噬菌体展示法筛选抗人PTA1单克隆抗体结合肽

目的　从噬菌体展示文库中筛选能与抗人 PTA1单克隆抗体 (m Abs)特异性结合的短肽 .方法　采用 protein- A亲和层析法纯化系列抗人 PTA1m Abs,通过流式细胞术检测筛选出能够阻断 PTA1- Fc融合蛋白与其天然配体结合的 m Ab,经过三轮亲和筛选 ,从噬菌体随机 12肽库中筛选可特异性结合 m Ab的重组噬菌体阳性克隆 ,进而对这些克隆的短肽序列进行测定和分析 .结果　确定了能够阻断 PTA 1- Fc融合蛋白与其天然配体结合的 m Ab为 L eo A1,得到了 13个具有特异性结合 L eo A1的重组噬菌体阳性克隆 ,序列测定结果发现 ,这些可结合 L eo A1…     

从噬菌体15肽库中筛选乙脑病毒糖蛋白模拟肽

目的　用抗 JEV E蛋白的 m Ab 2 H4筛选噬菌体 15肽库 ,以研究 JEV E蛋白模拟肽 .方法　用生物素标记的 m Ab 2 H4,对噬菌体随机 15肽库进行 3轮筛选 .经 EL ISA鉴定后 ,随机挑取 10个阳性噬菌体克隆测序 ,并与 JEV E蛋白进行同源性比较 .结果　筛选到的噬菌体能与 m Ab 2 H4特异地结合 ,并且这种结合可被天然 JEV抗原所抑制 . 10个阳性噬菌体克隆的氨基酸序列相同 ,均为 RQDPQWPYANSTIAR.同源分析表明 ,在 JEV E蛋白不同区域有两个同源性较高的序列 :STXAR和WXXAXST.阳性噬菌体展示肽也能与抗天然 JEV抗原的鼠血清…     

次声作用后mGluR1α,mGluR5在CA1区表达的改变及MCPG的保护作用

目的　探讨次声作用后鼠脑 CA1区 m Glu R1α和 m Glu R5表达改变的规律 ,并观察其拮抗剂 MCPG的作用 .方法　 16 0只SD大鼠随机分为次声作用组及 MCPG治疗组 .两组再分为对照组及次声作用 1次、7次和 14次组 .用 8Hz,130 d B的次声按规定次数 ,每次作用 2 h.用免疫组织化学染色和原位杂交的方法检测 m Glu R1α和 m Glu R5的表达 ,光镜下观察 MCPG治疗后神经元形态的改变 .结果　与对照组相比较 ,次声作用 1次后 ,m Glu R1α与 m Glu R5的阳性细胞数和吸光 (A)值即改变 (P>0 .0 5 ) ;7次组改变最显著 (P>0 .0 1) ;14次组恢复…     

应用噬菌体展示技术筛选缺氧诱导因子-1α相关肽

目的：应用噬菌体展示12肽库筛选低氧诱导因子—α(HIF—α)相关肽。方法：以抗HIF—α单克隆抗体(HIF—αmAb)为配基，采用亲和免疫法从随机12肽库中筛选与抗体特异结合的噬菌体。在筛选过程中，逐轮提高HIF—αmAb的稀释度并增强洗脱强度。3轮筛选后，随机挑取10个克隆测序。通过膜斑点印迹(Dot-ELISA)进行特异性结合鉴定。结果：经过3轮筛选后，特异性结合的噬菌体得到有效的富集，并且Dot-ELISA反应阳性逐轮增强。测序后发现有4个克隆的序列完全相同，其12肽氨基酸序列为GPHHYWYHLRLP。结论：噬菌体展示肽库技术可以用于筛选HIF—1相关肽，并为后续的活性鉴定打下基础。     

RA患者血清IgG抗体特异结合的噬菌体模拟肽的筛选

目的 从噬菌体随机12肽库中,筛选能与RA患者血清IgG抗体特异结合的RA相关抗原表位的噬菌体模拟肽,并寻找对RA敏感性和特异性均高的模拟肽.方法 提纯30例RA患者血清IgG抗体,以此作为筛选配基,对噬菌体12肽库进行4轮免疫筛选,通过ELISA方法对随机挑取噬菌体克隆进行初步鉴定,取混合阳性克隆利用Dot-ELISA方法分析15例RA患者和15例正常人血清的敏感性和特异性.结果 经4轮免疫淘洗后,特异结合的噬菌体富集增加近100倍.随机挑取的11个噬菌体克隆,经鉴定均能与IgG抗体特异性结合,阳性率100%.混合的阳性克隆分别与15例RA患者和15例正常人血清反应,15例RA患者血清全部为阳性,正常人血清只有1例为阳性,敏感性为100%,特异性为93.3%.结论 利用RA患者血清IgG抗体筛选噬菌体随机12肽库,能获得对RA敏感性和特异性均高的噬菌体多肽,故有望利用该技术开发新的RA特异性实验室诊断指标,为制备RA特异性诊断试剂盒提供实验基础.     

噬菌体7肽文库筛查类风湿关节炎相关抗体及分析

目的筛选和鉴定与类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者血清特异性结合的噬菌体7肽,并分析其实际意义。方法采用30例正常人混合血清和30例RA患者混合血清作为筛选配基对噬菌体随机7肽库进行亲和筛选、扩增,获得RA血清特异性结合的噬菌体克隆。用患者混合血清进行Dot-ELISA实验鉴定获得的噬菌体克隆,进一步用RA患者及正常人血清各12例筛选阳性噬菌体的混合克隆。对鉴定的噬菌体克隆进行测序,并分析其同源性。结果获得17个与RA患者混合血清特异性结合的阳性克隆。阳性噬菌体混合克隆与RA患者个体血清反应阳性率明显高于其与正常人血清的反应率。序列分析显示阳性噬菌体克隆的抗原表位之间无共有序列,但与杆菌、球菌等有一定的同源性。结论 RA患者血清中存在与病原体抗原表位结合的抗体成分,提示RA的发病可能与病原体感染有关。     

噬菌体随机12肽库中VEGF模拟表位的筛选及初步鉴定

目的:从噬菌体随机12肽库中筛选能与抗血管内皮生长因子(VEGF)mAb阿瓦斯汀(Avastin)特异性结合的多肽.方法:用Avastin为靶分子,对噬菌体12肽库进行3轮生物淘洗,随机挑取80个克隆,ELISA法鉴定其亲和性,将亲和性高的阳性克隆进行DNA序列测定,推导与噬菌体外壳融合的12肽氨基酸序列.Fmoe固相法合成12肽,戊二醛交联12肽与血蓝蛋白(KLH),打点印迹(Dot blot)检测偶联物能否与Avastin结合.结果:ELISA显示,42个噬菌体克隆与Avastin有较强的亲和性,测序发现41个阳性克隆表达的融合12肽的序列一致,1个不同;化学合成的12肽能与Avastin特异性结合,12肽-KLH偶联物也能与Avastin特异性结合.结论:初步证明12肽模拟了VEGF部分表位.     

类风湿关节炎患者血清和关节液细胞因子水平的变化及临床意义

目的　探讨幼年类风湿关节炎 (JRA)及类风湿关节炎 (RA)患者 IL- 6 ,IL- 8,s IL- 2 R和 TNF- α等细胞因子 (CK)水平的变化 ,及其与风湿活动的传统指标血沉 (ESR)和 C-反应蛋白 (CRP)的相关性 .方法　采用夹心 EL ISA法 ,对 30例 JRA和 34例 RA患者的血清中 ,4例 JRA,7例 RA,6例骨性关节炎 (OA)和 9例半月板损伤 (MT)患者的关节液中 IL- 6 ,IL- 8,s IL- 2 R和 TNF- α的水平进行检测 .结果　 130例 JRA,34例 RA患者血清 IL- 6和 s IL- 2 R的水平与对照组相差非常显著 (P>0 .0 1) ;30例 JRA患者血清 IL- 8水平与…     

噬菌体表面展示文库筛选人干细胞因子模拟肽

目的 用噬菌体表面展示文库筛选具有人干细胞因子(hSCF)生物学活性的模拟肽.方法 采用酶联免疫吸附测定法(EUSA)从噬菌体环七肽库和十二肽库筛选与重组hSCF受体(rc-kit/Ig1-3)有较高亲和力的噬菌体克隆,提取噬菌体单链DNA进行序列测定,根据序列测定结果合成阳性小肽,四甲基偶氮噻唑盐(MTT)法检测合成小肽刺激UT-7细胞增殖的活性.结果 经3轮筛选获得11个来源于环七肽库和8个来源于十二肽库与rc-kit/Ig1-3结合活性较高的噬菌体克隆,DNA测序结果显示环七肽库筛选到1个共有序列DPSSPHTH,十二肽库没有筛选到共有序列.序列比对分析显示,这些小肽与hSCF没有同源序列.MTT法测定结果表明,合成的4个小肽均能促进UT-7细胞增殖,其中CE16和LE20刺激效果明显.结论 获得4个具有较高hSCF生物学活性的模拟肽.     

利用噬菌体肽库筛选汉滩病毒受体结合表位的研究

目的 确定汉滩病毒(HTNV)上可与宿主细胞受 体结合的一段配基表位. 方法 型特异性mAb 3G1,与HTNV 糖蛋白G 2及核蛋白(NP) 具有双结合活性,且中和效价很高. 以纯化的mAb 3G1作为配基,淘筛噬菌 体随机12肽库,经ELISA法鉴定后,对阳性克隆进行测序并与天然病毒蛋白G2及NP的序列进 行同源性比较分析. 结果 经3轮筛选,噬菌体显示有良好的富集效 果. 从第3轮筛选产物中,随机挑取21个克隆进行ELISA结合实验. 结果显示, 9个克隆与mAb 3G1有较强的特异结合活性;DNA测序结果表明,具有保守性序列模式PX(1-2)HX (0-2)H. 该基序分别与G296YPWHTAKCHY105及NP 81PTGVEPGDHL KERS94相似. 结论 从噬菌体随机肽库中,筛选到能与 mAb 3G1特异性结合的一段短肽基序PX(1-2)HX(0-2)H, 其与HTNV G2部分氨 基酸的同源性较高, 可能是与宿主细胞受体结合的表位, 为进一步证实和研究HTNV的受体 奠定了基础.     

噬菌体随机肽库中B型钠尿肽结合肽的筛选及鉴定

目的 利用噬菌体随机肽库筛选特异性靶向人肝癌细胞的短肽,为肝癌的靶向治疗提供理论依据.方法 以人肝癌细胞HepG2为靶细胞,对噬菌体随机十二肽库进行3轮筛选.建立Hep62荷瘤裸鼠实验动物模型,并在裸鼠体内对经过体外3轮筛选的肽库再进行1轮筛选.随机挑取30个阳性噬菌体克隆进行序列测定及同源性分析.通过免疫细胞化学染色、免疫组织化学染色鉴定噬菌体展示肽的特异性.结果 经过3轮体外筛选和1轮动物体内筛选.噬菌体在靶细胞HepG2上出现明显富集,随机挑选克隆测序结果表明十二肽VRKRSECLGAHD出现次数最多,免疫细胞化学染色、免疫组织化学染色进一步证明该噬菌体能特异结合于肝癌细胞.结论 筛选得到的短肽能够特异性与肝癌细胞结合,为进一步研制用于治疗肝癌的高靶向性药物奠定实验基础.     

噬菌体展示肽库筛选VPAC1高亲和力结合多肽

目的 通过噬菌体展示肽库技术筛选VPAC1高亲和力结合十二肽配体,并进行特异性和亲和力鉴定.方法 建立稳定表达VPAC1的真核细胞系;利用噬菌体肽库展示技术进行全细胞差减筛选,随机挑取40个噬菌体克隆进行测序,初步鉴定确定阳性克隆,明确外源十二肽序列,固相合成该十二肽;利用体外竞争结合ELISA及流式细胞分析,鉴定目标多肽与VPAC1受体结合的特异性及亲和力.结果 成功构建稳定表达VPAC1细胞系;经过4轮差减筛选,回收噬菌体逐轮得到富集,随机挑取40个克隆测序,共得到15条序列不同的多肽,经ELISA鉴定有7个克隆与细胞有特异性高结合能力;阳性噬菌体克隆与细胞结合通过多肽VP1介导;VP1能特异高亲和地与VPACl受体结合.结论 通过噬菌体展示肽库技术成功筛选得到与VPAC1高亲和力特异结合十二肽.     

从噬菌体展示肽库中筛选 PreS1抗原的结合肽

目的:从噬菌体随机七肽库中筛选能与PreS1抗原特异性结合的多肽。方法:利用噬菌体展示技术,以PreS1抗原为靶分子,从随机七肽库中进行生物亲和筛选,ELISA鉴定阳性克隆。结果:对肽库进行3 轮筛选后,通过ELISA和竞争抑制ELISA,获得了特异性的结合肽,测序结果显示噬菌体上的短肽有共同序列。结论:利用噬菌体展示技术成功筛选到了PreS1抗原的结合肽,为乙肝的治疗和诊断探索新的途径。     

应用噬菌体肽库筛选Endoglin的结合肽

目的 利用噬菌体12肽库筛选可与Endoglin结合的活性小分子肽.方法 以rhEndoglin为靶分子,对噬菌体12肽库进行亲和筛选.经过3轮筛选,随机挑取16个克隆,双夹心ELISA法鉴定其亲和性,测定亲和力高的阳性噬菌体克隆的DNA序列,推断出与噬菌体外壳蛋白融合的氨基酸序列,竞争抑制实验检测优势克隆的特异性.结果 竞争性ELISA显示6个噬菌体克隆与rhEndoglin有较强的结合活性,经测序获得5种不同的多肽序列,其中2个克隆的氨基酸序列为:AHKHVHHVPVRL.结论 噬菌体随机肽库技术可以获得Endoglin结合肽的蛋白质序列.     

噬菌体随机肽库筛选肝癌细胞特异性结合肽的实验研究

目的 利用噬菌体随机肽库筛选特异性靶向人肝癌细胞的短肽,为肝癌的靶向治疗提供理论依据.方法 以人肝癌细胞HepG2为靶细胞,对噬菌体随机十二肽库进行3轮筛选.建立Hep62荷瘤裸鼠实验动物模型,并在裸鼠体内对经过体外3轮筛选的肽库再进行1轮筛选.随机挑取30个阳性噬菌体克隆进行序列测定及同源性分析.通过免疫细胞化学染色、免疫组织化学染色鉴定噬菌体展示肽的特异性.结果 经过3轮体外筛选和1轮动物体内筛选.噬菌体在靶细胞HepG2上出现明显富集,随机挑选克隆测序结果表明十二肽VRKRSECLGAHD出现次数最多,免疫细胞化学染色、免疫组织化学染色进一步证明该噬菌体能特异结合于肝癌细胞.结论 筛选得到的短肽能够特异性与肝癌细胞结合,为进一步研制用于治疗肝癌的高靶向性药物奠定实验基础.     

应用噬菌体随机十二肽库筛选TGF-β1相关模拟肽的实验研究

目的应用噬菌体随机12肽库生物筛选获得转化生长因子-β1(TGF-β1)噬菌体模拟肽。方法以人TGF-β1单克隆抗体为靶,进行4轮生物淘选,随机挑取单克隆噬菌体,ELISA法检测单克隆噬菌体的结合力。对结合力较好的单克隆噬菌体提取噬菌体DNA,进行测序,行序列分析。结果经过4轮生物淘选,特异性噬菌体模拟肽获得了富集,ELISA检测结果显示,获得的一些噬菌体模拟肽具有较好的结合力,测序获得10个与促进成纤维细胞增殖或抑制细胞增殖有关的碱基序列。结论从噬菌体随机十二肽库中可淘选到与TGF-β1相关的噬菌体模拟肽。     

肺癌噬菌体展示肽库的构建及肺癌早期检测分子标志的筛选

目的:构建肺癌噬菌体展示肽库,筛选出肺癌早期检测的分子标志群.方珐:取30例第二军医大学长海医院手术后立即冻存的肺癌组织标本构建肺癌噬菌体展示肽库;用结合protein-A/G的琼脂糖珠分别富集肺癌组及非肿瘤对照组血浆中的抗体进行5轮亲和筛选,富集肺癌特异性的相关肽;随机挑取5轮筛选后的500个噬菌体克隆.用ELISA法进一步筛选肺癌/4照D比值大于2.0的肺癌特异标志物克隆.进行基因序列测定和蛋白功能预测.结果:(1)该噬菌体展示肽库的滴度为3.0×106pfu,库容9.0×106pfu,随机挑选20个噬菌斑经PCR鉴定其重组率为60%.(2)共筛选出19个有意义的噬菌体,测序后,预测其蛋白质功能.9个与癌症相关,8个功能未知,2个与癌症不相关.结论:筛选出的噬菌体克隆所表达的抗原很可能是早期诊断肺癌的标志物.     

大肠癌噬菌体展示肽库的构建及大肠癌早期检测分子的筛选

目的构建大肠癌噬菌体展示肽库,筛选用于大肠癌早期检测的分子标志。方法选取30例第二军医大学长海医院肛肠外科手术后立刻冻存的大肠癌组织标本构建T7噬菌体展示肽库;用结合protein-A/G的琼脂糖珠分别富集大肠癌组及非肿瘤对照组血清中的抗体进行5轮亲和筛选,富集大肠癌相关肽;随机挑取5轮筛选后的2000个噬菌体克隆,用ELISA方法进一步筛选与大肠癌患者血清和对照血清反应性存在差异的大肠癌相关标志物克隆,进行基因序列测定。应用通过Chilibot文献挖掘方法预测各克隆的蛋白功能,反证筛选结果。结果 (1)所建大肠癌噬菌体展示肽库的滴度为3.0×106pfu,经PCR鉴定其重组率为60%,库容为1.8×106pfu。(2)共筛选出18个有意义的噬菌体,测序后,预测其蛋白功能,其中12个与肿瘤的发生相关。结论应用ELISA对肿瘤重组抗原的噬菌体展示肽库进行筛选的方法 ,可以用来发现差异表达的抗原。所筛选出的噬菌体克隆所表达的抗原可用于早期筛检大肠癌。     

噬菌体肽库技术筛选肿瘤靶向短肽的研究进展

噬菌体展示技术是一项特殊的基因重组表达技术,亦是一种强大的筛选工具。1985年,Smith等成功地创立了噬菌体展示技术;1990年,Scott等在噬菌体展示技术的基础上发展并构建了噬菌体展示随机肽库。噬菌体肽库技术是一种新兴的药物发现工具［1］,通过噬菌体随机肽库筛选获得的肽可以作为分子载体运载药物,起到生物导弹的功能。筛选的肽也可以直接与药物靶点分子特异性结合,起到生物治疗的作用。近年来,噬菌体肽库技术已广泛应用于肿瘤研究,如癌症的检测和诊断、肿瘤相关抗原的筛选、肿瘤药物的研制、肿瘤细胞信号转导及肿瘤的基因治疗研究等。现就近年来噬菌体展示肽库技术在筛选肿瘤靶向短肽研究中的应用综述如下。     

从噬菌体表面展示环状7肽肽库中筛选葡萄球菌B型肠毒素抑制剂

目的:拟通过生物淘选从噬菌体表面展示环状7肽肽库中筛选出与葡萄球菌B型肠毒素(Staphylococcal enterotoxin B,SEB)结合并能抑制该毒素毒性效应的特异性短肽.方法:采用Phage-ELISA来鉴定所得目的肽的亲和性;利用竞争ELISA研究合成肽与SEB mAb竞争结合SEB的情况;通过动物实验考察其抑制SEB的超抗原特性和肠毒活性情况.结果:筛选所得短肽在一定浓度范围内可以抑制SEB对鼠脾淋巴细胞的激活;合成肽与SEB质量比160:1下,合成肽可较好地抑制SEB对乳猫的肠毒活性,并对SEB引起的小鼠致死具有明显保护作用.结论:得到了能与SEB特异结合并能抑制SEB超抗原特性和肠毒活性的短肽.