整合在鼻咽癌细胞株SUNE-1中的EB病毒LMP-1基因的缺失性改变

目的:研究EBVLMP-1基因在SUNE-1细胞染色体上的整合情况。方法:采用PCR方法检测整合于SUNE-1染色体的LMP-1基因;限制性内切酶酶切和PCR方法初步验证部分LMP-1基因发生缺失;DNA测序进一步确定LMP-1基因的缺失情况。结果:LMP-1基因在SUNE-1细胞染色体上的整合有完整与缺失两种情况;其缺失发生于其两个内含子部分。结论:整合于SUNE-1染色体DNA上的EBVLMP-1,有部分发生了内含子 1与 2的完全缺失.     

良、恶性鼻咽活检组织中EB病毒DNA检测、EBNA的分型及表达

应用ＥＢ病毒ＤＮＡＢａｍＨＩＷ片段、ＥＢＮＡ一２Ａ、Ｂ型分了探针，检测我区鼻咽癌（包括鼻咽原位癌）、临床高度怀疑鼻咽癌（包括鼻咽上皮细胞非典型增生、颈淋巴结肿大及鼻咽结节）和慢性鼻咽炎等活检组织共９６例。各组均以Ａ型病毒感染为主：鼻咽癌组阳性为２７／３５（７７．１％）；临床疑癌组７／１０（７０．０％）；慢性鼻咽炎织１８／２７（６６．７％）。Ｗ和Ａ型均阳性的鼻咽癌组为２０／２９（６９．０％）；非癌组为８／２５（３２．０％）。同时用抗补体免疫荧光法检测ＥＢＮＡ的表达，鼻咽癌组阳性为１９／２０（９５．０％），而慢性炎组为１／１５（６．７％）。以ＥＢ病毒ＤＮＡＢａｍＨＩＷ片段、ＥＢＮＡ一２Ａ型片段和ＥＢＮＡ表达检测中任一项阳性作为ＥＢ病毒感染、整合或表达的依据，则鼻咽癌组与非癌组之间有明显的差别（Ｐ＜０．００１）。这从另一角度提示ＥＢ病毒（特别是ＥＢＮＡ一２Ａ型）感染与我区鼻咽癌病因、发病有密切关系。     

EB病毒潜在膜蛋白对鼻咽癌细胞系CNE1生长及HLA表达的影响

目的研究ＥＢＶ－ＬＭＰ对高分化鼻咽癌细胞株ＣＮＥ１生长及ＨＬＡ表达的影响。方法以人高分化鼻咽癌细胞株（ＣＮＥ１）为对象，采用电穿孔基因转染技术，将重组ＥＢＶ－ＬＭＰ表达质粒ｐＣＭＶａ－ＬＭＰ转染ＣＮＥ１细胞。用细胞体外增殖试验、免疫组化和流式细胞术等方法，观察细胞生长及ＨＬＡ表达的变化。结果ＥＢＶ－ＬＭＰ在体外可明显促进ＣＮＥ１细胞的增殖，增殖吸光度（Ａ）比值试验组与空白组及阴性对照组比较有显著性差异（Ｐ＜０．０１）；实验组细胞软琼脂克隆形成率显著高于空白及阴性对照组（Ｐ＜０．０１）；细胞ＤＮＡ含量明显增高（Ｐ＜０．０１／０．０５）；ＦＣＭ法测定细胞角蛋白表达，实验组比空白及阴性对照组阳性率显著降低（Ｐ＜０．０５）；ＨＬＡ免疫组化检测结果表明，ＬＭＰ表达细胞系ＨＬＡⅠ类及Ⅱ类抗原的表达都明显下降（Ｐ＜０．０１）。结论ＥＢＶ－ＬＭＰ对ＣＮＥ１细胞生长有明显的促进作用且可明显抑制细胞分化，ＬＭＰ可致鼻咽癌细胞ＨＬＡ抗原的表达改变。     

稳定表达鼻咽癌来源潜伏膜蛋白1基因的鼻咽癌细胞系的建立

目的:建立稳定表达鼻咽癌(NPC)来源潜伏膜蛋白1(LMP1)的鼻咽癌细胞系。方法:利用基因重组技术构建NPC来源LMP1的一般性真核表达载体及上皮特异性表达载体,并将其转染鼻咽癌细胞系CNE-2,用PCR、RT-PCR及蛋白印迹等检测N-LMP1在CNE-2中的整合和表达。结果:①成功构建了N-LMP1的一般性和上皮特异性表达载体。②N-LMP1基因在CNE-2细胞中获得了正确表达。结论:成功建立了稳定表达NPC来源LMP1的鼻咽癌细胞系,为进一步研究LMP1在鼻咽癌细胞中的作用机制奠定基础。     

EB病毒感染对鼻咽癌细胞生长和凋亡的影响

目的:探讨EB病毒(EBV)感染对鼻咽癌细胞系生长和细胞凋亡的影响。方法:用EBV直接感染人鼻咽癌细胞系CNE1;用免疫组化(LSAB)法检测EBV-LMP1和bcl-2蛋白的表达;用MTT法测定鼻咽癌细胞系的生长能力;用流式细胞术和TUNEL法检测癌细胞凋亡。结果:感染EBV的鼻咽癌细胞系(E-CNE1)的EBV-LMP1表达阳性,生长能力较未感染EBV的CNE1明显增强(P<0.01),2种鼻咽癌细胞系均无凋亡发生,而均仅有2%~3%的细胞表达bcl-2蛋白。结论:EBV感染和LMP1表达可促进鼻咽癌细胞生长,但对鼻咽癌细胞的bcl-2表达和细胞凋亡无影响。     

EB病毒感染对鼻咽癌细胞生长和凋亡的影响

目的:探讨EB病毒(EBV)感染对鼻咽癌细胞系生长和细胞凋亡的影响。方法:用EBV直接感染人鼻咽癌细胞系CNE1;用免疫组化(LSAB)法检测EBV-LMP1和bcl-2蛋白的表达;用MTT法测定鼻咽癌细胞系的生长能力;用流式细胞术和TUNEL法检测癌细胞凋亡。结果:感染EBV的鼻咽癌细胞系(E-CNE1)的EBV-LMP1表达阳性,生长能力较未感染EBV的CNE1明显增强(P＜0.01),2种鼻咽癌细胞系均无凋亡发生,而均仅有2%~3%的细胞表达bcl-2蛋白。结论:EBV感染和LMP1表达可促进鼻咽癌细胞生长,但对鼻咽癌细胞的bcl-2表达和细胞凋亡无影响。     

肺癌中EB病毒的原位杂交检测

为观察EB病毒在肺癌组织中的分布并探讨EB病毒感染与肺癌的关系，对87例肺癌组织中经多聚酶链反应（PCR）检测52例EB病毒阳性的石蜡包埋组织，用原位杂交技术进行定位检测。癌组织及癌旁肺组织原位杂交EB病毒阳性率分别为37．9％（33／87）和11．5％（IO／87）；中、低分化癌与高分化癌EB病毒阳性率有显著差异，强阳性病例均为分化较差的肿瘤；累及胸膜、肋骨、隔肌的肺癌，其EB病毒阳性率明显高于未侵及者；随着EB病毒感染的加重，淋巴细胞浸润增多。结果表明：EB病毒感染与肺癌细胞的生物学特性及肺癌的发展有关。     

EB病毒感染对鼻咽上皮HLA表型改变的影响

用碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶法（ＡＰＡＡＰ）检测ＨＬＡ－Ⅰ和ＨＬＡ－Ⅱ的表达。结果显示，体外培养的１０例人胚鼻咽上皮细胞被ＥＢ病毒感染后，ＨＬＡ－Ⅰ型抗原的表达无明显改变（阳性细胞为８５．８％±１７．１６％）；但ＨＬＡ－Ⅱ抗原的表达比对照组明显增高，两组阳性细胞各为５２．４％±１７．１６％和９．６７％±７．２３％，其差别有显著的统计学意义（Ｐ＜０．０５）。鼻咽活检组织中，１８例鼻咽癌细胞同时表达ＨＬＡ－Ⅰ和－Ⅱ两种抗原，并以后者为主（各为７２．２％和１００％），聚合酶链反应（ＰＣＲ）查到ＥＢ病毒ＤＮＡ的占９０％，与慢性鼻咽炎的差别有显著的统计学意义（Ｐ＜０．０５）。ＨＬＡ－Ⅱ表达增高可能在鼻咽癌的发生和发展中起着一定的作用。     

鼻咽癌高发区何杰金病EB病毒DNA及潜伏感染膜蛋白检测的意义

为检测鼻咽癌高发区何杰金病中爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）DNA及其表达产物──潜伏感染膜蛋白的存在及探讨其意义，采用热启动聚合酶链反应（PCR）及LSAB免疫组化法结合微波处理技术，检测了选自鼻咽癌高发区的40例何杰金病、20例淋巴结良性病变存档标本中的EBVDNA和潜伏感染膜蛋白（LMP1）。结果显示：65％的何杰金病中EBVDNA阳性，淋巴结良性病变中的阳性率也达50．0％（10例／20例），两者差异无显著性（P＜0．05）。LMP1只在何杰金病肿瘤细胞中表达，其检出率为52．5％（21例／40例）。20岁以下何杰金病中EBVDNA和LMP1的检出率分别为84．6％（11例／13例）和76．9％（10例／13例），皆明显高于20岁以上年龄组（分别为14例／25例，56．0％和10例／25例，40．0％）P＜0．05。本结果表明：鼻咽癌高发区半数以上何杰金病肿瘤细胞中有EBV潜伏感染，并可能在肿瘤的发生发展中起着一定的作用。提示青少年何杰金病和EBV潜伏感染并表达LMP1的关系更为密切。     

鼻咽癌中EB病毒LMP1基因的序列变异

目的 检测广州地区鼻咽癌中EB病毒LMP1基因N-和C-末端区序列变异的热点,并探讨其产生的机制。方法 收集中山大学肿瘤医院未经治疗的鼻咽癌患者鼻咽新鲜活检标本63例。采用巢式聚合酶链反应（PCR）扩增EB病毒LMP1基因N-和C-末端区,用XhoⅠ对N-末端区扩增产物进行酶切分析,并检测C-末端区扩增产物30bp缺失的情况。采用四色荧光末端终止法对4例患者N-和C-末端区的8份扩增产物进行序列分析。结果 63例鼻咽癌组织EB病毒LMP1基因N-和C-末端区有4种序列变异类型：wt-XhoⅠ／wt-LMP1（4例,6．3％）、wt-XhoⅠ＆XhoⅠ-loss／del-LMP1（4例,6．3％）、wt-XhoⅠ／del-LMP1（5例,7．9％）和XhoⅠ-loss／del-LMP1（50例,79．5％）。序列分析显示：与B95-8细胞相比较,所有检测的鼻咽癌组织中EB病毒LMP1基因均发生了错义点突变和无义点突变。错义点突变数与无义点突变数之间的比值为2．25（9／4）。结论 广州地区鼻咽癌中EB病毒LMP1基因的序列变异类型以XhoⅠ-loss／del-LMP1占主导。LMP1基因N-末端区XhoⅠ酶切位点的丢失很可能是在C-末端区30bp缺失的基础上发生的。LMP1基因的4种序列变异类型可能代表了鼻咽癌变过程中EB病毒在宿主内演变的4个时相。     

转酮酶样蛋白1在人类鼻咽癌细胞生长增殖中的作用

目的:探讨转酮酶样蛋白1(TKTL1)在体外培养的人类鼻咽癌细胞生长增殖中的作用.方法:构建针对TKTL1 mRNA 的干扰RNA质粒,转染人类鼻咽癌细胞(CNE细胞系);检测转染前后CNE细胞中转酮酶活性的变化;实时定量RT-PCR检测转染前后CNE细胞转酮酶基因家族(TKT、TKTL1、TKTL2)mRNA表达水平的变化;通过流式细胞术和MTT实验检测转染前后CNE细胞增殖和细胞周期的改变.结果:实验组CNE细胞中转酮酶活性(携带有pEGFP-C1-U6/TKTL1)明显低于质粒对照组(携带有pEGFP-C1-U6/UC)和空白对照组(未转染细胞);实时定量RT-PCR结果显示转染前后CNE细胞中TKT和TKTL2 mRNA的表达水平均无显著差异.然而,实验组细胞中TKTL1的表达水平明显低于对照组,且实验组CNE细胞增殖明显被抑制,癌细胞被阻滞在G0/G1期.结论:转酮酶蛋白TKTL1在人类鼻咽癌细胞的生长增殖中起重要作用,TKTL1可能成为肿瘤治疗研究的新靶点.     

低氧-复氧对人鼻咽癌细胞增殖、细胞周期、黏附和侵袭能力的影响

目的: 研究细胞外微环境低氧-复氧对人鼻咽癌细胞(CNE-2Z)增殖、细胞周期、黏附和侵袭能力的影响。方法: 以混合气体(5% CO₂, 95% N₂, O₂<0.1%)置换法建立体外低氧培养模型;MTT法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞周期分布;同质黏附实验和细胞-基质黏附实验检测细胞黏附能力;Transwell实验检测细胞侵袭能力。结果: (1) 低氧24 h后抑制CNE-2Z细胞增殖(P<0.01),复氧后细胞快速增殖,在复氧第5 d A值与常氧对照组相比无显著差异(P>0.05);(2) 低氧24 h后细胞阻滞于G₁期(P<0.01),复氧后G₁期阻滞得到快速解除,在复氧24 h细胞周期分布与常氧对照组相比无显著差异(P>0.05);(3)低氧24 h后细胞的同质黏附能力下降(P<0.01)而细胞-基质黏附能力无明显改变(P>0.05),细胞侵袭能力降低(P<0.01);复氧24 h细胞同质黏附能力恢复至常氧对照组水平(P>0.05),而细胞-基质黏附能力(P<0.01)和细胞侵袭能力较常氧对照组显著增加(P<0.01)。结论: 鼻咽癌细胞能耐受微环境低氧的不利影响;低氧环境下存活的鼻咽癌细胞产生的适应性变化赋予肿瘤更强的增殖和转移潜能,从而促进肿瘤细胞的恶性演进。     

抑制氯通道阻抑鼻咽癌细胞周期和细胞增殖

目的:研究Cl^-通道在鼻咽癌细胞调节性容积回缩(RVD)、增殖及细胞周期分布中的作用。方法:活细胞图像分析低分化鼻咽癌细胞(CNE－2Z)RVD,用台盼蓝拒染法检测细胞存活率,MTT法检测细胞增殖能力。用流式细胞仪测定细胞周期不同时相细胞百分率。结果:Cl^-通道抑制剂硝基苯丙胺基苯甲酸(NPPB)剂量依赖性抑制RVD和细胞增殖,100μmol/LNPPB明显阻抑细胞周期进程,使细胞停滞于G₁期,G₁期细胞百分率从54%提高到71%,但对细胞存活率没有显著性影响。结论:阻抑Cl^-通道可阻滞细胞于G₁期而抑制细胞增殖。提示Cl^-通道和RVD的激活是促进细胞从G₁期进入S期和维持增殖所必需的因素。     

鼻咽癌组织中EB病毒潜伏相关基因的表达

目的： 通过检测鼻咽癌组织中EB病毒的潜伏膜蛋白LMP1的序列以及LMP1、EBNA1、EBNA2的mRNA表达来探讨EB病毒的感染状态及其表达产物与鼻咽癌的关系。方法: 应用PCR法检测鼻咽癌组织中LMP1 DNA的存在，并对鼻咽癌来源的LMP1和EB病毒永生化狨猴B淋巴细胞系B95-8来源的LMP1进行测序，比较序列的差异。利用巢式RT-PCR检测鼻咽癌组织中LMP1、EBNA1、EBNA2的mRNA表达。结果: 47例鼻咽癌组织均含有LMP1 DNA，所有鼻咽癌来源的LMP1 DNA与B95-8来源的LMP1 DNA序列比较均存在着多个单核苷酸变异，最明显的是XhoⅠ酶切位点的丢失。测序后显示鼻咽癌来源的LMP1 DNA有30个核苷酸的丢失。巢式RT-PCR显示LMP1、EBNA1、EBNA2在鼻咽癌中的mRNA表达率分别为76.6％、80.0％和74.5％。其中EBNA1的表达是由Qp启动的，而B95-8细胞中EBNA1的表达是由Cp启动的。结论: 鼻咽癌中EB病毒的作用途径比较复杂，LMP1、EBNA1、EBNA2等潜伏期基因还有早期裂解基因BARF1均可能参与鼻咽癌的发生发展过程。     

蛋白激酶C亚型在鼻咽癌细胞中的分布及在增殖中的作用

本文检测了人低分化鼻咽癌上皮细胞系（ＣＮＥ－２Ｚ）颗粒部分与胞浆部分ＰＫＣ的三种主要亚型的含量和分布。结果发现：（１）ＣＮＥ－２Ｚ细胞的颗粒部分中ＰＫＣ－Ⅱ型相对较少，而ＰＫＣ－Ⅰ，Ⅲ型则相对较多；（２）随ＴＰＡ浓度增大，ＰＫＣ总量及颗粒部分的ＰＫＣ－Ⅲ下降明显，细胞的生长也受抑制，１０－６ｍｏｌ／Ｌ时，ＰＫＣ－Ⅲ仅为对照的３５．６％，抑制率达６０％；（３）随ＴＰＡ作用时间延长，ＰＫＣ总量及颗粒部分的ＰＫＣ－Ⅲ下降明显，ＰＫＣ－Ⅲ的变化自１５ｍｉｎ时开始，１２０ｍｉｎ时仅为对照的１８．６％；在１３ｈ后，细胞增殖出现抑制，２６ｈ抑制率达５５％。结果提示，ＰＫＣ在ＣＮＥ－２Ｚ细胞中以Ⅰ，Ⅲ型含量较多，尤其ＰＫＣ－Ⅲ对生长起重要作用。     

Endogenous latent membrane protein 1 in Epstein-Barr virus-infected nasopharyngeal carcinoma cells attracts T lymphocytes through upregulation of multiple chemokines

Tumor-infiltrating T lymphocytes are considered to facilitate development of Epstein-Barr virus (EBV)-associated nasopharyngeal carcinoma (NPC), but how EBV in NPC tumor cells directs T cell infiltration remains unclear. Here we compare EBV-infected NPC cells with and without spontaneous expression of viral latent membrane protein 1 (LMP1) and find that culture supernatants of LMP1-positive NPC cells exert enhanced chemoattraction to primary T cells. Knockdown of endogenous LMP1 in the cells suppresses the chemotactic activity. Endogenous LMP1 in NPC cells upregulates multiple chemokines, among which MIP-1α, MIP-1β and IL-8 contribute to T cell chemotaxis. We further reveal that LMP1-induced production of MIP-1α and MIP-1β in NPC cells requires not only two carboxyl-terminal activation regions of LMP1 but also their downstream NF-κB and JNK pathways. This study corroborates that endogenous LMP1 in EBV-infected NPC cells induces multiple chemokines to promote T cell recruitment and perhaps other pathogenic events in NPC.     

渗透压、细胞容积与鼻咽癌细胞增殖

目的:研究渗透压、细胞容积与鼻咽癌细胞增殖的关系。方法:用MTT法检测在不同渗透压培养条件下低分化鼻咽癌细胞(CNE－2Z)的增殖能力,流式细胞仪测定细胞周期分布,活细胞图像分析测量细胞容积,台盼蓝拒染法检测细胞存活率。结果:高渗(370、440mOsmol/L)培养增大细胞容积和促进细胞增殖,细胞容积分别增大8.7%、27.8%,增殖率分别提高22.2%和33.9%;而低渗(160、230mOsmol/L)培养减小细胞容积和抑制增殖,细胞容积分别减小12.8%和4.1%,增殖率分别降低34.0%和15.6%;细胞容积与细胞增殖率呈正相关。非等渗长期培养条件下,细胞周期各时相分布没有显著差异。低渗培养降低细胞生存率。结论:胞外渗透压、细胞容积与鼻咽癌细胞增殖密切相关,低渗培养可能通过减小细胞容积、促进细胞死亡而抑制细胞增殖。