高活力原代小鼠肝细胞的分离与纯化

目的建立一种稳定的能获得高活力和高纯度原代小鼠肝细胞的分离和纯化方法。方法对传统的两步原位胶原酶灌注法进行4个方面的优化,主要包括选择逆向灌流、将持续灌注法改为间断灌注后夹闭门静脉法、严格控制胶原酶消化时间和将分离的肝细胞悬液进行低速Percoll单密度离心纯化。分离后的肝细胞进行体外培养。肝细胞活力和得率用台盼蓝染色法检测。结果新鲜分离的小鼠原代肝细胞活力能稳定达到87%±3%,平均活细胞总数为8×105每克小鼠体重,绝大部分细胞在体外培养2h后贴壁生长。结论优化后的肝细胞分离方法更为稳定、有效,分离到的肝细胞具有高活力的优点。     

一种简化的分离与培养小鼠原代肝细胞的方法

目的 建立一种简单的能获得高纯度小鼠原代肝细胞的分离与培养方法。方法 将经典的两步灌流法简化为经下腔静脉逆向脉冲式灌注,利用低速离心法对肝细胞分离液进行纯化;利用锥虫蓝染色法鉴定细胞活率;培养瓶预先用鼠尾胶原铺备,利用倒置显微镜观察细胞形态。结果 此法得到了足够数量的肝细胞,细胞活率大于90%;细胞可稳定贴壁1周。结论 成功建立了一种简单的分离与培养小鼠原代肝细胞的方法。     

原代大鼠肝细胞分离与纯化方法

目的探讨改良、简化肝细胞的灌注、分离方法,以提高细胞产量,降低制作成本.方法对传统的两步原位胶原酶灌流法进行改进,改变灌注方式,分离的大鼠肝细胞采用三次低速离心,台盼兰染色检测活率,并与Percoll梯度离心纯化法进行比较.结果大鼠肝细胞经低速离心后,活率仅（48.38±6.97）%.三次离心后再经Percoll梯度离心纯化后活率为（92.63±2.50）%,纯度〉95%,纯化前后活率比较差异有显著性（P〈0.01）.结论该方法要求设备简单、容易操作,细胞产量、活率及纯度高.     

一种SD大鼠肝细胞原代培养的改良方法

目的 建立一种改良的大鼠肝细胞原代培养方法.方法取6到7周龄SD 大鼠（约200g）,3%戊巴比妥钠麻醉,采用Seglen两步胶原酶灌流法分离肝细胞,Percoll密度梯度离心纯化肝细胞,种植在预先用gelatin处理的培养皿内.结果 分离所得肝细胞成活率达95%以上.24h后用相差显微镜观察细胞贴壁良好,细胞形态规则;48h后细胞开始伸展.结论 使用改良的方法获得的细胞成活率高,贴壁牵,适合常见的药理毒理实验.     

金黄地鼠原代肝细胞的分离纯化与培养

目的 建立一种简单、高效的金黄地鼠肝细胞分离、纯化及培养的方法.方法 实验采用两步胶原酶原位灌流法分离地鼠原代肝细胞,percoll离心法纯化细胞,台盼蓝染色检测成活率,对所分离培养的原代肝细胞进行形态学鉴定,Western Blot检测细胞功能.结果 经过分离纯化的金黄地鼠肝细胞,细胞成活率为（93.7％±2.1）％,细胞形态呈现不规则多边形,细胞多为双核和多核细胞.细胞在腺苷处理后,AMP激活的蛋白激酶（AMPK）磷酸化水平明显升高.结论 成功建立了金黄地鼠肝细胞分离纯化及培养的方法.     

小鼠肝细胞的分离与原代培养

目的：探求一种简易、经济的小鼠原代肝细胞的分离与培养方法。方法：采用非灌注法分离小鼠肝脏,利用0.2%Ⅳ型胶原酶对肝脏消化来获取肝细胞,以DMEM培养基对肝细胞进行单层培养。结果：比较成功地进行了原代肝细胞培养,并进行了形态学观察。结论：此方法适合一般实验室开展小鼠原代肝细胞的分离与培养,为进一步的实验研究提供了基础。     

肝脏灌注分离大鼠肝细胞及原代培养的方法

目的　建立分离及原代培养大鼠肝细胞的实验技术方法。方法　先后用无Ca2 灌流液及 0 .0 5 %Ⅳ型胶原酶灌注大鼠肝脏 ,分离肝细胞 ,进行原代培养。结果　用台盼蓝排除试验测肝细胞活率大于 90 % ,产率大于 3 .0× 10 8个活细胞。结论　灌注分离大鼠肝脏可获得大量肝细胞 ,而且存活率高 ,原代培养 2 4h后肝细胞完全贴壁 ,形成单层     

介绍一种简易高效的大鼠原代肝细胞分离方法

目的介绍一种简易高效的大鼠原代肝细胞分离方法。方法在Selgen两步胶原酶灌注法基础上加以改进,进行大鼠原代肝细胞分离。结果平均每只成年SD大鼠获取（1.56±0.31）×10^8个肝细胞,平均肝细胞活率（95.1±4.2）%,平均肝细胞纯度98%。结论本试验介绍方法简便易行,且肝细胞产量高、活力好、纯度高,适宜在一般条件实验室推广应用。     

复制型HBV-Tg小鼠原代肝细胞的培养

目的 建立复制型HBV-Tg原代肝细胞体外培养方法,观察HBV-Tg小鼠原代肝细胞的氧化应激敏感性.方法 改良的两步灌注法分离、纯化、培养HBV-Tg小鼠原代肝细胞,24孔板培养7天,每天换液,收集上清,检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)、丙氨酸转移酶(alanine transami...     

人肝脏星状细胞的一种改良分离方法

目的建立和改良人肝脏星状细胞(human-hepatic stellate cells,hu-HSCs)分离方法,使之适于原代培养和研究。方法在传统分离HSCs方法的基础上,省略链霉蛋白酶和DNA酶,用EGTA液促细胞解离,再用Ⅳ型胶原酶消化,差速离心去除肝实质细胞,最后用Nycodenz密度梯度离心纯化hu-HSCs,台盼蓝染色法计算细胞产量和进行活力评估,α-SMA、desmin免疫荧光染色及油红O脂滴染色鉴定细胞纯度。结果分离得到的原代hu-HSCs数量高达3×106个/克肝脏,纯度达98%;细胞传代后纯度达到100%。结论改良后的方法经济、快捷、高效,细胞得率及纯度大为提高,有利于建立在原代hu-HSCs基础上的研究。     

原代人子宫内膜细胞分离及培养鉴定

目的：探究原代人子宫内膜细胞分离及培养的简易方法,并对其纯度及生物活性进行鉴定。方法采用胶原酶消化人子宫内膜组织,经2次筛网过滤、离心及贴壁纯化技术,分离、纯化培养人子宫内膜间质细胞（ESC ）和腺上皮细胞（EEC ）,用细胞角蛋白（cytokeratin）和波形蛋白（vimentin）免疫细胞化学染色法和免疫荧光方法对所分离的细胞进行鉴定。结果 ESC呈平行生长,细胞呈梭形或多角形,波形蛋白抗体免疫细胞化学染色呈阳性,纯度达95％以上。EEC呈漩涡状生长,细胞呈多角形或蝌蚪形,细胞角蛋白抗体免疫细胞化学染色呈阳性,纯度可达90％。结论应用胶原酶消化法及二次筛网过滤法成功分离并培养数量、活力和纯度高的子宫内膜细胞,可操作性强,可供具备基本细胞培养条件的实验室进行推广。     

原代心肌细胞培养

目的:探讨SD大鼠乳鼠心肌细胞的分离及培养方法,并进行形态学观察。方法:取出生1～3 d的SD大鼠的乳鼠,胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶分别消化心肌组织,差速贴壁法分离心肌细胞,并加入适量BrdU纯化心肌细胞,显微镜下观察心肌细胞形态及纯度。结果:成功分离培养心肌细胞并观察其形态,计算存活率92%,纯度90%,2～3 d出现同步搏动。结论:胰蛋白酶联合Ⅱ型胶原酶消化可分离存活率较高的心肌细胞,用差速贴壁法并加入适量BrdU可纯化心肌细胞,使细胞搏动良好。     

原代培养大鼠肝细胞分离方法的比较研究

目的 探讨体外原代培养大鼠肝细胞的分离方法。方法 以Ｗｉｓｔａｒ大鼠做为肝细胞供体,分别采用直接分离法与胶原酶消化法分离获取肝细胞并原代培养;以台盼蓝染色法测细胞存活率,在位相关倒置显微镜下观察细胞形态变化,ＭＴＴ法测培养细胞活性,并检测不同时期培养上清液中白蛋白的含量。结果 直接分离法获取的肝细胞活性及功能欠佳,而胶原酶消化法所获取的肝细胞形态完整,贴壁良好、活性高、功能强。结论 经胶原酶消化分     

大鼠肝星状细胞的简易分离法

目的在肝脏二步酶灌注法分离大鼠肝星状细胞的基础上,探讨一种简单易行且结果稳定的分离方法。方法采用大鼠肝脏二步酶灌注法对成年大鼠的肝脏进行消化,经密度梯度离心去杂质后得到肝星状细胞。台盼蓝拒染实验鉴定细胞活率,结蛋白(Desmin)免疫荧光鉴定肝星状细胞的纯度。结果肝星状细胞的得率为4.0×107以上,肝星状细胞纯度为96%左右,肝星状细胞存活率为(95.0±1.2)%。结论本实验采用的大鼠肝星状细胞的分离方法,结果稳定,细胞纯度较高,有利于进一步的生物学研究。     

Ficoll及Percoll分离、纯化金黄地鼠肝细胞方法比较研究

目的建立经济有效的原代地鼠肝细胞分离纯化方法,并比较Ficoll及Percoll两种分离液分离出的肝细胞纯度及活性的差异。方法对传统的两步原位胶原酶灌流法进行简化,行肝脏原位灌流,离体后Ⅳ胶原酶进行消化;采用Ficoll及Percoll两种细胞分离液进行分离、纯化;纯化后于37℃5%CO2培养箱内孵育培养,0.4%台盼蓝拒染实验检测肝细胞的存活率。结果 Ficoll及Per-coll分离的地鼠肝细胞总数分别为（1.46±0.91）cells.g-1肝组织、（1.79±0.89）cells.g-1肝组织,即时分离的肝细胞活力和纯度相近,都大于95%,但后期二者差异较大,Percoll分离得的肝细胞活率较高,且细胞活性下降较缓慢。结论通过简化的门静脉原位灌流法和低浓度胶原酶离体消化,Per-coll或Ficoll分离液纯化,即时分离的肝细胞可保持良好的功能和活力,二者无显著差别,但从细胞培养的要求出发,Percoll优于Ficoll分离液。     

人妊娠子宫平滑肌细胞培养消化法与组织块法效果比较

目的寻求简单有效的人妊娠子宫平滑肌细胞原代培养方法,建立稳定、高纯度、高产量的子宫平滑肌细胞原代培养体外模型。方法利用20例妊娠子宫组织,分别使用组织块法和胶原酶消化法分离及纯化人子宫平滑肌细胞,通过免疫荧光方法检测平滑肌细胞的肌动蛋白(α-SMA)及钙调节蛋白(calponin)的表达。结果组织块法和胶原酶消化法培养的平滑肌细胞均呈梭型,峰谷样生长,α-SMA及calponin的免疫荧光化学检测结果为阳性,胶原酶消化法较组织块培养法稳定且缩短原代培养时间。结论胶原酶法简便,快速,稳定,可建立稳定、高纯度的子宫平滑肌细胞体外培养体系。     

大鼠肝细胞分离、原代培养及生物学特性研究

目的 :探讨体外原代培养大鼠肝细胞的分离方法、原代培养肝细胞的生物学特性。　方法 :以SD大鼠作肝细胞供者 ,采用胶原酶消化法分离获取肝细胞 ,并进行原代培养 ;以锥虫蓝染色法测细胞活力 ,在倒置显微镜下观察肝细胞形态变化 ,采用Beckman全自动生化分析仪检测各培养体系不同时间培养上清中Albumin、LDH、Urea的含量。　结果 :胶原酶消化法所获取的肝细胞形态完整、贴壁良好、活性高、功能强。LDH漏出量、白蛋白分泌及尿素合成功能在 1周内出现波动性变化 ,第 3天时LDH漏出量最低 ,白蛋白分泌及尿素合成功能较好。　结论 :胶原酶消化法为一较好的肝细胞分离方法 ,分离的肝细胞在培养第 3天功能最佳     

猪肝细胞的分离与原代培养

目的：建立稳定的猪肝细胞的分离与原代培养体系,满足生物人工肝体外支持系统对肝细胞的需求。 方法:应用改良Seglen法进行肝脏原位胶原酶灌流分离猪肝细胞,进行平面培养,动态观察细胞生长过程中的形态结构变化。 结果：平均每只猪可获得2×10¹⁰个肝细胞,细胞活率达到92.5%。在平面培养过程中维持了正常肝细胞的形态。 结论：原位胶原酶灌流法是获得大量高活率的猪肝细胞的首选方法,猪肝细胞原代分离培养是目前解决组合型生物人工肝脏（HBLSS）应用中细胞来源问题的主要途径。     

高纯度子宫内膜腺上皮细胞的体外分离和培养

目的:在体外建立子宫内膜腺上皮细胞原代分离和培养的方法,以获得高纯度子宫内膜腺上皮细胞。方法:选择正常子宫内膜组织,通过消化、过滤、选择性贴壁和二次消化等技术进行体外培养。结果:采用胶原酶二次消化法和选择性贴壁法成功实现子宫内膜腺上皮细胞的高纯度分离和原代培养。结论:采用胶原酶二次消化法和选择性贴壁法可高纯度分离子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞。