胶质瘤中变异型IκBα的表达与抑制肿瘤浸润的研究

目的 探讨变异型IκBα(IκBαM)基因对人类多形性胶质母细胞瘤(GBM)细胞中尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase type PA,uPA)和其受体(uPA-receptor,uPAR)表达的调控作用及其与肿瘤浸润行为的关系.方法 构建质粒、基因转染以及IκBαM蛋白表达筛选,建立稳定表达IκBαM的人类GBM细胞株;用Transwell法测定肿瘤细胞的迁移能力;RT-PCR技术检测细胞内uPA、uPAR在RNA水平的表达;制作裸鼠皮下异位移植瘤生长模型,并采用免疫组化法分析肿瘤组织中uPA和uPAR的表达.结果 Transwell法测定G36△-M组肿瘤细胞的迁移能力明显降低;RT-PCR及肿瘤组化染色结果显示,uPA和uPAR在G36△-M组中的表达显著低于G36△、G36△-W和G36△-P三组,而在后三组间的表达无统计学意义.结论 IκBαM基因在RNA和蛋白水平均可显著降低人类恶性胶质瘤中uPA和uPAR的表达,进而减弱肿瘤细胞的浸润能力,抑制肿瘤组织的浸润.     

NF-κB、IκB、GFAP在脊髓空洞前状态中的表达和作用

目的:脊髓空洞前状态主要表现为脊髓缺血缺氧性水肿,为了探讨其发生的分子生物学机制,观察脊髓组织中的NF-κB、IκB、VEGF、GFAP的表达,探讨它们之间的相互关系。方法:通过枕大池注射Kaolin制作家兔的脊髓空洞症模型,应用免疫组织化学的方法测定不同时间点的脊髓组织中NF-κB、IκB、VEGF、GFAP的表达。结果:Kaolin组动物颈髓组织中,NF—κB表达在术后第1天明显升高,第3天达到高峰,两周时基本恢复正常;IκB各时间点的表达变化与NF-κB成负相关,术后第1天开始明显下降,维持低水平表达至第7天;VEGF主要表达于神经元,神经胶质和血管内皮细胞的胞浆中,术后第1天表达明显增高,第7天达到高峰且维持两周,第3周表达明显减弱,但仍高于正常。GFAP则主要表达于神经胶质细胞,于术后第1天开始升高,但高峰期较VEGF向后延迟至两周并维持到三周仍呈较高水平。结论:在脊髓空洞前状态中,VEGF表达增高,影响BBB的完整性,产生脊髓水肿:GFAP表达增高,代表脊髓组织增强的神经胶质反应。他们二者的高表达同时受NF—κB/IκBα的活性的调节。     

大鼠局灶性脑缺血再灌注后Ref-1、NF-κB及IκB的表达

目的研究大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后Ref-1蛋白、NF-κB及IκB的动态变化。方法采用大脑中动脉线栓法制作局灶性脑缺血再灌注模型,应用免疫组化法检测Ref-1、NF-κB、IκB的动态表达。结果与对照组及假手术组相比,脑缺血再灌注后,随着再灌注时间的延长,Ref-1蛋白、IκB阳性细胞数逐渐减少(P<0.05),NF-κB蛋白阳性细胞数逐渐增加(P<0.05)。结论脑缺血区再灌注损伤可导致Ref-1蛋白酶活性下降、IκB降解,引起NF-κB的激活,进一步导致自由基大量产生,加重了细胞内DNA的损伤,从而促进损伤区的神经元凋亡。     

AMPKα2基因克隆及其野生型和突变型真核表达载体的构建

背景：实验表明,通过激活单磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMP-Activated Protein Kinase, AMPK) α2可以增加胰岛素的敏感性和骨骼肌葡萄糖的摄取,其有望成为预防和治疗2 型糖尿病的新的生理和药理作用靶点。 目的：克隆人的AMPKα2 基因,并构建其野生型和突变型真核表达载体。 设计：单一样本观察。 时间及地点：实验于2007-04/2008-01在中山大学附属第二医院临床分子生物实验室完成。 材料：QuikChange Ⅱ Site-Directed Mutagenesis Kit 为Stratagene公司产品。真核表达载体pcDNA3.1(+),大肠杆菌DH5α为实验室保存。人骨胳肌组织来源于中山大学附属第二医院手术截肢患者,获患者知情同意,新鲜取材后液氮冷冻。 方法: 采用反转录-聚合酶链反应技术从人骨骼肌扩增AMPKα2基因,并将其克隆到T载体,通过测序对其进行鉴定。采用Quickchange定点诱变试剂盒对AMPKα2基因进行体外定点诱变,并将其野生和突变的编码基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1 中,通过酶切和测序进行鉴定。 主要观察指标：①目的基因的克隆。②定点诱变。③真核表达质粒的构建。 结果: 成功克隆了AMPKα2 基因,大小约1 700 bp,与已发表的AMPKα2同源性为99%,GenBank录入号EF056019。成功将AMPKα2第45位Lysine(AAA)突变为Arginine(AGA),成功构建了野生型和突变型pcDNA- AMPK α2 重组质粒。 结论: 实验成功克隆了AMPKα2基因,构建了其野生型和突变型真核表达载体。     

核因子κB及相关基因产物的表达

背景：川芎嗪延缓肝纤维化形成的机制尚不清楚。 目的：观察川芎嗪对肿瘤坏死因子α刺激的肝星状细胞增殖及结缔组织生长因子、核因子κB及其相关基因产物白细胞介素6表达的影响。 方法：体外培养HSC-T6细胞株,取对数生长期的细胞用于实验。实验分为4组：对照组仅加入细胞;TNF-α组加入10 μg/L TNF-α;川芎嗪干预组先加入终浓度为10 μg/L的TNF-α作用30 min后,分别加入川芎嗪50,100,200,400,600, 1 000 mg/L;PDTC组先加入终浓度为10 μg/L的TNF-α作用30 min后,再加入终浓度18 μmol/L的核因子κB阻断剂PDTC。 结果与结论：MTT结果显示100,200,400,600,1 000 mg/L的川芎嗪均能抑制HSC-T6增殖,且呈剂量依赖性。免疫细胞化学染色及Western blot检测发现10 μg/L的肿瘤坏死因子α刺激后,HSC-T6细胞结缔组织生长因子、核因子κB及白细胞介素6的表达明显增多(P < 0.01或P < 0.05),200,400,600 mg/L的川芎嗪及18 μmol/L的PDTC均可明显降低肿瘤坏死因子α刺激后HSC-T6细胞结缔组织生长因子、核因子κB及白细胞介素6的表达(P < 0.01),且随着川芎嗪质量浓度的增加,抑制作用增强,PDTC的抑制作用最明显。相关性分析结果显示HSC-T6细胞结缔组织生长因子和核因子κB的表达呈正相关(r=0.980,P < 0.01)。说明川芎嗪可以抑制肝星状细胞结缔组织生长因子、核因子κB及白细胞介素6的表达,抑制肝星状细胞的增殖。     

米诺环素对脑缺血再灌注大鼠海马CA1区IκB-α、NF-κB p65表达的影响

目的观察米诺环素对脑缺血再灌注大鼠脑组织IκB-α、NF-κB表达的影响,探索米诺环素脑保护作用机制。方法 72只S-D大鼠,随机分为假手术组(NS组)、脑缺血再灌注模型组(IR组)、米诺环素治疗组(MT组),线栓法建立大脑中动脉缺血再灌注模型,采用免疫组织化学法检测大鼠脑组织IκB-α、NF-κB p65的表达。结果相应时间点MT组较IR组IκB-α阳性细胞区灰度值明显增高,NF-κB p65胞核内阳性数明显降低,差别均有统计学意义(P<0.05)。结论米诺环素可以增加大鼠脑缺血再灌注后脑组织IκB-α表达,减少NF-κB的阳性表达,达到脑保护作用。     

人Noggin基因神经细胞特异性反义表达载体的构建

目的：构建具有神经细胞表达特异性的人Noggin基因的反义真核表达载体,以进一步为研究Noggin基因在神经系统发育成熟、功能机制方面的作用。 方法：采用PCR技术克隆出长为0.36kb的人Noggin基因部分序列,在上、下游引物的 5’端分别带上HindIII和XbaI酶切位点。然后将该片段反向插入真核表达载体pCS2＋[Tα1]-GFP。最后对产生的重组子进行琼脂糖凝胶电泳和测序鉴定。 结果：经琼脂糖凝胶电泳鉴定 ,所克隆的0.36kb的目的片段成功地反向连接到pCS2＋[Tα1]-GFP载体上,DNA测序证实插入到载体中的片段为目的片段 结论：成功构建了人Noggin基因的神经细胞特异性反义真核表达载体     

核转录因子κB在颅咽管瘤炎症中的表达

目的探讨NF-κB与颅咽管瘤炎症反应的关系。方法免疫组化SP法检测核转录因子(nuclear factor-κB,NF-κB)的P65亚基、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)在54例颅咽管瘤组织中的表达情况,以及炎症标志物C反应蛋白在成釉细胞型颅咽管瘤患者血清、脑脊液及肿瘤囊液中的检测结果,结合临床资料分析颅咽管瘤与炎症的关系。结果NF-κB(P65亚基)在成釉细胞型中过度表达,经Mann-Whitney U检验分析,成釉细胞型颅咽管瘤的表达显著高于鳞状细胞型颅咽管瘤(Z=-4.532,P0.001)。经Spearman相关分析,在成釉细胞型中NF-κB(P65亚基)与OPN表达程度呈正相关。C反应蛋白在成釉细胞型颅咽管瘤患者肿瘤囊液、脑脊液及血清中明显升高,分别为(4.28±0.90)mg/mL、(0.035±0.006)mg/mL、(1.72±0.54)mg/mL。结论炎症是颅咽管瘤与周围重要结构紧密粘连主要的影响因素,NF-κB与颅咽管瘤炎症的发生密切相关。     

脊髓源星形胶质细胞GFAP表达抑制真核表达载体构建及最佳短发夹样RNA分子筛选

目的构建并筛选大鼠胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）表达抑制短发夹样RNA（shRNA）真核表达载体。方法针对GFAP基因全编码序列设计并合成三对9bp茎环结构、19bp干扰序列特异性shRNA模板，体外定向克隆构建特异性重组质粒真核表达载体；通过体外大鼠脊髓源星形胶质细胞GFAP表达抑制模型，脂质体介导RNA干扰分子转染，实时荧光定量RT—PCR及Wesem blot技术观察RNA干扰后原代星形胶质细胞GFAP表达抑制效果．筛选最佳GFAP表达干扰抑制真核表达载体。结果序列测定证实GFAP—shRNA重组质粒真核表达载体构建成功，三对shRNA模板在mRNA及蛋白表达水平抑制靶基因表达效率分别为81％、63％、56％。结论高效率的GFAP—shRNA真核表达载体在大鼠原代星形胶质细胞GFAP表达抑制模型中能高效抑制GFAP基因表达，为后续多靶点RNA干扰技术在脊髓损伤胶质瘢痕抑制基因治疗中的应用奠定了前期基础。     

变异型IκBα抑制人类多形性胶质母细胞瘤细胞中血管生长因子VEGF及IL-8的表达

目的探讨变异型IκBα(IκBαM)基因对人类多形性胶质母细胞瘤(Glioblastoma multiform,GBM)的细胞生长及其内血管内皮成长因子(VEGF)、白细胞介素-8(IL-8)表达的调控作用。方法通过构建质粒、基因转染以及IκBαM蛋白表达的筛选,建立稳定表达IκBαM的人类GBM细胞株,进而检测转染后细胞的体外生长曲线,并运用Northern blot技术分析细胞内VEGF、IL-8在RNA水平的表达。结果用Western blot法成功筛选了转染的阳性细胞克隆,并发现转染后的人类GBM细胞与对照相比,体外生长曲线无明显差异,但其中VEGF、IL-8在RNA水平的表达量显著降低。结论IκBαM基因对人类GBM细胞中的血管生长因子VEGF、IL-8的表达具有抑制作用。     

颈动脉狭窄动物模型的构建及核因子-κB和胰岛素样生长因子-1的表达

目的 探讨建立经济实用、稳定可靠的适合颈动脉粥样硬化性狭窄外科治疗研究的动物模型的条件.通过测量核因子(NF)-κB、胰岛素样生长因子(IGF)-1的表达,探讨它们在颈动脉粥样硬化性狭窄发生、发展中的作用.方法 日本大耳白兔40只,采用血管内膜气体干燥损伤法在动物的颈总动脉上造成特定条件的损伤(160 ml/min×15 min),然后以特定高脂饲料(饲料中含2%的胆固醇和6%的花牛油)喂养动物不同时间(30、60和90 d).通过血脂测定、DSA、HE染色评价各组动物血管狭窄程度,再观察其病珲改变特点.应用免疫组织化学方法观察NF-KB和IGF-1在动脉粥样硬化斑块中的表达特点.结果 病理检查证实:随着喂养时间的延长,动脉粥样硬化程度加重,高脂喂养加干燥气体损伤90 d时,血管狭窄率达71.53%±3.65%(q=568.417,P=0.000),动脉的粥样硬化病理改变已属较成熟的粥样斑块期.正常血管的内膜和中膜内均未见明显的NF-κB和IGF-1的表达,模型组血管斑块内NF-κB、IGF-1表达呈强阳性,表达面积分别为59.66%±12.04%(t=22.98,P＜0.01)、54.48%±12.92%(t=5.76,P＜0.01),明显高于对照组(分别为8.34%±2.66%和16.38%±8.22%).结论 按本实验方法,90 d时颈动脉狭窄程度和病理改变程度符合颈动脉粥样硬化性狭窄外科治疗的实验研究需要.NF-κB及其靶基因IGF-1的激活与动脉粥样硬化病变的发生和发展密切相关,在颈动脉粥样硬化斑块形成过程中发挥重要作用.     

NF-κB信号通路和脑出血后的继发性脑损伤

核因子Kappa B(Nuclear factor Kappa B,NF-κB)是一种广泛存在于哺乳动物细胞中的转录因子,近年来越来越多的证据表明,它与脑出血后的继发性脑损伤的关系密切。本文从NF-κB的生物学特性出发阐述了NF-κB信号通路在脑出血后继发性脑损伤中的作用及其机制,包括:促进炎性因子IL-1β、ICAM-1等的表达,引发和加重炎症反应;上调MMP-9的表达,破坏血脑屏障,加重血管源性脑水肿;促进细胞凋亡的发生。     

构建胶质原纤维酸性蛋白原核表达载体及蛋白表达鉴定

背景：胶质原纤维酸性蛋白在神经损伤的发生发展过程中具有重要作用。 目的：对胶质纤维酸性蛋白进行基因克隆,构建原核表达质粒并加以鉴定。 设计、时间及地点：单一样本观察,于2008-09/11在上海市长征医院神经外科实验室完成。 材料：中间载体pGEM-T Easy质粒购于Promega 公司,原核表达质粒pGEX-4T-2由上海市长征医院神经外科实验室保存。 方法：从人脑胶质瘤组织提取mRNA, 采用反转录-聚合酶链反应的方法扩增胶质纤维酸性蛋白序列并表达,然后与载体pGEX-4T-2连接,转化宿主菌BL21构建重组质粒,诱导表达后纯化,Western-blot鉴定。 主要观察指标：总RNA鉴定结果,聚合酶链反应扩增产物分子质量的鉴定,重组表达载体的酶切鉴定,Western-blot鉴定。 结果：抽提肿瘤组织总RNA后,电泳清晰可见rRNA28S、18S、5S 3条带。且总RNA的A260nm/A280 nm值为1.903。聚合酶链反应结果显示,在约1 300 bp左右有一条特异性条带,与预期的胶质原纤维酸性蛋白基因大小一致。重组表达载体的酶切鉴定及测序结果与GenBank的胶质原纤维酸性蛋白序列一致,经Western-blot验证为目的蛋白。 结论：用双酶切、DNA测序与Western-blot的方法证实原核表达载体构建成功。     

人NR2B基因真核表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达

目的 克隆人NR2B基因,构建其真核表达载体,获得暂态表达NR2B的CHO细胞.方法 RT-PCR方法克隆人NR2B基因,并插入真核表达载体pcDNA3.1中,将该重组载体转染至CHO细胞.通过RT-PCR、Western blot及间接免疫荧光鉴定细胞中NR2B的表达,通过流式细胞仪检测细胞的凋亡.结果 成功获得人NR2B基因,转染的CHO细胞可检测到NR2B的表达,表达NR2B的CHO细胞并不会凋亡.结论 成功克隆和构建了人NR2B基因的真核表达载体,并在CHO细胞中得到了表达.     

MAGE-3-HSP70融合基因真核表达载体的构建与鉴定

背景：疫苗诱导的抗肿瘤CD8+T细胞反应被认为在增加机体对肿瘤抵抗力方面起重要作用。研究发现,抗原递呈细胞摄取热休克蛋白70与肿瘤相关抗原的融合蛋白,并在MHC I类分子上处理提呈有此热休克蛋白为伴侣的肽后,会启动CD8+细胞毒性T淋巴细胞反应。 目的：构建黑色素瘤抗原3(MAGE-3)、人热休克蛋白70(HSP70)融合基因的真核表达载体。 设计、时间及地点：单一样本观察,于2008-06/12在国家卫生部纳米生物技术重点实验室完成。 材料：pcDNA3.1(-) Vector为BD公司产品,pINCY /MAGE-3,pOTB7/HSP70为Open Biosystems公司产品,DH5α由纳米生物技术重点实验室保存。 方法：设计含Xho Ⅰ酶切位点MAGE-3引物及含Kpn Ⅰ酶切位点人热休克蛋白70引物,以pINCY/MAGE-3 和pOTB7/HSP70为模板扩增黑色素瘤抗原3和人热休克蛋白70基因片段,以基因片段为模板,采用MAGE-3上游引物(含Xho Ⅰ酶切位点)及人热休克蛋白70下游引物(含Kpn Ⅰ酶切位点),PCR扩增MAGE-3-HSP70融合基因片段,KpnⅠ和Xho Ⅰ双酶切并连接至pcDNA3.1(-),转化感受态大肠杆菌DH5α,获得阳性克隆进行双酶切和测序鉴定。 主要观察指标：真核表达载体pcDNA3.1(-)/MAGE-3-HSP70的鉴定。 结果：测序结果显示黑色素瘤抗原3与Gene Bank上公布的序列完全一致, 人热休克蛋白70有3处同义突变。 结论：成功构建MAGE-3-HSP70融合基因真核表达载体。     

大鼠热休克蛋白72基因真核表达载体构建及在COS7细胞中的表达

背景：体外克隆、表达热休克蛋白,尤其正常时少量或不表达,而应激时大量表达的热休克蛋白72对研究其缺血再灌注损伤中的作用尤为重要。 目的：构建热休克蛋白72基因真核表达载体并于COS7细胞内表达,为HSP72蛋白免疫调节功能的研究奠定基础。 方法：采用RT-PCR技术从BABL/C大鼠肝细胞中扩增出热休克蛋白72 cDNA,经限制性核酸内切酶消化后,插入真核表达载体pcDNA3.1(+)的相应酶切位点,并将重组质粒转染COS7细胞,进行基因表达鉴定。 结果与结论：重组质粒插入基因序列检测证实为热休克蛋白72 cDNA,并能在COS7细胞稳定表达。成功构建热休克蛋白72真核表达载体,并于COS7细胞中成功转录与表达。     

核转录因子NF-κB与脑损伤的研究进展

核转录因子NF-κB是具有多向性转录激活功能的调节因子,脑损伤后它在神经系统中广泛高水平表达,与其调控的细胞因子如肿瘤坏死因子α(TNF-α)等一起积极参与炎症反应、神经细胞凋亡等生物进程。同时,NF-κB又具有神经保护作用。因此,如何从分子水平上阻断NF-κB的损伤作用,充分发挥其保护作用,有望成为脑损伤的临床治疗的一个新思路。