动物活体成像生物发光间充质干细胞系的构建

目的 建立稳定表达荧光素酶的小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)系。方法 用携带荧光素酶基因的慢病毒GV260感染F3代MSCs系OP9细胞,通过嘌呤霉素筛选建立稳定表达荧光素酶的OP9 luc+细胞;检测荧光素酶报告基因的活性,观察其表达效果;将OP9 luc+细胞经尾静脉注射至C57BL小鼠体内,观察其成像能力。结果 筛选到稳定表达荧光素酶的小鼠MSCs系OP9 luc+;活性测定证明其表达效率高;在动物体内可以清晰成像。结论 构建了稳定高表达荧光素酶基因的小鼠MSCs系OP9 luc+。     

活体心肌氢质子磁共振波谱扫描可行性研究

目的 探讨活体心肌氢质子磁共振波谱(proton magnetic resonance spectroscopy,1H-MRS)扫描的可行性.方法 采用1.5T磁共振扫描仪对100名志愿者进行心肌1H-MRS扫描,分析所得谱线.结果 100名志愿者均完成检查,水峰位于4.7 ppm,显示率为100%,胆碱(choline,Cho)峰位于3.2 ppm,显示率为86%,肌酸(creatine,Cr)峰位于3.0 ppm,显示率为90%,甘油三酯(triglyceride,TG)峰位于0.9～1.6 ppm,显示率为98%.共86例可见上述所有波峰,以代谢物的峰高与水峰峰高的比值表示代谢物含量,根据86例谱线计算出Cho含量为1.94%,Cr含量为1.95%,TG含量为9.41%.结论 1H-MRS可以检测活体心肌相关代谢产物.     

SHU555A标记间充质千细胞心肌内磁共振成像的策略优化

目的目前研究表明,超顺磁性氧化铁颗粒标记干细胞后,可进行心肌内移植磁共振活体示踪,但由于标记效率较低,加上大动物心电门控和呼吸控制效果较差,磁共振图像质量差强人意。本实验采用SHU555A(Resovist)纳米微粒标记猪骨髓间充质干细胞(MSCs),对标记方法和标记细胞磁共振成像进行方法学优化,以期提高磁共振成像质量。方法①细胞磁标记方法的优化:分离培养猪MSCs。将SHU555A和非特异性转染剂PLL以1:0．03的比例用无血清的DMEM培养液稀释,制成含铁终浓度分别为0、25、50、100和200 g／mL的SHU555A-PLL标记培养液,室温下轻摇混合60 min,形成SHU555A-PLL复合物,标记猪MSCs 24 h以确定最佳标记浓度;然后以该浓度与猪MSCs分别共孵育0、2、4、8、16、24和48 h,以确定最佳标记时间。反映不同条件下标记效率和标记毒性的检测指标包括:普鲁士蓝染色、细胞电子显微镜检查、细胞铁浓度测定(原子吸收分光光度仪)、锥虫蓝排除试验、细胞毒性和增殖活性测定(CCK-8试验)。②标记细胞心脏移植的磁共振成像优化:开胸结扎前降支建立猪急性心肌梗死模型10头,每头直视下经心外膜向左室梗死交界区心肌内缓慢注射(1-10)×106细胞,每点150μL,共3点。对植入猪心肌内的标记细胞进行体内磁共振成像。比较T2 * WI-Flash2d(快速小角度反转梯度回波序列)、T2*WI-MAP和钆喷酸葡胺静脉注射后T2*WI-Flash2d等3种成像方法的图像质量。结果①MSCs平均含铁量随着培养液中SHU555A浓度的增加而升高;但SHU555A浓度增加到100 g／mL时,细胞活力开始下降(P<0．01),并可见较多蓝染铁颗粒粘附于细胞表面甚至游离于细胞外;进一步增加到200 g／mL时,细胞存活率和细胞活力均下降(P分别<0．05、0．01)。MSCs平均含铁量随着共孵育时间的增加而相应升高:但共孵育48 h时,细胞存活率降低(P<0．05)。电子显微镜检查显示, 50:1．5μg／mL SHU555A-PLL 24 h标记方案在细胞和亚细胞水平未发现氧化铁的毒性作用。该方案体外磁共振T2*WI-GRE检测闽值为7．5×104细胞。②标记细胞心肌内移植磁共振成像发现,T2*WI-Flash2d图像平均评分为(2．00±0．82)分;72*WI-Map成像、钆喷酸葡胺注射后T2*WI-Flash2d图像平均评分均为(2．60±0．84)分,明显优于前者(P=0．024)。结论50:1．5μg／mL SHU555A-PLL培养液与猪MSCs共孵育24 h是合适的标记方案。1．5 T磁共振成像仪72*WI-Flash2df笋列可对植入心脏的磁标细胞进行活体显像,T2*I-Map成像、钆喷酸葡胺注射后T2*WI-Flash2d成像可显著提高图像质量。     

磁共振活体监测大鼠间充质干细胞移植治疗急性肾功能衰竭

目的 磁共振活体监测移植入急性肾功能衰竭(ARF)大鼠腹主动脉的磁标记间充质干细胞(MSCs)并检测大鼠.肾功能及肾脏病理改变.方法 磁性纳米粒子体外标记大鼠骨髓MSCs.ARF大鼠分为3组,插导管至腹主动脉,分别移植入标记细胞(10只);移植入未标记细胞(10只);灌注等量生理盐水(10只).移植后0.5 h及第1、2、5天应用MRI对移植细胞进行活体示踪,并与肾脏普鲁士蓝染色及CD68抗体染色对照.监测大鼠肾功能恢复及肾脏病理变化情况.结果 Fe2O3-PLL可有效标记大鼠MSCs.标记细胞移植后ARF大鼠.肾脏皮质区T2*WI信号强度明显下降,持续到移植后第5天.组织学分析见标记细胞分布于肾皮质肾小球内.细胞移植组肾功能优于对照组,肾损伤程度明显轻于对照组.结论 临床应用型1.5 T磁共振仪可活体监测移植入ARF大鼠腹主动脉的MSCs,移植后早期细胞分布于肾皮质肾小球内;MSCs移植后早期可促进ARF恢复.     

间充质干细胞与心肌修复研究进展

缺血性心脏病(ischemic heart disease,IHD)多由于冠状动脉病变,导致心肌缺血性损害。缺血性心脏病包括冠心病、心胶痛、急性心肌梗死、陈旧性心肌梗死等。目前对此类疾病主要治疗方法有药物、介入以及手术治疗等。这些方法只能恢复一部分心肌的再灌注、改善心肌缺血和心衰症状     

超顺磁性氧化铁标记大鼠骨髓间充质干细胞的磁共振成像研究

目的:探讨超顺磁性氧化铁纳米粒子(Superparamagnetic iron oxide,SPIO)体外标记大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的适当浓度和不同标记浓度对细胞的生物学活性影响,以及经MR成像的特征等.方法:选取第5代细胞进行不同浓度SPIO标记,运用光学显微镜观察铁颗粒在细胞内的位置、分布及标记率;选取适当浓度标记量,使用1.5T磁共振进行T1wI、T2WI、T2*WI扫描,测量不同扫描序列标记细胞管的信号强度改变,并进行统计学分析.结果:标记后的铁颗粒均位于细胞质内;含量在25～50μg Fe/ml的培养液是SPIO标记干细胞的安全浓度,在此浓度阈值标记后孵育24 h即可有效标记细胞97%～100%;SPIO标记的MSCs在T1WI,T2WI及T2*WI序列信号均降低.结论:SPIO可以简便标记MSCs.并且在适当浓度下对MSCs的生物学活性没有影响,MR T2WI和T2*WI序列可有效显像磁性标记的干细胞,为下一步活体试验奠定基础.     

间充质干细胞向心肌细胞分化的研究进展

来自于骨髓的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)主要具有:(1)干细胞的自我更新能力。研究细胞周期发现约10%处于S期、G2期和M期,其余90%均处于G0期     

超顺磁性氧化铁标记骨髓间充质干细胞治疗大鼠脑卒中的磁共振活体追踪

目的探索利用磁共振技术活体追踪干细胞的可行性以及干细胞对卒中大鼠脑梗死体积的影响。方法采集大鼠后肢股骨和胫骨骨髓,采用密度梯度离心法分离并培养骨髓间充质干细胞(BMSCs)。利用超顺磁性氧化铁和多聚左旋赖氨酸的混合物标记BMSCs,普鲁士蓝染色检测标记率。线栓法建立18只大鼠脑缺血2h再灌注动物模型,分为缺血对侧BMSCs移植组(细胞数1.5×105/15μl)、缺血同侧纹状体移植组(细胞数1.5×105/15μl)和对照组(15μlD-Hanks液)3组,每组6只。分别在脑缺血后第1天、细胞移植后第1天及第14天进行磁共振扫描,对各时间点梗死体积的变化进行统计学分析。结果超顺磁性氧化铁对BMSCs的标记率为96%。磁共振追踪显示移植后第14天缺血同侧移植组BMSCs向缺血灶边缘迁移,缺血对侧移植组BMSCs沿胼胝体弥散,但是3组之间的脑梗死体积变化差异无显著性(P>0.05)。结论超顺磁性氧化铁对干细胞标记率高,磁共振活体追踪有利于了解干细胞移植后的存活和迁移。BMSCs脑内移植对于卒中大鼠脑梗死体积的影响无统计学意义。     

骨髓间充质干细胞和心肌组织工程

目前对于心功能不全的治疗包括心脏移植、外科血运重建、机械和人工合成装置的替代以及新陈代谢的调整,这些治疗虽然已在临床应用,但都有局限性和并发症。各学科的发展为组织修复提供了更好的手段,随着工程学、材料学、生物制品的发展,组织工程学在维持和提高受损组织的功能方面也取得很大进步,其中包括心脏组织工程,即血管、心脏瓣膜和心肌组织工程。缺血性心脏病在我国发病率逐年提高,一般认为出生后心肌细胞即失去分裂能力,一旦损伤发生,则只能由成纤维细胞所填充,最终为瘢痕替代,逐步发生心室重构,最终导致心力衰竭。     

体外纳米磁标记骨髓间充质干细胞生物学特性及其MR成像

目的 研究超顺磁性氧化铁粒子(superparamagnetic iron oxide particles,SPIO)体外标记兔骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)及MR细胞成像示踪可行性.方法 从兔骨髓中分离培养MSCs,体外不同浓度SPIO联合硫酸鱼精蛋白标记,未标记细胞设为对照组.普鲁士蓝染色和电镜检查鉴定细胞内铁颗粒,台盼蓝染色检测细胞存活,MTF法测定细胞生长曲线的变化,磁标记MSCs转入成骨、成脂肪培养基中进行诱导培养后进行鉴定,应用1.5T MR梯度回波T2加权(GRE T2 *WI)扫描序列和自旋回波T2加权(SE T2WI)扫描序列对磁标记细胞成像示踪.结果 普鲁士蓝染色和电镜检查显示细胞质内含致密铁颗粒,磁标记对MSCs活性和增殖无统计学差异(P<0.05),标记细胞可正常成骨、成脂肪分化.GRE T2*WI序列和SE T2WI序列提示与未标记细胞信号强度(sI)相比,1×106(标记细胞)、5×105(标记细胞)SI均显著性下降(P<0.05),其中GRE T2*WI的信号强度衰减率(△SI)显著高于T2WI序列(P<0.05).在2个序列中1×106(标记细胞)△SI均高于5×105(标记细胞)△SI,但不具有显著性差异(P>0.05).结论 SPIO联合硫酸鱼精蛋白转染剂能成功标记MSCs,磁标记对细胞存活、增殖及潜在多向分化能力无影响.磁标记细胞在MR上产生特征性的低信号改变.应用1.5T MR成像示踪标记细胞可行,以GRE T2*WI序列成像最为敏感.     

骨髓间充质干细胞与心肌再生的研究进展

骨髓间充质干细胞在体内外某些特定的诱导因素下可以分化为心肌样细胞,从而改善心功能。     

骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的研究进展

摘要 心肌梗死(myocardialinfarction,MI)是心血管疾病中最常见且最严重的疾病,心肌梗死后心肌组织的损伤、 凋亡和不能再生的问题一直无法解决。在组织工程的研究中发现,通过干细胞治疗损伤的心肌组织从而改善心脏功能 是最理想的选择。骨髓间充质干细胞(bonemarrow mesenchymalstemcells,BMSCs)具有自我更新、多向分化、获取容 易、增殖迅速的生物学特性,同时具有旁分泌、抗炎抗纤维化、免疫抑制、促血管生成等作用,因此,BMSCs是治疗心血管 疾病的理想途径。诱导BMSCs向心肌细胞方向分化的方法包括化学、生物、物理等方法。该综述主要对BMSCs的生物 特性、作用机制以及在体外诱导 BMSCs向心肌细胞方向分化的方法进行了总结。     

干细胞的磁性标记及肝内活体磁共振示踪

目的:探讨超顺磁性氧化铁(SPIO)标记骨髓干细胞的方法和标记细胞在肝脏内的磁共振活体成像特点和衰减规律.方法:分离培养兔骨髓间充质干细胞,用SPIO标记细胞并在超声引导下局部注入兔肝脏内,然后经磁共振T1WI, T2WI和FFE序列进行移植细胞团的成像示踪.结果:体外标记的骨髓干细胞见黑色铁颗粒位于细胞胞质内,标记后细胞的生长曲线与正常细胞一致. 标记的移植细胞团在肝内T1WI, T2WI和FFE序列上均呈低信号,以FFE图像信号减低最为明显并有面积增大效应. 标记细胞的信号减低区在T1WI, T2WI和FFE序列图像上分别至注射后30, 30 和45 d仍和注射前信号差异有统计学意义(P＜0.05),并分别持续至注射后38, 38 和60 d低信号才消失.结论:SPIO可以简便、有效地标记骨髓干细胞,且对细胞的活性没有影响;MRI可对标记后的移植细胞进行活体内示踪,并可长期动态观察,这对进一步的实验研究和疗效观察研究具有重要意义.     

PEI2k-SPIO纳米颗粒标记大鼠骨髓间充质干细胞的体外磁共振成像

目的明确经修饰的多聚乙烯-超顺磁性氧化铁(PEI2k-SPIO)纳米颗粒体外标记大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的最佳浓度,以及标记后BMSCs的磁共振成像(MRI)特征、可成像的最低标记细胞量和最佳成像细胞量。方法取第二代大鼠BMSCs接种于投放有盖玻片的6孔板内,分别加入浓度为5μg/mL、7μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mL铁浓度的PEI2k-SPIO液,而后行普鲁士兰染色,观察不同标记浓度对细胞生物学活性的影响;采用四唑盐(MTT)比色法,分析不同浓度的PEI2k-SPIO液对大鼠BMSCs生长活性的影响,并确定PEI2k-SPIO纳米复合颗粒标记干细胞的最佳阈值;取最佳阈值的PEI2k-SPIO标记BMCSs,经磁共振成像,确定成像所需最低细胞量及最佳成像细胞量。结果 PEI2k-SPIO标记BMSCs的最佳浓度是7μg/mL,该标记浓度下细胞生物活性不受影响;在7μg/mL PEI2k-SPIO培养液标记浓度下,MRI的最低细胞量为1×104,最佳成像细胞量为1×106。结论适当浓度的PEI2k-SPIO标记BMSCs对其生物学活性没有影响,MRI可敏感显像PEI2k-SPIO标记的BMSCs。     

心肌微环境对胎盘间充质干细胞向心肌细胞分化的影响

目的 观察心肌微环境对胎盘间充质干细胞(human placenta-derived mesenchymal stem cells,hPDMSCs)向心肌细胞分化的影响.方法 用心肌细胞培养上清液模拟心肌微环境诱导hPDMSCs向心肌细胞分化,同时设置20％DMEM培养的对照组.每天于显微镜下观察细胞形态学变化,每两天台盼蓝拒染法计数细胞,免疫组织化学法检测α-横纹肌肌动蛋白的表达,免疫荧光法检测心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)的表达,RT-PCR法检测心钠素(atrial natriuretic factor,ANF)、β-肌球蛋白重链(beta-myocin heavy chain,β-MHC)mRNA的表达.结果 对照组细胞保持较快的增殖速度,不表达α-横纹肌肌动蛋白、cTn I、ANF、β-MHC;心肌细胞培养上清液模拟的心肌微环境组细胞增殖速度较慢,表达α-横纹肌肌动蛋白、cTn I、ANF、β-MHC.结论 心肌微环境能够诱导hPDMSCs向心肌细胞分化.     

干细胞因子对骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的影响

目的　探讨干细胞因子 (stemcellfactor,SCF)促进骨髓间充质干细胞 (mesenchymalstemcells,MSCs)向心肌细胞分化的作用。方法　在共培养前用DAPI标记MSCs,心肌细胞在培养的第 3天与MSCs共培养。对照组 :未施加任何干预的MSCs与心肌细胞共培养 ;研究组 :使用SCF对大鼠在体动员 ,提取其MSCs与心肌细胞共培养。用数码显微摄像及免疫荧光技术分别记录和检测心肌特异性肌节肌球蛋白重链 (cardiacmyosinheavychainα/ β,MHCα/ β)、肌钙蛋白T(troponinT ,TnT)的表达 ,分析DAPI-MSCs向心肌细胞分化的百分率。 结果　在共培养的第 2 ,3天 ,SCF处理的DAPI-MSCs表达MHC的阳性百分率为 (1 96± 0 33) %和 (4 76± 0 32 ) % ,显著高于对照组的 (0 5 2± 0 2 1) %和 (1 2 5± 0 4 7) % (P <0 0 1) ;在共培养的第 3,4 ,5天DAPI-MSCs表达TnT的阳性百分率分别为 (1 10± 0 15 ) % ,(2 6 4± 0 18) %和 (5 4 3± 0 2 4 ) % ,均显著高于对照组的 0 ,(1 2 7± 0 13) %和 (1 32±0 2 5 ) % (P <0 0 1)。结论　SCF对MSCs具有促分化作用。     

间充质干细胞修复心肌的旁分泌效应机制

1976年Friedenstein等报道了骨髓中存在克隆性生长的基质细胞,1991年Caplan等正式将这类细胞命名为骨髓间充质干细胞(BMSCs).BMSCs是具有自我更新、分化增殖和多向分化潜能的干细胞.许多研究显示,骨髓以外的其他器官中也广泛存在着结缔组织干细胞,体内所有这类干细胞统称为间充质干细胞(MSCs).因取材方便,自身移植无免疫排斥反应,MSCs被广泛应用在组织工程、细胞移植、基因治疗等临床方面.目前MSCs已成为一种理想的治疗心肌损伤的移植细胞[1].