RNA干扰及其在神经变性性疾病研究中的应用

RNA干扰(RNAi)是指生物体内利用具有同源性的双链RNA(dsRNA)诱发序列特异的转录后基因沉默(PTGS)的现象，它可以通过抑制蛋白表达模拟基因敲除技术。RNAi主要通过dsRNA被核酸酶Dicer切割成21～25nt的小干扰RNA(siRNA)，由siRNA介导识别并靶向切割同源mRNA分子而实现。随着研究的不断深入，RNAi的作用机制将逐步被阐明，其技术也将日趋完善和成熟，并将得到广泛的应用。本文就RNAi技术的研究进展及其在阿尔茨海默病、帕金森病等神经变性性疾病研究中的应用作一综述。     

NA干扰及其在神经变性性疾病研究中的应用

RNA干扰 (RNAi)是指生物体内利用具有同源性的双链RNA(dsRNA)诱发序列特异的转录后基因沉默(PTGS)的现象 ,它可以通过抑制蛋白表达模拟基因敲除技术。RNAi主要通过dsRNA被核酸酶Dicer切割成 2 1～ 2 5nt的小干扰RNA(siRNA) ,由siRNA介导识别并靶向切割同源mRNA分子而实现。随着研究的不断深入 ,RNAi的作用机制将逐步被阐明 ,其技术也将日趋完善和成熟 ,并将得到广泛的应用。本文就RNAi技术的研究进展及其在阿尔茨海默病、帕金森病等神经变性性疾病研究中的应用作一综述     

RNA干扰技术原理及其在脑胶质瘤治疗中的应用

RNA干扰是dsRNA在转录后水平特异性降解目的基因mRNA,导致该基因沉默的现象。脑胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤,传统的手术、放、化疗均不能达到彻底治愈的目的。RNA干扰在脑胶质瘤治疗中的应用,可能会取得更好的效果。本文就RNA干扰技术原理及其在脑胶质瘤治疗中的应用的研究进展作一综述。     

RNAi技术及其在胶质瘤中的研究进展

<正>RNA干扰(RNA interference,RNAi)是一种在动植物中广泛存在的,由双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)介导的序列特异性基因沉默现象。由于RNA干扰可以抑制特定基因的表达,至今短短十几年的时间,RNAi技术已迅速发展成为一种成熟的基因沉默工具,对生命科学研究产生了深远的影响。已广泛用于研究基因表达及调控,信号传导通路,药物的作用机制,肿瘤的临床治疗等诸多领域,现将RNAi技术及其在胶质瘤研究中的应用进展综述如下。     

RNAi及其基因治疗研究进展

RNAi(RNA inter ference)即RNA干扰,是外源双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)分子在mRNA水平关闭相应序列基因表达所致的细胞内有效、特异性基因封闭,是广泛存在于生物界的古老现象,是生物体抵御病毒或其它外来核酸入侵以及保持自身遗传稳定的保护性机制,以其高效率,高特异性等特性,较反义核酸、核酶、三链RNA等基因沉默技术显示了独特优势及广泛的应用前景,本文就其特点、分子机制及其在基因治疗等方面的探索进行综述.     

G蛋白偶联受体激酶5对大鼠胚胎神经干细胞抗凋亡作用及其机制

目的探讨培养大鼠胚胎神经干细胞G蛋白偶联受体激酶5(GRK5)基因沉默后蛋白激酶A(PKA)活性变化及其与神经干细胞凋亡的关系。方法采用分别或联合RNA干扰沉默GRK5基因表达与PKA激动剂forskolin干预大鼠胚胎神经干细胞,用荧光素标记的膜联蛋白V(FITC-Annexin V)联合PI染色检测早期凋亡率,并检测神经干细胞中PKA与caspase-3的活性,Western blot检测Bcl-2/Bax蛋白与磷酸化LKB1蛋白的表达。结果 GRK5基因沉默后神经干细胞内PKA活性及磷酸化LKB1蛋白表达显著减低(P0.01),Bcl-2/Bax蛋白表达比值降低(P0.05),caspase-3活性升高(P0.01),Annexin V荧光染色阳性细胞比率显著升高(P0.01)。联合应用PKA激动剂forskolin后细胞凋亡显著减少(P0.01)。结论 GRK5基因沉默增加了大鼠胚胎神经干细胞早期凋亡,其机制可能与抑制PKA活性相关。     

RNA干扰Bmi-1对胶质瘤细胞增殖的影响

目的 初步探讨Bmi-1基因对胶质瘤细胞增殖状况的影响.方法 采用RNA干扰技术沉默U251胶质瘤细胞中Bmi-1基因,RT-PCR检测干扰效果,CCK8观察U251细胞的增殖状况.结果 RNA干扰Bmi-1后,Bmi-1基因表达降低,U251细胞增殖减慢.结论 Bmi-1基因可以促进胶质瘤细胞的增殖,有可能促进了...     

沉默RhoA基因对骨髓间充质干细胞静脉移植治疗脑梗死大鼠的作用

研究证实,RhoA基因在神经继发损伤中发挥着重要的作用,通过基因沉默降低其表达,可以有效阻断继发性神经损伤。RhoA蛋白介导的神经突生长抑制作用是影响骨髓间充质干细胞移植后修复效果的重要原因。 目的：验证是否可以通过沉默RhoA基因的方法,改良骨髓间充质干细胞静脉移植对大鼠脑梗死的治疗效果。 方法：体外培养骨髓间充质干细胞,经小分子干扰RNA转染以沉默RhoA基因表达,用Western blot法检测神经干细胞在转染前后RhoA基因的表达。建立大脑中动脉闭塞模型,分为3组,通过尾静脉分别注入RhoA基因沉默的骨髓间充质干细胞悬液、骨髓间充质干细胞悬液及不含干细胞的培养液(对照组)。注入移植液后24 h,3 d,1,2 周行Bederson评分检测神经功能的损伤情况。造模2周后处死大鼠取材,行免疫组织化学和苏木精-伊红染色观察大脑梗死处组织学变化。 结果与结论：经分子干扰RNA转染后24 h的骨髓间充质干细胞RhoA基因表达较转染前显著降低(P=0.002)。沉默RhoA基因后的骨髓间充质干细胞移植治疗,无论从组织学上还是功能学上疗效都有明显的提高。提示用RNA干扰的方法使骨髓间充质干细胞的RhoA基因沉默,再通过尾静脉注射的方法移植到大鼠颅脑损伤区,移植的骨髓间充质干细胞可以更好地在损伤部位存活,增殖分化与迁移,促进脑梗死后大鼠神经功能的恢复。     

siRNA沉默CCN5抑制人胶质母细胞瘤细胞的生长

目的研究小干扰RNA(siRNA)沉默高半胱氨酸蛋白61/结缔组织生长因子/肾母细胞瘤过度表达基因5(CCN5)对人胶质母细胞瘤细胞系生长的影响。方法 Western blot方法检测胶质母细胞瘤患者脑组织CNN5蛋白水平的表达;合成CCN5 siRNA小片段,并,筛选最佳干扰片段;siRNA沉默CCN5在胶质母细胞瘤细胞系中的表达,噻唑兰(MTT)方法检测细胞的生长;CCN5沉默表达后,检测半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase-3)的酶活性。结果胶质母细胞瘤患者脑组织中CCN5蛋白表达水平较正常人脑组织中高;siRNA沉默CCN5表达抑制细胞的生长并促进凋亡效应基因caspase-3活性升高。结论 CCN5基因沉默抑制人胶质母细胞瘤细胞系的生长,为探讨CCN5在胶质母细胞瘤细胞中的作用奠定基础,并为胶质母细胞瘤的基因治疗提供潜在的靶标基因。     

小分子干扰RNA介导RhoA沉默优化骨髓间充质干细胞的培养

以往骨髓间充质干细胞的培养方法存在衰老和分化率低等问题。 目的：检测是否可以通过沉默RhoA基因的方法优化骨髓间充质干细胞培养。 方法：体外培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,经小分子干扰RNA转染以沉默RhoA基因表达,分为3组培养：干细胞组(未转染小分子干扰RNA)、经随机打乱顺序的小分子干扰RNA 转染干细胞组、经小分子干扰RNA 转染的干细胞组。用RT-PCR,Western blot检测骨髓间充质干细胞在转染前后RhoA基因和蛋白的表达。应用细胞生长曲线、MTT比色法观察细胞生长的优化作用,采用流式细胞术测定细胞周期分布的变化。 结果与结论：与干细胞组、经随机打乱顺序的小分子干扰RNA 转染干细胞组比较,经小分子干扰RNA 转染的干细胞组RhoA基因和蛋白表达量明显降低(P < 0.05),细胞的生长速度明显增快,细胞周期G0/G1期减少,S期细胞数增多(P < 0.05)。说明通过沉默RhoA基因的方法可以促进骨髓间充质干细胞增殖,优化培养方法。     

靶向沉默Wip1基因协同替莫唑胺抑制脑胶质瘤细胞增殖的作用

目的研究靶向沉默Wip1基因对增敏替莫唑胺(TMZ)抑制脑胶质瘤细胞增殖作用的影响。方法体外培养人胶质瘤细胞株U-87MG,将携带Wip1基因RNA干扰载体的慢病毒感染U87-MG细胞。使用TMZ干预胶质瘤细胞,MTT法检测细胞的增殖,流式细胞术Annexin-V(APC染色)检测细胞的凋亡情况,流式细胞术PI染色法检测细胞周期。实验数据采用SPSS 16.0软件进行统计学分析。结果 Wip1基因沉默的胶质瘤细胞与空载体慢病毒对照组细胞对TMZ的作用对比,3d后细胞增殖率较对照组下降57.7%;Wip1基因沉默组TMZ处理5d后细胞凋亡率为15.3%,空载体对照组为5.65%;Wip1基因沉默组细胞凋亡率明显要高(P<0.05);细胞周期结果显示Wip1基因沉默组G2细胞为63.0%,而空载体对照组为23.8%,Wip1基因沉默组表现为G2/M期细胞明显增多(P<0.05)。结论靶向沉默Wip1基因可以显著增加TMZ对胶质瘤细胞增殖的抑制作用。     

Wip1基因在人脑胶质瘤细胞恶性增殖中的作用及其机制

目的研究Wip1基因在人脑胶质瘤细胞增殖的作用及机制。方法构建人Wip1基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,有效沉默胶质瘤细胞U251及U87-MG细胞的Wip1基因表达,检测细胞增殖能力。流式细胞术PI单染法检测Wip1基因沉默后细胞周期分布。实时定量PCR法及Western blotting分别检测差异性基因m RNA及蛋白表达。结果胶质瘤细胞Wip1基因表达被有效沉默。Wip1基因沉默的胶质瘤细胞增殖变慢,在U87-MG细胞更加明显。细胞周期分析显示:Wip1基因沉默对U251细胞周期无明显影响,而U87-MG细胞则在10 d时出现明显S期增多和G1、G2期细胞减少。Wip1基因沉默后,U251细胞中CDKN2A和p14ARF基因表达下调,而在U87-MG细胞中表达均上调。Western blotting结果显示:在U251与U87-MG胶质瘤细胞中p38MAPK表达均上调。在U87-MG细胞中p53及p-p53(Ser 15)表达均上调,但在U251细胞中无明显变化。结论 Wip1对胶质瘤细胞增殖具有重要作用。在U87-MG细胞增殖作用主要与其调节p53功能有关。     

大鼠Rars基因siRNA重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的 构建针对大鼠Rars基因的siRNA重组腺病毒载体,并观察大鼠神经元细胞病毒转染前后目的蛋白表达量变化。方法 将原代培养的大鼠神经元细胞随机分为观察组、阴性对照组及空白对照组。观察组细胞转染携带Rars siRNA序列的重组腺病毒,阴性对照组细胞转染携带Scramble无意义序列的重组腺病毒,空白对照组不转染任何病毒。观察各对照组表达绿色荧光蛋白（GFP）的阳性细胞数,计算转染率,并检测转染前后Rars基因对应产物精氨酰-tRNA合成酶（ArgRS）蛋白的表达量,评价基因沉默效率。结果 成功构建包含Rars基因干扰序列及Scramble序列的重组腺病毒,病毒滴度达1010级。利用重组腺病毒感染大鼠神经元细胞48 h后,绝大部分细胞表达GFP,转染率>95%。含Rars干扰序列的病毒转染细胞可使ArgRS蛋白表达量显著降低（P<0.01）,沉默效率>60%。含Scramble对照序列的病毒则不能产生明显的基因沉默效应。结论 本实验所构建的siRNA重组腺病毒载体可有效沉默大鼠Rars基因,降低ArgRS蛋白表达。     

法舒地尔和RhoA沉默对神经干细胞增殖的影响

背景：Rho及其相关分子在神经轴突生长、分化、延伸及突触形成中起重要作用,阻断和抑制RhoA/ROCK通路可促进神经干细胞的增殖与生长。 目的：观察Rho激酶抑制剂法舒地尔和RNAi介导的RhoA基因沉默对大鼠神经干细胞增殖的影响。 方法：体外培养Wistar胎鼠神经干细胞,分6组干预：空白对照组,5,10,15,20 μmol/L 法舒地尔组,siRNA 沉默RhoA基因组。干预后第3天,采用RT-PCR,Western blot检测各组神经干细胞RhoA基因及蛋白的表达。应用MTT比色法观察神经干细胞增殖情况;采用流式细胞术测定神经干细胞周期分布的变化。 结果与结论：15,20 μmol/L 法舒地尔组、siRNA 沉默RhoA基因组神经干细胞RhoA基因及蛋白表达量较5,10 μmol/L 法舒地尔组、空白对照组明显降低(P < 0.05),细胞的生长速度较5,10 μmol/L 法舒地尔组、空白对照组明显增快(P < 0.05),细胞周期G0/G1期减少(P < 0.05),S期细胞数增多(P < 0.05)。当法舒地尔浓度增加到20 μmol/L时对细胞的作用并非随浓度的增加而增强,与15 μmol/L组的差异无显著性意义(P > 0.05)。15,20 μmol/L 法舒地尔组与siRNA 沉默RhoA基因组相比差异无显著性意义(P > 0.05)。说明Rho激酶抑制剂法舒地尔和RNAi介导的RhoA基因沉默在体外均能促进神经干细胞增殖,法舒地尔最佳作用浓度为15 μmol/L。     

SH-SY5Y细胞α7神经型尼古丁受体基因沉默对突触相关蛋白的影响

目的研究神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)α7神经型尼古丁受体基因(α7 nAChR)表达沉默后对细胞突触相关蛋白的影响,探讨α7 nAChR神经保护作用机制及在阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)的发病机制中的作用。方法用Real-time PCR法和蛋白免疫印迹(Western blot)法分别测定细胞中囊泡相关蛋白(synaptophysin)和突触后膜蛋白(PSD-95)mRNA蛋白表达水平的变化。结果α7 nAChR沉默组的突触相关蛋白PSD-95、SYPmRNA及蛋白表达都有明显的减少。结论沉默SH-SY5Y细胞α7 nAChR水平能够使细胞突触相关蛋白水平减少。这可能提示了α7 nAChR与细胞突触密切相关,并且α7 nAChR对突触有一定的保护作用,进一步说明α7nAChR在阿尔茨海默病的发病中起着重要作用。     

神经干细胞NgR基因沉默立体定向移植治疗大鼠脑损伤

背景：神经干细胞具有自我增殖能力和多向分化潜能,一定条件下可以分化成神经系统的各种细胞,因此在神经损伤修复方面有着良好的应用前景。而RNA干扰避免了永久基因沉默的弊病,最有希望与神经干细胞移植相结合治疗颅脑损伤。 目的：检测是否可以通过沉默NgR基因的方法提高神经干细胞立体定向移植对重型颅脑损伤大鼠的治疗效果。 方法：60只雄性Wistar大鼠制成重型液压颅脑损伤模型后随机区组法分为3组,每组20只。实验组：造模24 h后向损伤的大鼠脑组织内注射NgR基因沉默的神经干细胞悬液6 μL;对照组：同法注射等量的神经干细胞悬液;空白组：同法注射等量的不含干细胞的培养液。伤后24 h,3 d,1,2周行动物神经学缺损评分。2周后处死行免疫组织化学和苏木精-伊红染色。 结果与结论：转染小分子干扰RNA后,与对照组相比,实验组NgR基因蛋白表达量明显降低,移植后1周和2周,接受神经干细胞移植的大鼠神经学缺损评分明显低于对照组(P < 0.05);且其脑组织切片中的神经元数量较对照组明显增多(P < 0.01)。伤后2周苏木精-伊红染色空白组可见损伤处脑组织断裂,为瘢痕连接,有明显空洞形成;对照组在移植部位出现典型的神经细胞样形态学改变;实验组出现典型的神经细胞样形态学改变且空洞消失。免疫组织化学染色观察空白组BrdU标记的阳性细胞为(37.92±16.02)个/高倍视野,对照组为(89.68±15.34)个/高倍视野,实验组为(102.67±13.52)个/高倍视野,各组间两两比较,差异均有显著性意义(P < 0.01)。提示神经干细胞NgR基因沉默后立体定向移植治疗大鼠脑损伤可明显改善重型颅脑损伤后大鼠的神经学功能。     

小干扰RNA沉默RHBDF1基因抑制胶质瘤细胞生长和诱导细胞凋亡的初步研究

目的 检测RHBDF1基因在正常胶质细胞和胶质瘤细胞内的表达,以及小干扰RNA沉默C6胶质瘤细胞内RHBDF1基因后是否诱导C6细胞凋亡和抑制细胞生长,为基因治疗胶质瘤寻找新的靶基因. 方法采用Western blot检测RHBDF1基因在正常胶质细胞和胶质瘤细胞(包括C6、U251和MGR2)的表达情况:用脂质体转染法分别将RHBDF1 siRNA或对照siRNA转染入C6细胞内,RT-PCR和Western blot方法检测siRNA转染后对C6细胞内RHBDF1基因和蛋白的影响;Tune1法检测RHBDF1基因沉默后对细胞凋亡的诱导情况,Ki-67免疫荧光染色观察RHBDF1基因沉默后对细胞生长抑制的影响.结果 与正常胶质细胞比较,胶质瘤细胞内RHBDF1基因存在着过度表达.siRNA转染入C6细胞后.对照siRNA组凋亡率为2.96%±1.25%,而RHBDF1siRNA1组和RHBDF1 siRNA2的凋亡率分别为36.35%±4.85%和33.58%±4.08%:对照siRNA组细胞增殖率为95.96%±3.25%,而RHBDF1 siRNA1组和RHBDF1 siRNA2组的细胞增殖率分别为24.57%±5.53%和25.68%±4.08%;组间细胞凋亡率和增殖率比较差异均有统计学意义(P<0.05).结论 RHBDF1基因在胶质瘤细胞内存在过度表达,沉默该基因后可以诱导细胞凋亡和抑制细胞生长,RHBDF1基因可能成为基因治疗胶质瘤的一个新的靶基因.     

诱导非典型蛋白激酶C基因沉默增加胶质瘤干细胞化疗药物敏感性的研究

目的 通过诱导非典型蛋白激酶C(aPKC)基因沉默增加胶质瘤干细胞对化疗药物的敏感性,为根治胶质瘤干细胞提供理论支持.方法 流式细胞术分离大鼠C6胶质母细胞瘤侧群细胞,RNA干扰(RNAi)技术沉默C6侧群细胞aPKC表达,MTT和锥虫蓝实验检测单纯疱疹病毒-胸苷激酶(HSV-tk)/更昔洛韦(GCV)对C6侧群细胞的杀伤效果;建立裸鼠皮下胶质瘤模型,测量肿瘤体积,肿瘤组织块称重,原位凋亡法检测细胞凋亡.结果 C6侧群细胞aPKC基因被有效沉默后,可显著增加其对HSV-tk/GCV药物的敏感性,表现为细胞凋亡和死亡数明显增加(P＜0.05);体内实验显示肿瘤体积和重量较对照组明显减小(P＜0.05),细胞凋亡明显增加(P＜0.05).结论 通过诱导aPKC基因沉默可进一步增加胶质瘤干细胞对化疗药物HSV-tk/GCV的敏感性,为胶质瘤干细胞的基因治疗提供了新的方法选择.     

PINK1介导缺氧损伤时星形胶质细胞对神经元的保护作用

目的探究星形胶质细胞内PTEN诱导假定激酶1(PINK1)缺失对缺血时神经保护作用的影响及其作用机制。方法离体培养原代星形胶质细胞,使用小干扰RNA(si RNA)沉默PINK1表达,氧糖剥夺(OGD)建立细胞缺氧模型,分为4组:PINK1沉默组(si RNA+转染剂)、空质粒组(空质粒+转染剂)、转染剂组(只加转染剂)和对照组(星形胶质细胞),各组均与神经元共培养;另设立神经元单独培养组。免疫荧光染色观察神经元凋亡情况。定量PCR及ELISA检测星形胶质细胞促红细胞生成素(EPO)及血管内皮生长因子(VEGF)表达量;Western blot检测星形胶质细胞内缺血诱导因子(HIF)及核因子κB(NF-κB)通路相关蛋白水平。结果 OGD损伤后神经元凋亡率较高,与星形胶质细胞共培养后神经元凋亡率显著降低(P0.05)。PINK1基因沉默后共培养神经元凋亡增加,星形胶质细胞EPO及VEGF分泌量减少、胞内EPO及VEGF转录水平降低(P0.05);HIF-1、HIF-2与NF-κB通路活化水平均显著降低(P0.05)。结论星形胶质细胞对OGD损伤神经元有保护作用,其作用通过EPO及VEGF实现;PINK1基因沉默后星形胶质细胞对缺血神经元保护作用减弱,可能与NF-κB通路活化水平降低、HIF激活受损进而下调EPO和VEGF表达量有关。