靶向调控UPRT/5-FU自杀基因系统对前列腺癌细胞旁观者效应的研究

目的研究前列腺特异性膜抗原(PSMA)增强子(enhancer)/启动子(promoter)靶向性调控尿嘧啶磷酸核糖转移酶(UPRT)/5-氟尿嘧啶(5-FU)自杀基因系统对前列腺癌细胞株的旁观者效应。方法应用自行构建PSMA启动子/增强子靶向性调控的UPRT基因真核表达质粒pPSMA enhancer/promoter-UPRT,脂质体介导转染质粒,并应用G418进行稳定表达UPRT基因的前列腺癌细胞株的筛选。转染质粒pPSMA enhancer/promoter-UPRT的前列腺癌细胞和非转染细胞按不同比例混合培养,UPRT/5-FU自杀基因系统配给,MTT法检测其对前列腺癌细胞杀伤的旁观者效应。结果成功筛选稳定表达UPRT基因的前列腺癌细胞株;通过转染细胞和非转染细胞按照不同比例混合,结果显示该自杀基因系统并没有明显的旁观者效应,随着转染比例的增多,细胞增殖抑制率也逐渐增加,没有出现跳跃明显性增加。结论UPRT可以使5-FU快速转化毒性物质,发挥细胞毒作用,但发挥细胞毒杀作用中的旁观者效应不明显。     

反向前列腺特异性膜抗原增强子启动子调控重组质粒的构建及增强子调控活性的比较

目的 探讨前列腺特异性膜抗原（PSMA）启动子和增强子调控目的基因表达的前列腺细胞特异性,了解增强子增强转录效率的能力。方法 采用PCR方法从前列腺癌细胞DNA中分别扩增PSMA增强子序列．将其按不同方向亚克隆到含有报告基因——绿色荧光蛋白（GFP）的重组质粒载体pEGFP—PSMAPPro脂质体介导基因转染不同癌细胞并观察GFP在所转染的细胞的表达情况。结果 成功构建质粒pEGFP—PSMAE-P和pEGFP-PSMAE（r）-P,质粒转染结果显示PSMA表达阳性的LNCaP细胞中存在GFP的特异有效表达,增强子序列能使基因转录效率提高30倍,不同方向的增强子序列在增强转录效率方面具有同样效应。结论 反向PSMA增强子启动子调控GFP表达的重组质粒的构建证明该调控序列具有前列腺细胞特异性,增强子具有增强启动子转录效率的功能且没有方向性。     

前列腺特异性膜抗原启动子调控的重组质粒的构建及表达

目的 探讨前列腺特异性膜抗原(PSMA)启动子调控目的基因表达的前列腺细胞特异性,为前列腺癌靶向性基因治疗作前期铺垫。方法 采用PCR方法从前列腺癌细胞DNA中扩增PSMA启动子序列,将其克隆到含有报告基因——增强绿色荧光蛋白(EGFP)的质粒载体,脂质体介导基因转染不同癌细胞并观察EGFP在不同细胞的表达情况。结果 成功构建质粒pEGFP-PSMAm,质粒转染结果显示PSMA表达阳性的LNeap细胞中存在GFP的有效表达。结论 PSMA启动子调控EGFP表达的重组质粒的构建证明了PSMA启动子的基因转录启动与细胞PSMA的表达相关,即具有前列腺细胞特异性。     

PSA增强子启动子调控Smac基因表达载体的构建

目的 构建携带Smac基因、人前列腺特异性抗原(PSA)增强子(PSAE)/PSA启动子(PSAP)调控的前列腺特异性真核表达载体.方法 切除含Smac基因的真核表达载体pcDNA 3.1-Smac内部的人巨细胞病毒/T7启动子序列,替换为在前列腺组织特异性表达的PSAE、PSAP调控序列.构建的质粒经双酶切凝胶电泳及测序鉴定.结果 成功构建携带Smac基因人PSAE-PSAP调控的前列腺特异性真核表达载体pcDNA3-PSAE-PSAP-Smac质粒.结论 新构建的载体为前列腺癌的靶向基因治疗奠定了基础.     

增强型自杀基因载体治疗宫颈癌的体外实验研究

目的探讨运用增强子增强hTERT启动子转录活性后，调控双自杀融合基因CDTK载体对人宫颈癌HeLa细胞的体外杀伤作用。方法将SV40增强子、CMV增强子、CMV增强子／启动子及SV40-CMV双增强子分别与hTERT启动子组合构建成报告基因载体。转染HeLa细胞后用双荧光素酶系统分析其活性差异；然后构建pHr—SCT／CDTKG治疗载体转染HeLa细胞，用流式细胞仅检测转染效率，RT-PCR检测融合自杀基因mRNA表达，HPLC检测5-Fu浓度，MTT分析载体杀瘤的效果。结果HeLa细胞中增强子能使hTERT启动子活性提高6-13倍，其中SV40-CMV双增强子／hTERT启动子的活性最高，达到CMV增强子／启动子的近3倍；体外转染pHr—SCT／CDTKG后可检测到cDTK的mRNA的表达；细胞上清中5-Fu最高浓度为50．83ug／mL；当5-FC浓度为200ug／mL、GCV浓度为10ug／mL时，HeLa细胞的相对细胞存活率为48．7％。结论SV40-CMV双增强子联合hTERT启动子能高效靶向的调控CDTK融合自杀基因杀伤宫颈癌细胞，因而是一种很有前景的基因治疗宫颈癌的策略。     

PSMAe/p驱动shRNA靶向干扰核干因子治疗前列腺癌的研究

目的 探讨前列腺特异性膜抗原增强子、启动子(PSMAe/p)驱动shRNA靶向干扰核干因子(NS)治疗前列腺癌的有效性和应用前景.方法 免疫组织化学染色观察NS基因在前列腺癌LNCaP细胞和PC-3细胞中的表达 ;利用构建的以poly(A)为终止信号的NS特异性shRNA表达载体pPSMAe/p-shNS-poly(A)转染LNCaP细胞和PC-3细胞 ;观察RNA干扰后细胞体外增殖的变化,检测NS基因水平、细胞周期、细胞凋亡的变化.结果 NS在LNCaP和PC-3细胞中高表达 ;pPSMA-shNS-poly (A)在转染高表达PSMA的LNCaP细胞后NS表达受到抑制,细胞周期受到阻滞,并抑制了细胞的增殖,同时导致细胞发生凋亡 ;而在不表达PSMA的PC-3细胞中NS表达无明显抑制,细胞周期未受到阻滞,细胞凋亡无明显变化.结论 PSMAe/p驱动shRNA靶向干扰NS基因具有细胞特异性 ;NS基因在LNCaP细胞恶性增殖中发挥重要作用,NS可能是前列腺癌基因治疗的理想靶基因之一.     

肝癌特异性HSV-TK／CD基因表达质粒的构建及其杀伤活性

[目的]构建肝癌特异性双自杀基因表达质粒。[方法]用平端连接方法将pUH-3质粒中822bp的pALBeAFP片段(含有416bp的白蛋白启动子pALB和406bp的甲胎蛋白增强子eAFP)代替pCEA-CD／TK质粒的CEA启动子，用PCR法鉴定插人方向，构建肝癌特异性双自杀基因表达质粒pALBeAFP-CD／TK。将pALBeAFP-CD／TK转染HepG2等4种肝癌细胞，MTT法测定前药GCV、5-FC对HepG2细胞的杀伤作用。[结果]获得pALBeAFP-CD／TK克隆，RT-PCR证实HepG2细胞转染pALBeAFP-CD／TK后可表达自杀基因．pALBeAFP-CD／TK转染可使前药GCV、5-FC特异性地杀伤HepG2细胞。[结论]肝癌特异性HSV-TK／CD基因表达质粒构建成功。     

PSMA-IRES-FCY1-TK真核表达载体的构建及在前列腺癌细胞中的表达

目的: 构建前列腺特异性膜抗原(PSMA)启动子调控表达的FCY1/TK双自杀基因表达载体,并观察单、双自杀基因对前列腺癌细胞LNCaP的杀伤作用.方法: 通过PCR方法扩增出基因组DNA中PSMA启动子,利用基因重组的方法,替换真核表达载体pIRES中的CMV启动子.测序正确后,再将自杀基因FCY1和HSV-TK分别克隆于载体pIRES的两个多克隆位点,构建真核表达载体pPSMA-IRES-FCY1-TK.将该载体转染LNCaP细胞,用RT-PCR的方法检测其转录,用MTT法检测前体药物5-氟胞嘧啶、丙氧鸟苷单一或联合使用对转染后的LNCaP细胞的杀伤作用.结果: PCR扩增出长1400 bp的PSMA启动子片段,经克隆至pIRES后酶切鉴定证实,并测序表明序列与GenBank(Accession Number AF007544)报道的一致.pPSMA-IRES-FCY1-TK经脂质体转染LNCaP细胞后,RT-PCR检测到FCY1和TK基因在该细胞中均有转录.MTT法检测表明5-FC与GCV联合使用,其细胞生长抑制率明显高于单独使用5-FC,GCV(P<0.05). 结论: pPSMA-IRES-FCY1-TK的双自杀基因体系对前列腺癌细胞LNCaP细胞的杀伤作用,明显优于单自杀基因体系.     

AFP增强子驱动的HSV-TK/GCV自杀基因系统对肝癌细胞杀伤的实验研究

目的 探讨人AFP增强子驱动的单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-TK/GCV)自杀基因系统体外靶向杀伤肝癌细胞效应.方法 构建人AFP增强子驱动的pAFP-CDNA3.1-TK自杀基因真核表达质粒,脂质体转染肝癌细胞,检测TK mRNA和蛋白表达.MTT法检测GCV对肝癌细胞的杀伤作用.结果 成功构建pAFP-CDNA3.1-TK自杀基因真核表达质粒,在AFP阳性HepG2细胞中检测到TK mRNA和蛋白表达,添加GCV 可特异性地杀伤HepG2细胞,而AFP阴性的SMMC7721细胞生长不受影响.结论 AFP增强子驱动的TK/GCV自杀基因系统可以靶向杀伤AFP阳性肝癌细胞.     

前列腺特异性抗原启动子调控促凋亡基因caspase-7载体的构建及其对前列腺癌细胞的特异性杀伤作用

目的：构建前列腺特异性抗原启动子(PSAP)调控的促凋亡基因caspase—7表达载体并观察其对前列腺癌细胞的促凋亡作用．方法：提取基因组DNA，通过PCR法获得前列腺特异性抗原启动子(PSAP)基因，利用基因重组方法以PDAP替换掉pCDNA3真核表达载体中的pCMV启动子，构建PSAP-pCDNA3载体．测序正确后，将PSAP分别替换绿色荧光蛋白载体pIRES2—EGFP和克隆入带有效应型caspase-7基因的绿色荧光蛋白载体pIRES2—EGFP—Csp7中的pCMV启动子片段，分别获得由PSAP启动子调控的绿色荧光蛋白载体和带有效应型Caspase—7基因的真核表达载体PSAP—pIRES2—EGFP—Csp7．利用脂质体转染法将该载体分别转染至PC—3m(前列腺癌)、Hep2(喉癌)及MC3T3(正常成纤维)细胞中，通过荧光显微镜观察转染细胞绿色荧光蛋白表达及细胞形态变化，免疫组化检测细胞中效应型Caspase—7蛋白的表达状况，细胞计数观察转染不同表达载体后各类细胞生长变化．结果：经酶切鉴定及测序结果证实所构建载体正确．转染PSAP—pIRES2—EGFP—Csp7载体后，①在PC—3m细胞中可观察到绿色荧光蛋白的表达，并可检测到效应型Caspase—7蛋白表达，而在Hep2及MC3T3细胞中未观测到绿色荧光，②荧光显微镜下可见前列腺癌PC—3m细胞生长受到抑制并出现凋亡细胞形态，细胞计数证实转染的PC—3m细胞生长受到抑制，而其余细胞生长未受影响．②电镜观察结果显示转染PSAP—pIRES2—EGFP-Csp7后的PC-3m细胞出现典型的凋亡细胞形态．结论：前列腺特异性抗原启动子(PSAP)可在前列腺癌细胞中特异性调控其下游Caspase—7基因的表达，并发挥其促凋亡作用，从而特异性地诱导前列腺癌细胞发生凋亡，而对正常细胞及非前列腺起源细胞不产生影响．     

Construction of Smac gene-containing and human prostate specific antigen promoter-regulated vector and its expression

To construct an eukaryotic expression vector containing Smac gene and study the expression efficiency and specificity of prostate specific antigen（PSA） enhancer/promoter in a possible targeted gene therapy scheme for prostate cancer. Methods： PSA enhancer （PSAE） and promoter （PSAP） sequences were amplified using PCR method. CMV and T7 promoters were deleted from pcDNA3.1-Smac and replaced by the two specific fragments to generate pPSAE-PSAP-Smac. After transfection into different cell lines, the status of cells was observed. And then, we determined the relative concentration of Smac mRNA in RT-PCR. Results： The recombinant plasmid of pPSAE-PSAP-Smac was successfully constructed. And only the prostate cancer cell line PC-3 was suppressed after transfection with pPSAE-PSAP-Smac. However, other nonprostate lines were not. Moreover, the concentration of Smac mRNA regulated by PSA promoter and enhancer was higher in comparison to the CMV promoter-driven control vectors. Conclusion： An expression vector containing the Smac gene （based on elements of the PSA gene regulatory sequences） has been developed and shown to function in prostate cancer cell lines which provides a solid platform for launching clinical studies.     

放射控导正反馈基因环路对肺癌wt-p53基因靶向性表达的研究

目的 构建pE6R4/p53/GFP重组质粒并检测其在人非小细胞肺癌H1299(p53-/-)细胞的辐射诱导表达.方法 用嵌合型增强子E6R4取代pci-neo质粒的CMV增强子,将wt-p53cDNA全长序列、IRES2-EGFP报告基因片段构建于嵌合型增强子E6R4下游,获得pE6R4/p53/GFP重组质粒,采用脂质体法将重组质粒转染人非小细胞肺癌H1299(p53-/-)细胞;采用RT-PCR方法鉴定wt-p53基因整合情况;Western-blot方法检测不同辐射剂量8mV X线照射后,被转染细胞中wt-p53蛋白表达水平和持续时间.结果 酶切和测序鉴定pE6R4/p53/GFP重组质粒构建正确;不同剂量8mV X线照射后,4Gy照射剂量时wt-p53基因表达最强,且持续时间延长.结论 成功将辐射反应元件和正反馈基因环路技术相结合,实现了wt-p53基因的表达调控,为进一步研究非小细胞肺癌的放射-基因联合治疗奠定了基础.     

重组质粒pIRES2-EGFP/CCK的构建及其在仓鼠体内及COS-7细胞中的表达

目的：构建猪源性CCK基因重组真核表达质粒pIRES2-EGFP／CCK（CCK pDNA），研究其在哺乳动物细胞和仓鼠体内的表达。方法：以限制性内切酶法从中介载体pMD18-T／CCK中切取目的片段CCK，将其克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP中，以脂质体法转染COS-7细胞，同时采用直接肌肉注射法免疫仓鼠，利用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达。结果：用CCKpDNA转染COS-7细胞后24，48，72h均可检测到绿色荧光蛋白的表达，其中72h组荧光强度达到最强。用CCK pDNA免疫仓鼠后，第4天注射部位可检测到绿色荧光蛋白的表达，第14天荧光强度明显增强，第42天荧光强度进一步增强，正常对照组始终未检测到绿色荧光蛋白的表达。结论：成功构建了猪源性CCK基因真核表达质粒pIRES2-EGFP／CCK，并成功地在哺乳动物细胞和仓鼠体内进行了表达，为仓鼠胰腺癌的交叉免疫治疗奠定了基础。     

重组质粒pIRES2-EGFP/CCK的构建及其在体内外的表达

目的构建猪源性胆囊收缩素(CCK)基因真核表达质粒pIRES2-EGFP/CCK,并在哺乳动物细胞COS-7中和仓鼠体内进行表达。方法从含CCK的中介载体pMD18-T/CCK中,以限制性内切酶方法获取目的片段,将其克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP中,以脂质体法转染COS-7细胞,利用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,同时采用肌肉注射法免疫仓鼠,了解重组质粒pIRES2-EGFP/CCK的体内表达。结果构建了猪CCK基因的重组真核表达质粒pIRES2-EGFP/CCK,用其转染COS-7细胞后24h、48h、72h均可检测到绿色荧光蛋白的表达,其中72h组荧光强度达到最强。用pIRES2-EGFP/CCK免疫仓鼠后,第4d注射部位可以检测到绿色荧光蛋白的表达,第14d荧光强度明显增强,第42d荧光强度进一步增强,正常对照组始终未检测到绿色荧光蛋白的表达。结论成功构建了猪源性CCK基因真核表达质粒pIRES2-EGFP/CCK,并成功地在哺乳动物细胞COS-7中和仓鼠体内进行了表达,为仓鼠胰腺癌的交叉免疫治疗奠定了基础。     

含HSV-TK基因的真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的　构建AFP增强子CMV启动子调控下的HSV -TK真核表达质粒用于肝细胞癌的靶向基因治疗。方法　采用PCR方法从HepG2细胞基因组DNA中扩增AFP基因增强子最小的功能片断 ,插入pcDNA3.1-LUC质粒的BglII位点 ,从而构建重组表达质粒 pAFP -LUC。HSV -TKcDNA全长序列替换pAFP -LUC质粒中EcoRI位点的LuciferasecDNA全序列构建重组表达质粒 pAFP -TK。质粒 pAFP -LUC采用脂质体法转染AFP阳性的肝癌细胞系HepG2及AFP阴性的非肝癌细胞系HeLa ,用Luciferase分析试剂盒分析Luciferase的表达情况。结果　PCR扩增所得AFP增强子片段的长度和序列通过琼脂糖凝胶电泳、DNA测序得到证实。采用限制性内切酶酶切及PCR方法证实质粒pAFP -LUC中插入的AFP增强子大小、位置及方向均正确。酶切后凝胶电泳分析证实HSV -TK已成功地定向克隆入真核表达载体中。Luciferase报道基因的表达受AFP增强子的调控 ,在AFP阳性肝癌细胞HepG2中高效表达 ,而在AFP阴性的HeLa细胞中表达很低 ,这种差异具有显著性 ,P <0 .0 5。结论　AFP增强子CMV启动子调控的HSV -TK真核表达质粒的构建及其在HepG2细胞中的特异性表达为肝细胞癌的靶向基因治疗提供了实验基础。