 型胶原 m RNA的表达于术后 1周明显增高 , 型胶原 m RNA的表达于术后 4周至假手术组水平 ,而 型胶原 m RNA表达则于术后 8周降至假手术组水平。结论 :压力负荷增高性心肌肥厚形成过程中伴有心肌胶原网络的重构 ,心肌 , 型胶原 m RNA表达增加可能是心肌胶原合成增加致心肌胶原网络重构的原因之一。     

adr型乙型肝炎病毒全基因组转基因小鼠的制备

目的 制备用于人乙型肝炎研究的ＨＢＶ转基因小鼠模型。方法 将首层相连的ａｄｒ型ＨＢＶ全基因组克隆至ｐＢＲ３２２质料,经扩增纯化后,用显微注地射法导入Ｃ５７ＢＬ／６小鼠受精卵原核,让外源ＨＢＶ自然整合至小鼠受精卵基因组。用ＰＣＲ、ＤＮＡ测序、放免及免疫组化等方法分析ＨＢＶ在小鼠体内的整合、复制、表达情况。结果 显微注射１７１２枚卵,产仔１２８只,其中有１４只鼠尾ＨＢＶ ＰＣＲ检测阳性。１２只在血清中     

硫化氢对肝纤维化大鼠肝脏Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的影响

目的:探讨硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)对肝纤维化大鼠肝脏Ⅰ型胶原(COL-Ⅰ)和Ⅲ型胶原(COL-Ⅲ)的影响.方法:选择硫氢化钠(sodium hydrosulfide,NaHS)作为H2S的供体,将32只♀SD大鼠分为3组:正常组(N组)8只、肝纤维化组(hepatic fibrosis,HF组)13只、NaHS干预组(S组)11只,采用四氯化碳复合因素法复制肝纤维化模型,S组自造模第6周始给予NaHS56μmol/(kg·d)腹腔注射12d,N组和HF组给予同等剂量的生理盐水腹腔注射.干预结束后,宰杀大鼠留取肝脏行肝组织病理切片HE染色评价肝纤维化分期,行Masson染色观察胶原纤维沉积情况,应用RT-PCR法检测肝脏中COL-Ⅰ、COL-ⅢmRNA表达,采用SP免疫组织化学法检测肝脏COL-Ⅰ、COL-Ⅲ表达.结果:HF组与N组相比,COL-Ⅰ、COL-Ⅲ及其mRNA表达升高(均P=0.000),与肝纤维化分期结果一致(P=0.000);S组与HF组相比,COL-Ⅰ和COL-Ⅲ表达降低(均P=0.000);COL-ⅠmRNA表达降低(P=0.009),同时COL-ⅢmRNA表达亦降低(P=0.003),肝纤维化分期下降(P=0.047).结论:H2S具有降低肝脏Ⅰ、Ⅲ型胶原表达的作用,能够延缓肝纤维化的发生发展.     

干扰素γ对肝星状细胞-T6细胞Ⅰ、Ⅲ型胶原等基因表达的影响

目的观察干扰素γ(IFN γ)对肝星状细胞(HSC)-T6细胞Ⅰ型胶原(ColⅠ)、Ⅲ型胶原(colⅢ)、基质金属蛋白酶组织抑制因子1(TIMP1)基因表达的影响。方法浓度0.1、1、10、102、103、104、2.5×105、5×105U/ml IFN γ作用于HSC-T6细胞48 h,采用四甲基偶氮唑盐比色法观察其对HSC-T6细胞生长指数的影响;以1、102、104U/ml IFN γ作用于HSC-T6细胞48 h,采用逆转录聚合酶链反应方法测定其对HSC-T6细胞Col Ⅰ、ColⅢ、TIMP1基因表达的影响。结果空白对照组ColⅠ、ColⅢ、TIMP1基因表达水平分别为2.86±0.21、2.00±0.23、3.90±0.81;1U/m1、102U/ml、104U/ml IFNγ作用于HSC-T6细胞,ColⅠ基因表达水平依次为1.00±0.11、0.42±0.12、0.33±0.12,与空白对照组比较, 差异有统计学意义;ColⅢ基因表达水平依次为1.09±0.1 5、0.52±0.14、0.43±0.18,与空白对照组比较, 差异有统计学意义;TIMP1基因表达水平依次为3.81±0.37、3.50±0.51、3.41±0.31,与空白对照组比较,差异无统计学意义。结论IFNγ明显抑制HSC-T6细胞colⅠ、ColⅢ基因表达水平,而对TIMP1基因表达水平无明显影响,从而可抑制Ⅰ、Ⅲ型胶原的合成,这可能是其抗纤维化的作用机制之一。     

Ⅲ型、Ⅳ型胶原在慢性胰腺炎组织中的表达

目的检测Ⅲ、Ⅳ型胶原在CP及正常胰腺组织中的表达水平,研究其在胰腺间质纤维化形成中的作用。方法免疫组织化学方法检测16例CP标本及6例正常胰腺组织中Ⅲ、Ⅳ型胶原的表达。结果16例CP中,Ⅲ型、Ⅳ型胶原表达均为轻度以上深染,其中重度深染50%（8/16）,中度深染31.25%（5/16）;而正常胰腺组织Ⅲ、Ⅳ型胶原表达均为浅染。正常胰腺组织中Ⅲ、Ⅳ型胶原表达于基底膜、间质纤维、导管壁、血管壁,Ⅲ型胶原以间质纤维表达最明显,Ⅳ型胶原以基底膜表达最明显。CP组织中Ⅲ型胶原表达于基底膜、间质纤维、导管壁、血管壁,以间质纤维最明显;Ⅳ型胶原表达于基底膜、间质纤维、导管壁、血管壁,以基底膜最明显。结论Ⅲ、Ⅳ型胶原的表达增强在胰腺纤维化的形成中可能有重要作用。     

体外培养人成骨细胞Ⅰ型胶原合成与表达的增龄性改变

目的探讨体外培养不同年龄组人成骨细胞Ⅰ型胶原（COL-1）表达的增龄性改变. 方法选择＜5岁、30～40岁、50～60岁及70～79岁4个年龄组骨折患者的松质骨,用1：1 DMEM-Ham F-12培养液进行培养.第2代细胞培养至7 d和13 d,分别定量留取培养48 h的条件培养液,第2代细胞一部分经诱导培养至14 d进行电镜观察,另一部分培养至14 d抽提细胞内总RNA,用逆转录聚合酶链反应方法半定量检测COL-1基因表达,并进行各年龄组比较. 结果成骨细胞经体外诱导培养后透射电镜下观察,细胞外基质中可见大量原胶原;细胞培养至7 d和13 d Ⅰ型前胶原羧基端前肽（PICP）检测值均随年龄增长逐渐降低,与年龄之间呈显著负相关（男性7 d： r=-0.503, P＜0.05, 13 d： r=-0.662, P＜0.01; 女性7 d： r=-0.658, P＜0.01, 13 d： r=-0.770, P＜0.01）;各年龄组成骨细胞均检测到COL-1基因mRNA表达,表达量＜5岁组较低,30～40岁组最高,之后随年龄增长逐渐降低,其表达量和年龄呈显著正相关（男性r=0.331,女性r= 0.327,均为P＜0.05）,性别间差异无统计学意义. 结论体外培养人成骨细胞可合成原胶原,PICP分泌随增龄而降低,不同年龄组人成骨细胞均表达COL-1 mRNA,30～40岁后表达量随年龄增长而降低.     

脂质对肝呈状细胞表达前胶原Ⅰ,ⅢmRNA的影响

目的 探讨脂质（三酯酰甘油和极低密度脂蛋白）对ＨＳＣ前胶原Ⅰ、ⅢｍＲＮＡ表达的影响。方法 链霉蛋白酶和胶原酶的位灌注,Ｎｙｃｏｄｅｎｚ雷度梯度离心分离大鼠ＨＳＣ,分别用三酯酰甘油（２５ｍｇ／Ｌ）和极低密度胆蛋白（２５ｍｇ／Ｌ）共孵育１０ｄ后,提取ＨＳＣ的ＲＮＡ,用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ杂交观察一酯酰甘油和极低密度脂蛋白对ＨＳＣ前胶原Ⅰ、Ⅲ ｍＲＮＡ表达。 三酯酰甘油和极低密度脂蛋白刺激后其胶胶     

Ⅲ型、Ⅳ型胶原在慢性胰腺炎组织中的表达

目的 检测Ⅲ、Ⅳ型胶原在CP及正常胰腺组织中的表达水平,研究其在胰腺间质纤维化形成中的作用.方法 免疫组织化学方法检测16例CP标本及6例正常胰腺组织中Ⅲ、Ⅳ型胶原的表达.结果 16例CP中,Ⅲ型、Ⅳ型胶原表达均为轻度以上深染,其中重度深染50%(8/16),中度深染31.25%(5/16);而正常胰腺组织Ⅲ、Ⅳ型胶原表达均为浅染.正常胰腺组织中Ⅲ、Ⅳ型胶原表达于基底膜、间质纤维、导管壁、血管壁,Ⅲ型胶原以间质纤维表达最明显,Ⅳ型胶原以基底膜表达最明显.CP组织中Ⅲ型胶原表达于基底膜、间质纤维、导管壁、血管壁,以间质纤维最明显;Ⅳ型胶原表达于基底膜、间质纤维、导管壁、血管壁,以基底膜最明显.结论 Ⅲ、Ⅳ型胶原的表达增强在胰腺纤维化的形成中可能有重要作用.     

褪黑素对自身免疫性肝炎大鼠肝星状细胞透明质酸、Ⅲ型前胶原分泌及Ⅰ型胶原mRNA表达的抑制作用

本研究在自身免疫性肝炎（AIH）大鼠模型肝星状细胞培养过程中加入褪黑素（MT）,检测培养上清中透明质酸（HA）和Ⅲ型前胶原（PCⅢ）的含量,并采用RT—PCR法观察MT对肝星状细胞（HSC）表达Ⅰ型胶原（colⅠ）mRNA的影响。     

大剂量HBsAg疫苗对HBV转基因小鼠细胞免疫调节的实验研究

目的 研究大剂量HBsAg疫苗对HBV转基因小鼠(Tg鼠)细胞免疫应答影响。方法 用大剂量HBsAg疫苗免疫Tg鼠后，用流式细胞术、氚-胸腺嘧啶核苷(^3H-TdR)掺入法和ELISA，分别检测其树突状细胞(DC)、T淋巴细胞增殖及其诱生细胞因子IL-2、IFNγ的水平。结果 大剂量HBsAg疫苗组DC表面共刺激分子和I-E^k表达，特异T淋巴细胞增殖能力及其诱生细胞因子IL-2、IFNγ的水平显著高于对照组。结论 大剂量HBsAg疫苗增强Tg鼠细胞免疫应答，恢复对乙型肝炎表面抗原的应答。     

18α甘草酸对I型胶原转录水平的调控

目的探讨18α甘草酸(18αGL)对CCl4诱导的肝纤维化大鼠的I型胶原的调控作用。方法采用40%CCl4皮下注射方法建立肝纤维化大鼠模型,分为正常组、肝纤维化模型组和18αGL干预组。采用免疫组织化学和实时PCR分析I型胶原表达情况。Signal-Net网络分析发现与I型胶原组分COL1A1和COL1A2直接相关的基因,实时PCR分析18αGL干预后相关基因表达情况。结果 18αGL能够改善纤维化大鼠I型胶原相关COL1A1和COL1A2的mRNA水平,并且能减少I型胶原的分布。Signal-Net网络分析发现与COL1A1和COL1A2直接相关的基因中,与TGF-β/Smad、Rho/rock、MAPK、PDGF和MMP等信号通路相关,动物体内18αGL可引起RAC、RHOA、HSPB、SMAD3、SP-1和MMP2、MMP9转录水平的下调。结论 18αGL能够显著减少纤维化大鼠肝脏I型胶原的表达,并且从多通路抑制I型胶原COL1A1和COL1A2表达,从而可以多层次,多靶点的改善胶原和影响肝纤维化进程。