NR2B多肽疫苗对神经病理性痛大鼠的镇痛效应

目的 评价NR2B多肽疫苗对神经病理性痛大鼠的镇痛效应.方法 成年雌性SD大鼠,体重180～200 g,制备保留性神经损伤(SNI)模型,7 d后选取SNI模型制备成功的大鼠18只,随机分为3组(n=6),NR2B组沿背部两侧皮下多点注射NR2B多肽疫苗50 μl(含NR2B 100μg)3次,每隔2周注射1次;PBS组和KLH组分别给予PBS 50 μl和匙孔虫戚血蓝蛋白100 μg,均用弗氏佐剂稀释至100 μl.分别于制备SNI前1 d(基础值)、第1次免疫前1 d及第3次免疫后14d时测定机械痛阈;分别于制备SNI前1 d及第3次免疫后14 d时取血清和脑脊液,测定NR2B抗体滴度,然后处死大鼠,取L3-5脊髓组织,其中3只采用免疫组化法测定脊髓背角胶质纤维酸性蛋白表达水平,反映星形胶质细胞激活程度;另外3只采用Western blotting法测定脊髓背角NR2B蛋白表达水平.结果 NR2B组第3次免疫后14 d时血清及脑脊液中均可检测到NR2B抗体,而SNI前1 d时未检测到NR2B抗体,PBS组及KLH组各时点均未检测到NR2B抗体.与基础值比较,各组机械痛阈均降低(P<0.05);与PBS组和KLH组比较,NR2B组第3次免疫后机械痛阈升高,脊髓背角星形胶质细胞激活程度降低,NR2B蛋白表达下调(P<0.05).结论 NR2B多肽疫苗对神经病理性痛大鼠具有镇痛作用,其机制与进入脊髓的NR2B抗体下调了NR2B蛋白表达有关.     

多次鞘内注射CREB反义寡核苷酸对神经病理性痛小鼠脊髓NR2A表达的影响

目的 评价多次鞘内注射cAMP反应元件结合蛋白(CREB)反义寡核苷酸对神经病理性痛小鼠脊髓含2A亚基的NMDA受体(NR2A)表达的影响.方法 鞘内置管成功的C57BL/6雄性小鼠40只,体重20 ～ 25 g,采用随机数字表法,将其随机分为4组(n=10):生理盐水组(NS组)、CREB同义寡核苷酸组(S组)、CREB错义寡核苷酸组(M组)和CREB反义寡核苷酸组(A组).采用结扎坐骨神经的方法制备小鼠神经病理性痛模型,结扎坐骨神经后第1～6天,4组分别鞘内注射生理盐水5μl、同义寡核苷酸5 μg/5μl、错义寡核苷酸5μg/5μl、反义寡核苷酸5μg/5μl,1次/d.于术前1d、造模后1、3、5、7d时测定小鼠结扎侧足底的机械缩足阈值(PWMT)和热辐射刺激潜伏期(PWTL).于结扎坐骨神经后7、14 d时各取5只小鼠断头处死,取L3～5脊髓,采用Western blot和RT-PCR法测定NR2A的表达水平.结果 与基础值相比,A组小鼠结扎坐骨神经1～7d时PWMT和PWTL差异无统计学意义(P＞0.05),NS组、S组和M组PWMT和PWTL降低(P＜0.05).与NS组、S组和M组相比,A组小鼠结扎坐骨神经后7、14 d时脊髓NR2A mRNA和蛋白表达下调(P＜0.05).与结扎坐骨神经后7d时相比,4组结扎坐骨神经后14 d时小鼠脊髓NR2A mRNA和蛋白表达上调(P＜0.05).结论 在神经病理性疼痛形成阶段多次鞘内注射CREB反义寡核苷酸可减轻神经病理性痛,其机制可能与抑制脊髓NR2A表达有关.     

rAd5/NR2B镇痛疫苗对神经病理性痛大鼠认知功能的影响

目的 评价N-甲基-D天冬氨酸受体2B亚基(NR2B)基因重组腺病毒(rAd5/NR2B)对神经病理性痛大鼠认知功能的影响.方法 雌性SD大鼠40只,体重180～200 g,随机分为4组(n=10):对照组(C组)、rAd5/NR2B镇痛免疫组(rAd5/NR2B组)、神经病理性痛组(SP组)和rAd5/NR2B镇痛疫苗+神经病理性痛组(rAd5/NR2B+SP组).C组和rAd5/NR2B组分别胃内灌注生理盐水0.1 ml和rAd5/NR2B镇痛疫苗1×10~8 PFU,2周后重复灌注.SP组制备神经病理性痛模型,1周后腹腔注射生理盐水0.1 ml.rAd5/NR2B+SP组胃内灌注rAd5/NR2B镇痛疫苗1×10~8 PFU,2周后重复灌注,再1周后制备神经病理性痛模型.测定大鼠机械缩爪阈值(MWT).行Morris水迷宫实验测定大鼠认知功能,记录潜伏期和游泳速度.采用免疫组织化学法检测大鼠海马NR2B的表达水平.结果 (1)与C组比较,rAd5/NR2B组MWT差异无统计学意义(P＞0.05),SP组和rAd5/NR2B+SP组MWT降低(P＜0.05);与SP组比较,rAd5/NR2B+SP组MWT升高(P＜0.05).(2)各组游泳速度比较差异无统计学意义(P＞0.05);与C组比较,rAd5/NR2B组潜伏期差异无统计学意义(P＞0.05),SP组和rAd5/NR2B+SP组潜伏期延长(P＜0.05);与SP组比较,rAd5/NR2B+SP组潜伏期差异无统计学意义(P＞0.05).(3)与C组比较,rAd5/NR2B组和rAd5/NR2B+SP组海马NR2B表达差异无统计学意义(P＞0.05),SP组海马NR2B表达上调(P＜0.05);与SP组比较,rAd5/NR2B+SP组海马NR2B表达下调(P＜0.05).结论 rAd5/NR2B疼痛疫苗对神经病理性痛大鼠认知功能无明显影响.     

姜黄素对神经病理性痛大鼠脊髓背角及背根神经节神经元大麻素受体1和NR2B表达的影响

目的 探讨姜黄素对神经病理性痛大鼠脊髓背角及背根神经节(DRG)神经元大麻素受体1 (CBR1)及含NR2B亚基N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体表达的影响.方法 雄性SD大鼠72只,体重200～230 g,采用随机数字表法,将其随机分为4组(n=18):假手术组(S组)、慢性压迫性损伤组(CCI组)、姜黄素组(Cur组)和溶媒对照组(SC组).S组仅分离、暴露坐骨神经,其余3组采用慢性压迫性损伤法制备神经病理性痛模型.Cur组术后腹腔注射姜黄素100 mg·kg-1·d-1,连续14 d,SC组给予等容量二甲基亚砜.分别于术前2d、术后1、3、7、10、14 d时测定机械缩足反应阈值(MWT)和热缩足潜伏期(TWL).分别于术后3、7、14 d时处死6只大鼠,取脊髓背角和DRG,采用免疫组化法检测神经元CBR1和NR2B的表达.结果 与S组比较,其他3组术后MWT降低,TWL缩短,脊髓背角和DRG神经元CBR1和NR2B表达上调(P＜0.05);与CCI组比较,Cur组术后MWT升高,TWL延长,脊髓背角和DRG神经元CBR1表达上调,NR2B表达下调(P＜0.05),SC组上述指标差异无统计学意义(P＞0.05).结论 姜黄素可减轻大鼠神经病理性痛,其机制与脊髓背角及DRG神经元CBR1表达上调、NR2B表达下调有关.     

鞘内注射P300 siRNA对神经病理性痛大鼠的镇痛效果

目的 评价鞘内注射p300小干扰RNA(p300siRNA)对神经病理性痛大鼠的镇痛效果.方法 取鞘内置管成功的雄性SD大鼠96只,采用坐骨神经慢性压迫性损伤法(CCI)建立神经病理性痛模型,随机分为4组(n=24):假手术+生理盐水组(S组)、CCI+生理盐水组(CCI组)、CCI+转染试剂组(V组)和CCI+p300siRNA组(P组).于术后3～6 d时鞘内注射生理盐水、转染试剂或p300siRNA(siRNA 4μg溶于转染试剂)各20μl,2次/d,10μl/次,连续4 d.于术前1 d(基础状态)、术后1、3、5、7、9、11、14 d时测定机械痛阈和热痛阈;于术后3、7、14 d时取腰段脊髓,测定p300蛋白及其mRNA、乙酰化组蛋白H3(Ac-H3)的表达.结果 与基础值比较,CCI组、V组和P组术后各时点机械痛阈和热痛阈降低(P＜0.05).与S组比较,其余各组机械痛阈和热痛阈降低,p300蛋白及其mRNA和Ac-H3蛋白表达上调(P＜0.05).与CCI组比较,P组机械痛阈和热痛阈升高,p300蛋白及其mRNA和Ac-H3蛋白表达下调(P＜0.05).结论 鞘内注射p300 siRNA可减轻大鼠神经病理性痛,其机制与抑制脊髓p300和Ac-H3蛋白的表达有关.     

水溶性脂聚体可运载N-甲基-D-天冬氨酸受体2B小干涉RNA治疗慢性炎性疼痛

目的 慢性炎性疼痛的基因治疗缺乏安全且高效的载体,本实验探讨了低分子量聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)和胆固醇组成的水溶性脂聚体(water-soluble lipopolymer,WSLP)运载N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基(N-Methyl-D-aspartic acid receptor 2B,NR2B)小干涉RNA(small interfering RNA,siRNA)治疗大鼠慢性炎性疼痛的可行性. 方法 将WSLP直接与靶向NR2B的siRNA连接形成WSLP/siRNA复合物,乱序siRNA作为对照(WSLP/scRNA);然后检测鞘内注射WSLP/siRNA对完全弗氏佐剂(freund's adjuvant complete,CFA)炎性痛模型大鼠脊髓背角(spinal cord doral horn,SCDH)NR2B蛋白表达的影响,并且测定鞘内注射此复合物后炎性痛大鼠机械缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold,MWT)及热缩足反射持续时间(thermal withdrawal duration,TWD)的变化. 结果 WSLP/siRNA注射后3d,炎性疼痛大鼠SCDH NR2B蛋白水平的表达与CFA组比较显著下降58％(P＜0.01),WSLP/scRNA及PEI/siRNA注射后NR2B的表达无明显变化(P＞0.05).WSLP/siRNA鞘内注射后3、4d及5d炎性痛大鼠的MWT [(3 d:(9.2±1.3);4 d:(9.8±1.2);5 d:(9.5±1.2)]较CFA组[(3 d:(4.6±1.2);4 d:(4.9±1.8);5 d:(5.0±1.8)]显著增高(P＜0.01),TWD[(3 d:(3.27±0.32)s;4 d:(3.83±0.49)s;5 d:(3.57±0.33)s]较CFA组[(3 d:(6.71±0.45)s;4 d:(6.97±0.54)s;5 d:(6.63±0.38)s]显著缩短(P＜0.01),WSLP/scRNA及PEI/siRNA均无此治疗作用(P＞0.05). 结论 WSLP可有效运载siRNA抑制CFA所致慢性炎性痛大鼠NR2B的过度表达,从而对炎性疼痛大鼠具有治疗作用.     

NMDA受体2B亚基模拟表位对慢性神经病理性痛大鼠的镇痛效应

目的 评价N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基(NR2B)模拟表位对慢性神经病理性痛大鼠的镇痛效应.方法 成年雄性SD大鼠25只,体重200-250 g,随机分为5组(n=5),C组不进行任何处理;神经损伤(SNI)组行左后肢保留性SNI术;NR2B单纯免疫组(pNR2B组)于皮下两点注射携带NR2B模拟表位的特异性噬菌体(pNR2B)4×1012 pfμ/ml,每点100 μl,间隔1周后重复注射,共重复2次;无关噬菌体+SNI组(pSNI组)和pNR2B+SNI组(pNR2B/SNI组)于相应时点分别注射无关噬菌体或携带NR2B模拟表位的pNB2B,于首次注射后1周时行左后肢SNI术.持续观察大鼠痛行为学,分别于SNI术前1 d、术后1 d、1、2和3周测定左后爪机械刺激缩足反应阈值(MWT).首次注射后4周,采用间接ELISA法测定血清NR2B抗体和噬菌体抗体水平.结果 与C组和pNR2B组比较,SNI组和pSNI组术后1 d出现痛行为学症状,MWT降低,并持续至术后3周;pNR2B/SNI组术后1 d、1、2周痛行为学症状无明显缓解,术后3周痛行为学症状明显缓解,MWT差异无统计学意义(P＞0.05).与SNI组和pSNI组比较,pNR2B/SNI组术后1周痛行为学症状明显缓解,MWT升高,持续至术后3周.pNR2B组、pSNI组和pNR2B/SNI组血清噬菌体抗体水平高于C组和SNI组(P＜0.05),pNR2B组和pNR2B/SNI组血清NR2B抗体水平明显高于其他3组(P＜0.05).结论 NR2B模拟表位通过诱导SNI致慢性神经病理性痛大鼠产生NR2B抗体,产生明显的镇痛效应.     

艾芬地尔预先给药对CCI大鼠脊髓NMDA受体NR2B亚基表达的影响

目的探讨艾芬地尔预先给药对坐骨神经慢性压榨性损伤(CCI)大鼠脊髓背角NR2B亚基表达的影响及其对神经病理性疼痛的预防作用。方法雄性SD大鼠50只,体重180～200 g,随机分为3组:假手术组(n=10)、CCI组(n=20)和艾芬地尔组(n=20)。建立CCI动物模型,假手术组大鼠仅分离坐骨神经,但不结扎神经。艾芬地尔组大鼠在术前30 min及术后1、2 d连续3 d腹腔内注射艾芬地尔(10 mg/kg);CCI组大鼠腹腔内注射相同体积的生理盐水;假手术组未给药。各组均于术前,假手术组于假手术后3 d、艾芬地尔组和CCI组均于CCI术后7、14 d分别取10只大鼠,以von Frey纤维测定机械痛阈,随后断头处死,取患侧L4.5脊髓背角组织,采用Western blot方法测定NR2B亚基的蛋白表达。结果各组术前基础机械痛阈比较差异无统计学意义(P>0.05)。与假手术组比较,CCI组术后7、14 d时机械痛阈降低(P<0.05),艾芬地尔组术后7、14 d时差异无统计学意义(P>0.05);与CCI组比较,艾芬地尔组术后7、14 d时机械痛阈升高(P<0.05)。与假手术组相比,艾芬地尔组和CCI组术后7、14 d时脊髓背角NR2B蛋白表达均升高(P<0.05);与CCI组比较,艾芬地尔组术后7、14 d时脊髓背角NR2B蛋白表达降低(P<0.05)。结论大鼠腹腔内预先注射艾芬地尔,通过特异性地拮抗含NR2B亚基NMDA受体,可有效地预防CCI导致的神经病理性疼痛,其机制与降低脊髓背角NR2B亚基表达升高有关。     

孕早期安氟醚麻醉对大鼠子代海马NR2B表达的影响

目的 评价孕早期安氟醚麻醉对大鼠子代海马N-甲基-D-天冬氨酸受体2B亚基(NR2B)表达的影响.方法 孕8～10 d SD大鼠30只,体重200～250 g,采用随机数字表法,将其随机分为3组(n=10):对照组(C组)、吸入安氟醚4h组(E1组)和吸入安氟醚8h组(E2组).E1组和E2组分别吸入1.7％安氟醚4和8h,氧流量为2 L/min,C组吸入等流量氧气.分别于出生后20和30d,采用Morris水迷宫系统测定子鼠的认知功能.于水迷宫实验结束后第2天,取各组子鼠海马组织,分别采用PCR和免疫组化法测定NR2B mRNA及蛋白的表达.结果 与C组比较,E1组和E2组子鼠出生后20和30 d时逃避潜伏期延长,穿越平台次数减少,平台象限停留时间缩短(P＜0.05),海马NR2B mRNA及蛋白表达下调(P＜0.05);与E1组比较,E2组子鼠出生后20和30 d时海马NR2B mRNA及蛋白表达比较差异无统计学意义(P＞0.05).结论 孕早期安氟醚麻醉可降低大鼠子代的认知功能,其机制与抑制大鼠子代海马NR2B表达有关.     

切口痛-瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓总蛋白及膜蛋白NMDA受体NRl 、NR2A及NR2B亚基表达的变化

目的 评价切口痛-瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓总蛋白及膜蛋白NMDA受体NR1、NR2A及NR2B亚基表达的变化.方法 尾静脉置管成功的雄性SD大鼠32只,体重240～260 g,月龄2～3月,采用随机数字表法,将大鼠随机分为4组(n=8):对照组(C组)静脉输注等容量生理盐水60 min,瑞芬太尼组(R组)静脉输注瑞芬太尼1.2μg·kg-1·min-1 60 min;切口痛组(I组)建立切口痛模型,同时静脉输注等容量生理盐水60 min;瑞芬太尼+切口痛组(R+I组)建立切口痛模型,同时静脉输注瑞芬太尼1.2 μg· kg-1 ·min-1 60 min.于生理盐水或瑞芬太尼给药前24h、给药后2、6、24和48 h时测定机械刺激缩足阈值(PWT)和热刺激缩足潜伏期(PWL),最后一次测定痛阈后处死取脊髓L4～6节段,采用Western blot法测定脊髓总蛋白及膜蛋白NMDA受体NR1、NR2A及NR2B亚基的表达,并计算膜蛋白中NR2B/NR2A比值.结果 与C组比较,I组、R组和R+I组PWT降低,PWL缩短,总蛋白及膜蛋白NMDA受体NR1和NR2B亚基表达上调,膜蛋白中NR2B/NR2A比值增加(P＜0.05).与R组和I组比较,R+I组PWT降低,PWL缩短,总蛋白及膜蛋白NMDA受体NR1和NR2B亚基表达上调,膜蛋白中NR2B/NR2A比值增加(P＜0.05).各组总蛋白及膜蛋白NMDA受体NR2A亚基表达差异无统计学意义(P＞0.05).结论 大鼠切口痛-瑞芬太尼痛觉过敏的形成可能与脊髓总蛋白及膜蛋白NMDA受体NR1和NR2B亚基表达上调和膜蛋白中NMDA受体NR2B亚基组成比例的增加有关.     

CREB结合蛋白质在神经病理性痛大鼠脊髓COX-2表达中的作用

目的 评价CREB结合蛋白质(CBP)在神经病理性痛大鼠脊髓COX-2表达中的作用.方法 雄性SD大鼠40只,体重220 ～ 250 g,鞘内置管成功后5d时采用坐骨神经慢性缩窄性损伤的方法制备大鼠神经病理性痛模型,采用随机数字表法,将其随机分为4组(n=10):假手术组(Sham组)、神经病理性痛组(NP组)、阴性对照病毒载体组(NC组)和CBP组.NC组和CBP组制备模型后7d时分别鞘内注射阴性对照病毒载体(RNAi-NC-LV)、CBPshRNA病毒载体(CBP RNAi-LV)20μl.于术前1d、术后3、5、7、10、12、14 d时测定大鼠术侧机械缩足反应阈值(MWT)和热缩足潜伏期(TWL).于术后14 d时取腰段脊髓,免疫组化法检测CBP、乙酰化组蛋白H3/H4(Ac-H3,Ac-H4)、COX-2蛋白的表达,RT-PCR法检测CBP、COX-2 mRNA的表达.结果 与Sham组比较,NP组、NC组和CBP组大鼠术后各时点术侧MWT和TWL降低,NP组和NC组大鼠术后14 d时脊髓CBP、Ac-H3、Ac-H4、COX-2蛋白表达和CBP、COX-2 mRNA表达上调(P＜0.05),CBP组上述各指标差异无统计学意义(P＞0.05);与NP组比较,CBP组术后10、12和14 d时MWT和TWL升高,术后14 d时脊髓CBP、Ac-H3、Ac-H4、COX-2蛋白表达和CBP、COX-2 mRNA表达下调(P＜0.05).结论 CBP表达上调导致组蛋白H3、H4乙酰化水平升高,脊髓神经元COX-2表达上调,参与了神经病理性痛的形成.     

脊髓NMDA受体在大鼠糖尿病神经病理性痛中的作用

目的 评价脊髓NMDA受体在大鼠糖尿病神经病理性痛中的作用.方法 雌性Wistar大鼠,月龄3月,体重180～220 g,腹腔注射链脲菌素65 mg/kg制备糖尿病大鼠神经病理性痛模型.取模型制备成功的大鼠96只,随机分为3组(n=32):糖尿病神经病理性痛组(D组)、p38MAPK抑制剂组(I组)和NMDA受体阻断剂组(M组),另取32只正常大鼠作为对照组(C组).模型制备成功后每周一上午,I组和M组分别腹腔注射p38MAPK抑制剂SB203580 1 mg/kg、NMDA受体阻断剂MK-8011 mg/kg,1次/周,直至处死大鼠.各组分别于模型制备成功后第1、3、5、7周(T1～4)末随机取8只大鼠,采用yon Frey纤维丝测定双后足机械缩足反应阚值(MWT),采用肌电图仪测定左侧坐骨神经传导速度(NCV)后处死大鼠;取L3～6的背根神经节和脊髓,采用免疫组化法和Western blot法检测p38MAPK磷酸化水平,采用RT-PCR法检测NMDA受体1(NR1)mRNA表达.结果 与C组比较,D组、I组和M组T1～4时MWT降低,NCV减慢,p38MAPK磷酸化水平升高,NR1 mRNA表达上调(P<0.05);与D组比较,I组和M组MWT升高,NCV加快,T2～4时I组和M组p38MAPK磷酸化水平降低,M组NR1 mRNA表达下调(P<0.05).结论 脊髓NMDA受体激活可能通过p38MAPK信号通路参与大鼠糖尿病神经病理性痛的维持.     

神经肽Y2受体在大鼠神经病理性痛中的作用

目的 探讨神经肽Y2受体(NPY2R)在大鼠神经病理性痛中的作用.方法 SPF级雄性SD大鼠36只,8周龄,体重190～ 210 g,采用随机数字表法,将其分为3组(n=12):假手术组(S组)、神经病理性痛组(NP组)和NPY2R反义寡核苷酸组(ODN组).NP组和ODN组采用坐骨神经慢性压迫法制备神经病理性痛模型.术后7d时ODN组鞘内注射5μg/μlNPY2R反义寡聚核苷酸30 m.分别于术前3 d(T0,基础状态)、术后7 d(T1)、鞘内给药后15 min、1.5、3.0、4.5、6.0 h(T2-6)时测定机械痛阈和冷痛阈,然后处死大鼠,取L4-6脊髓组织,采用免疫荧光法测定脊髓背角神经元NPY2R、降钙素基因相关肽(CGRP)的表达和二者共表达(NPY2R/CGRP)水平.结果 与S组比较,NP组和ODN组T1.时机械痛阈降低,冷痛阈升高,脊髓背角神经元NPY2R、CGRP表达上调(P＜0.05);与NP组比较,ODN组T3-5时机械痛阈升高,脊髓背角神经元NPY2R和NPY2R/CGRP表达下调(P＜0.05),冷痛敏和脊髓背角神经元CGRP表达差异无统计学意义(P＞0.05).结论 脊髓背角神经元NPY2R参与了大鼠神经病理性痛的机械痛觉过敏维持,而未参与冷痛觉过敏维持.