肝癌单克隆抗体亲和常数测定及其在体内的导向意义

单克隆抗体的亲和常数反映了抗体的亲和力及其靶抗原分布的位点和密度,是选择具有导向意义的抗肿瘤单抗的重要依据。本文报告肝癌单抗HAb18亲和常数的测定及其在导向诊断中的意义。 取HAb18 IgG单抗,采用高效碘标法,参照Hayes DF等法,取标记抗体起始浓度     

肝癌相关膜蛋白抗原HAg18的研究与血清学意义及应用

单克隆抗体亲和化学的发展,使得未知复杂的肿瘤抗原纯化为单一抗原,从而获得一些新的、较为特异的肿瘤标志物。本文报告肝癌单抗HAb18相应抗原HAg18的分离纯化以及在血清学中的意义和应用。 参照Dalchau等法,肝癌组织经电动捣碎、超声粉碎,加Nonidet p40,高速离心提取粗制膜蛋白抗原。粗抗原进一步过单抗HAb18亲和层析柱,用3mol/L硫氰酸钾解离得到纯抗原。经SDS-PAGE和免疫印迹分析,其抗原活性条带(单带)为61kD。     

肝癌单克隆抗体HAb18在人体肝癌导向诊断中的意义和应用

近年,肿瘤单抗的导向研究已取得较大进展,尤其是放射免疫诊断(RIAD)取得了令人鼓舞的成功。本文用放射性碘标记肝癌膜蛋白单抗HAb18IgG及其F(ab’)2片段,对     

肝癌相关抗原HAg18的研究及其应用

用抗人肝癌单克隆抗体HAb18亲和层析纯化相应抗原,经SDS-PAGE及免疫印迹试验证实其分子量为61kD。抗原活性条带经高碘酸钠氧化及氯仿-甲醇-冰乙酸处理抗原无丢失,但经胰蛋白酶酶解后失活。PAS及苏丹Ⅲ染色均为阴性。用HAb18ELISA双抗体夹心法可检测肝癌病人血清中抗原水平,阳性率为65.1％(250/384)。HAb18配伍另一肝癌单克隆抗体,制成ELA快速诊断盒,肝癌检出率提高至70.6％(271/384)。免疫酶斑点测定HAg18与AFP、铁蛋白、C-EA无交叉。故认为HAb18是一新的肝癌蛋白性抗原。     

HAb18G/CD147拮抗肽对肝癌细胞表面抗原HAb18G的亲和性

目的：研究HAb18G／CDl47拮抗肽对肝癌细胞上HAb18G／CDl47抗原的亲和性。方法：利用流式细胞仪测定人肝癌细胞(HHCC，SMMC7721)上HAbl8G抗原的表达。分别在HAb18G／CDl47拮抗肽AP—1、AP—2和AP-6的N端标记生物素，用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜测定AP—1、AP—2和AP-6与HHCC或SMMC7721的结合能力。结果：HAbl8G抗原在HHCC和SMMC7721细胞上均呈高表达。AP-6对HHCC的亲和力最强，AP—2次之，AP—1最弱。AP-6对与SMMC7721的亲和力也最强，AP—1次之，AP—2末检测到。结论：HAb18G／CDl47拮抗肽对肝癌细胞表面抗原HAb18G／CDl47具有较高的亲和性。     

不同免疫方案制备抗HAb18G/CD147胞外区多克隆抗血清的比较

目的: 制备针对肝癌相关抗原HAb18G/CD147胞外区不同表位的抗血清, 比较不同免疫方案的免疫效果。方法: 以原核表达的GST -HAb18GEF融合蛋白、重组真核表达质粒pcDNA3 /HAb18G及HCC细胞为免疫原, 分别采用蛋白常规免疫、DNA肌肉免疫及pcDNA3 /HAb18G -HCCbooster(DNA -cellbooster)免疫接种BALB/c小鼠。采用间接ELISA和细胞ELISA, 同时测定免疫血清中抗变性和天然HAb18GEFIgG抗体的滴度和Ig亚类。用Westernblot检测各免疫方案制备的抗血清, 与变性HAb18GEF抗原结合的特异性。用免疫荧光法验证DNA- cellbooster免疫接种法制备的抗血清, 与细胞膜上天然HAb18G抗原的结合特异性。结果:以GST- HAb18GEF常规免疫后, 可诱导高滴度的IgG1抗体产生, 但针对的多为HAb18GEF的变性或线性表位; 以pcD -NA3 /HAb18G肌肉免疫后, 可诱导针对其天然表位的IgG2a抗体产生, 但滴度较低; 以DNA -cellbooster免疫后, 可诱导中等滴度、针对其天然表位的IgG2a和IgG1抗体产生。结论: 不同免疫方案可诱导针对HAb18GEF不同表位、不同滴度的多克隆抗血清, 为淘筛针对其不同表位的多样性抗体奠定了基础。     

碘标记肝癌单克隆抗体对裸鼠肝癌移植瘤导向治疗的意义和观察

本文报告用~(131)I标记肝癌单克隆抗体HAb18、及其F(ab’)2片段对裸鼠移植瘤导向治疗的观察,具有明显的杀伤效应,其效果优于国外同类抗体。 同位素标记与显像 用~(131)I标记HAb8、18IgG及其F(ab’)2片段,全部采用氯胺T碘化法,标记率:51％比活性:9.58×10~4Bq/μg。抗体与肝癌细胞在体外的亲和率:IgG—70％,F(ab’)2—55％。尾静脉注入碘标记物后,荷瘤裸鼠肿瘤部位明确显像。其定位指数;IgG—3.09,F(ab’)2—6.99。 实验分组与治疗12只荷瘤肝癌裸鼠(SMMU—LTNM)分4组,实验前服用0.25％     

肝癌单克隆抗体-柔红霉素结合物的制备及其选择性细胞毒作用的研究

我室研制的HAb18单克隆抗体特异性高,免疫组化肝癌阳性率80％,在荷肝癌裸鼠及肝癌病人体内显像均良好。以HAb18与柔红霉素(DAU)连续制备了HAb18-Dextran-DAU免疫抗癌药物。经检测,H-Ab18-Dex-DAU结合物中抗体仍保持其特异性结合能力,证明制备过程中抗体活性未受到明显损伤;48h细胞毒性试验显示结合     

肝癌单克隆抗体HAb18-氨甲喋呤结合物的制备及其细胞毒作用的研究

本文报道肝癌单抗HAb18与氨甲喋呤结合物的制备方法及其选择性细胞毒作用。结果表明,在交联过程中,抗体与药物活性均较好保存,交联物对人肝癌靶细胞显示较强的选择性杀伤作用。     

抗人肝癌单克隆抗体HAb18 Fab基因的克隆和表达

目的：克隆抗人肝癌单抗(mAb)HAb18的Fab基因，并在大肠杆菌中表达。方法：采用RT-PCR法，利用设计的引物扩增mAb Fd和κ链全长基因，并分别克隆到T载体中进行序列分析。然后，亚克隆到原核表达载体pComb3中，转化感受态大肠杆菌后以IPTG诱导表达。采用ELISA和免疫荧光法检测表达产物的特异性。结果：克隆了mAb HAb18的Fab基因，并在大肠杆菌中获得表达。竞争性ELISA和免疫荧光检测证实，表达产物具有与相应抗原特异结合的活性。结论：成功地构建了抗人肝癌小分子Fab抗体，为其进一步在肝癌诊断与治疗中的应用奠定了基础。     

抗经干扰素处理的SMMC7721肝癌细胞系单克隆抗体HAb23的制备

作者将经人α-干扰素处理的SMMC7721肝癌细胞系作为抗原免疫小鼠,通过细胞融合,筛选得到一株具有分泌一定特异性的抗肝癌单克隆抗休HAb23细胞株,经亚类鉴定HAb23为IgG1。HAb23细胞株性质稳定。在体外连续培养3个月均有抗体分泌。将冻存的HAb23细胞复苏,其克隆的阳性率保持100％。对30例肝细胞性肝癌及其它组织进行免疫组化染色,其中25例肝癌呈阳性,阳性率达83.3％,正常肝组织、肝炎、肝硬化组织均为阴性。     

构建EpoR/LR-F3/HAb18GEF嵌合受体并在HEK293-16工程细胞株中定点整合表达

目的:构建EpoR/LR-F3/HAb18GEF嵌合受体,并在HEK293-16工程细胞株中定点整合表达。方法:用PCR法扩增肝癌相关抗原HAb18G胞外段基因,SacI/NotI双酶切后插入真核表达载体pCEL2f中,构建EpoR/LR-F3/HAb18GEF嵌合受体基因的重组表达载体pCEL2f/HAb18GEF,并经酶切和测序验证。将此重组表达载体与POG44载体(按1∶9的比例混合后),在阳离子脂质体介导下共转染HEK293-16工程细胞,用潮霉素B筛选定点整合表达EpoR/LR-F3/HAb18GEFcDNA的细胞克隆。用间接免疫荧光染色法、流式细胞术及Zeocin致死试验,检测并验证稳定表达株中EpoR/LR-F3/HAb18GEF嵌合受体的表达。结果:成功地构建pCEL2f/HAb18GEF真核重组表达载体,共转染后EpoR、HAb18GEF均高效表达于转染的HEK293-16细胞的胞膜上。经潮霉素B筛选得到12株可融合高表达EpoR/LR-F3/HAb18GEF的稳定株,其表达EpoR的阳性率为99.93%,平均荧光强度(MFI)为1036.39,表达HAb18GEF的阳性率为99.51%,MFI为652.72,且可被Zeocin致死。结论:成功地建立了表达EpoR/LR-F3/HAb18GEF嵌合受体的HEK293-16工程细胞株,为进一步利用哺乳动物蛋白质-蛋白质相互作用陷阱(MAPPIT)系统筛选HAb18G的作用受体奠定了基础。     

HAb18G/CD147在食管鳞状细胞癌中的表达及其临床意义

目的:探讨HAb18G基因产物表达与食管鳞状细胞癌(ESCC)临床病理特征及预后的关系。方法:应用免疫组化SP染色法分析了108例食管鳞状细胞癌标本中HAb18G基因产物表达情况和定位,并对其进行了术后3年随访。结果:HAb18G基因产物在有淋巴结癌转移和预后差的食管鳞状细胞癌病例中高表达;HAb18G的高表达与食管鳞状细胞癌的浸润转移、分化程度均相关(P<0.05);淋巴结转移和HAb18G表达可作为食管鳞状细胞癌患者预后独立指标。结论:HAb18G在食管鳞状细胞癌中的表达与食管癌的发生发展、浸润转移和预后密切相关,可作为临床预测浸润转移和估计预后的一个重要参考指标。     

131I-HAb18F(ab'')2在肝癌病人体内的生物学分布

24例原发性中晚期肝癌 ,用 L ugol氏液封闭甲状腺和肝胶体显像后 ,行肝动脉插管 ,经导管按 0 .5、0 .75、1.0 m Ci/ kg3个计量组给予 1 31 I- HAb18F(ab') 2 。给药后分别于 10、4 8、96、192 h再进行全身 SPECT动态显像 ,观察 1 31 I- HAb18F(ab') 2 在人体内的分布。结果显示肝癌组织中 1 31 I- HAb18F(ab') 2 明显高于其它脏器 ,且随时间延长而浓聚 ,正常肝组织和其它脏器内放射性浓聚无明显升高。研究说明 1 31 I- HAb18F(ab') 2 在人体内稳定性较好 ,与肝癌细胞能发生特异性牢固结合 ,是值得进一步研究的治疗肝癌的一类新药     

抗人HAb18G分子单链抗体基因的构建及在大肠杆菌中的分泌表达

目的 :构建抗人HAb18G分子单链抗体基因 ,并在大肠杆菌中进行分泌表达。方法 :通过连接肽 (Gly4Ser) 3基因序列将已成功克隆的抗人肝癌单抗HAb18轻、重链可变区基因拼接成单链抗体 (ScFv)基因 ,并在 5′和 3′端引入相应的酶切位点 ,克隆至改造的分泌性表达载体pCANTAB 5His之中 ,转化到E coliHB2 15 1中进行诱导表达。亲和层析纯化表达蛋白后 ,以SDS PAGE电泳、Westernblot及ELISA等方法分析检测表达产物。结果 :经限制性酶切鉴定及DNA测序分析 ,证实基因构建正确。SDS PAGE电泳和Westernblot分析表明ScFv基因在大肠杆菌中成功表达。表达产物的相对分子质量 (Mr)为 31kD ,与理论预期值相符 ,并且可与相应的抗原特异结合。结论 :成功实现了抗人HAb18G分子单链抗体的原核分泌表达 ,为其在人肝癌诊治中的进一步应用奠定了基础。     

肝癌细胞内HAb18G/CD147信号转导通路关键分子的筛选北大核心CSCD

目的筛选肝癌细胞内HAb18G/CD147信号转导通路中差异表达的关键分子。方法提取SMMC-7721细胞和T7721细胞(SMMC-7721经稳定转染并高表达HAb18G/CD147的肝癌细胞),应用信号转导相关基因芯片筛选两种肝癌细胞内差异表达的关键分子。结果基因芯片结果显示共有13个差异表达的基因,在高表达HAb18G/CD147的T7721细胞系中,表达下调的基因包括:骨形成蛋白(BMP)家族的BMP-2、BMP-5,内皮素1(ET-1),结缔组织生长因子-富含半胱氨酸血管生成诱导物61-肾母细胞瘤过表达基因(CCN)蛋白家族的WISP-2(Wnt1-induced signaling proteins-2/CCN5)和富含半胱氨酸蛋白61(cysteine-rich 61/CCN1),前列腺干细胞抗原(PSCA);表达上调的基因包括:白细胞介素10受体α(IL-10Rα),趋化因子家族的IL-6、IL-8和CXC趋化因子配体2(CXCL2/GROβ),线粒体超氧化物歧化酶2(SOD2),B因子(B factor)和转化生长因子β(TGF-β)诱导基因克隆3(βig-h3)的表达。结论共筛选出HAb18G/CD147信号转导通路相关的13个差异表达基因,这些基因与肝癌细胞免疫微环境重塑、血管形成、增殖、侵袭和迁移等生物学过程相关。     

碘标记肝癌单克隆抗体HAb18的探讨及免疫活性分数测定

抗人肝细胞癌单克隆抗体HAb18用氯胺T法在3种不同条件下碘标记,同时用溴代琥珀酰亚胺标记。用Lindmo的双倒数作图法体外测定标记抗体~(125)I-HAb18与肝癌细胞QGY-7703结合的免疫活性分数。对不同的标记方法和标记条件下的标记参数进行比较。结果,氯胺T法在3种条件下的标记率和免疫活性分数相差不显著,免疫活性分数为0.32+0.029～0.45±0.041。而溴代琥珀酰亚胺法标记率为94.5％±3.2,免疫     

肝癌特异性黏附肽的鉴定和分析

利用体内噬菌体随机肽库技术筛选出肝癌特异性噬菌体肽A54,随后用化学合成法在体外合成该多肽,并标记荧光素和生物素,在组织和细胞水平对该肽进行了体内外肝癌特异性的鉴定及其抗原定位。将生物素(Biotin)标记的A54肽通过尾缘静脉注射入荷瘤裸鼠体内,通过免疫组化方法,检测A54肽与肝癌组织特异性结合的情况;并用免疫荧光细胞化学技术,对荧光素(FAM)标记A54肽进行了细胞水平的肝肿瘤特异性鉴定及抗原定位。体内外检测结果表明,A54肽仍保留了特异性识别肝癌组织的特性,且结合于肝癌细胞的膜表面。实验证明,化学合成的多肽,在体内仍然具有靶向肝癌细胞膜表面的作用,这进一步证明了筛选出来的目标噬菌体克隆其特异性靶向作用确实是由其表面插入的小分子多肽所介导的,为肝癌特异性导向药物载体的研究提供了科学依据。     

鉴定单克隆抗体F(ab'''')2段及其结合物抗体活性方法的建立

鉴定单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）的抗体活性通常采用免疫组化法或免疫印迹法。因为失去了Fc段，mAb的F（ab’）2片段的抗体活性不适合用常规免疫组化法或免疫印迹法进行鉴定。尤其是当鉴定mAbF（ab’）2段与其他蛋白质结合物的抗体活性时更为困难。我们用SPDP化学胶联法制备了抗人原发性肝细胞癌（以下简称肝癌）的mAb HAb18的F（ab’）2段与超抗原葡萄球菌肠毒素A（SEA）的结合物HAb18F（ab’）2-SEA，以用于肝癌导向免疫治疗的研究。为了鉴定HAb18F（ab’）2-SEA的抗肝癌抗体活性，本实验建立了用于鉴定mAbF（ab’）2及其结合物抗体活性的专用间接免疫组化法。     

抗人肝癌单克隆抗体嵌合Fab在巴氏毕赤酵母中的高效分泌表达

目的:通过分步整合,用巴氏毕赤酵母表达抗人肝癌单克隆抗体(mAb)HAb18的嵌合Fab(cFab)片段。方法:将抗人肝癌mAbcFab/HAb18基因的原核表达载体pET32a/cFab中的CL和Fd段基因,分别亚克隆到酵母表达载体pPIC9K和pPICZαA中,构建重组质粒pPIC9K/CL和pPICZαA/Fd并测序鉴定。将重组质粒pPIC9K/CL和pPICZαA/Fd分步整合到酵母菌GS115的染色体上,经G418和Zeocin筛选高拷贝的转化子及鉴定Mut表型后,用含5mL/L甲醇的培养基诱导表达。结果:成功地表达抗人肝癌mAbHAb18的cFab,表达水平为26mg/L。Westernblot鉴定证实,表达产物具有良好的与HAb18结合的活性和特异性。结论:cFab/HAb18在巴氏毕赤酵母获得表达,为对其进一步大规模的生产和临床应用奠定了基础。