川芎嗪对人脐静脉内皮细胞缺氧相关因子表达的影响

目的 观察川芎嗪(TMP)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)缺氧相关因子表达的影响.方法 体外培养HUVECs,取2～5代细胞进行实验.将HUVECs分为对照组、氯化钴(CoCl2)缺氧组及50、100、200 μmol/L TMP药物处理组.对照组不作任何处理.CoCl2缺氧组利用150 μmol/L的CoCl2干预HUVECs 4 h;50、100、200 μmol/L TMP药物处理组在CoCl2干预HUVECs 4 h后,再加入不同浓度TMP继续培养8h.分别提取各组细胞RNA和总蛋白,采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测脯氨酰羟化酶2(PHD2)、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)mRNA和蛋白的表达.结果 实时RT-PCR检测结果显示,与对照组比较,CoCl2缺氧组PHD2mRNA表达下降(t=3.734),HIF-1α和VEGF mRNA表达升高(t=4.589、3.926),差异均有统计学意义(P＜0.05).50、100、200 μmol/L TMP药物处理组分别与CoCl2缺氧组比较,PHD2 mRNA表达均升高(t=3.286、3.617、3.886),差异有统计学意义(P＜0.05);HIF-1α mRNA表达均无明显变化(t=1.025、0.726、-1.386),差异无统计学意义(P＞0.05);VEGF mRNA表达均有所下降,但50 μmol/L TMP药物处理组与之差异无统计学意义(t=1.696,P＞0.05),100、200 μmol/L TMP药物处理组与之差异有统计学意义(t=2.974、3.492,P＜0.05).Western blot检测结果显示,与对照组比较,CoCl2缺氧组PHD2蛋白表达下降,差异有统计学意义(t=3.122,P＜0.05);HIF-1α及VEGF蛋白表达均有不同程度升高,差异有统计学意义(t=3.778、3.257,P＜0.05).50、100、200 μmol/L TMP药物处理组分别与CoCl2缺氧组比较,PHD2蛋白表达均升高(t=2.813、3.026、3.078),差异有统计学意义(P＜0.05);HIF-1α、VEGF蛋白表达均有所下降,但50 μmol/L TMP药物处理组与之差异无统计学意义(t=2.056、1.986,P＞0.05),100 μmol/L TMP药物处理组(t=3.058、2.976)及200 μmol/L TMP药物处理组(t=3.828、3.136)与之差异有统计学意义(P＜0.05).结论 TMP能上调缺氧HUVECs中PHD2 mRNA和蛋白的表达,下调HIF-1α蛋白、VEGF mRNA和蛋白的表达.     

木犀草素对人脉络膜黑色素瘤细胞株C918血管生成拟态形成的影响

目的　探讨木犀草素对人脉络膜黑色素瘤细胞株C918血管生成拟态形成的影响及其可能的分子机制。方法　体外培养C918细胞,木犀草素0 μmol·L^-1、0.10 μmol·L^-1、6.25 μmol·L^-1、12.50 μmol·L^-1、25.00 μmol·L^-1、50.00 μmol·L^-1、100.00 μmol·L^-1、200.00 μmol·L^-1、400.00 μmol·L^-1作用细胞12 h、24 h后,CCK-8法测定光密度值,通过GraphPad Prism软件拟合量效曲线。根据IC₅₀值及实验目的,确定分组为对照组（木犀草素0 μmol·L^-1组）、木犀草素12.50 μmol·L^-1组、木犀草素25.00 μmol·L^-1组、木犀草素50.00 μmol·L^-1组。应用划痕实验和Transwell侵袭实验检测各组细胞迁移、侵袭能力。在Matrigel基质胶上三维培养C918细胞并行PAS染色,显微镜下观察各组细胞血管生成拟态形成情况。Western blot检测p-PI3K P85、AKT、p-AKT蛋白表达。结果　CCK-8实验结果显示,木犀草素呈浓度依赖性和时间依赖性抑制C918细胞活力,GraphPad Prism软件拟合量效曲线,确定木犀草素作用C918细胞12 h及24 h的IC₅₀值分别为163.70 μmol·L^-1和51.46 μmol·L^-1。划痕实验及Transwell细胞侵袭实验结果显示,各浓度木犀草素组细胞迁移速率、侵袭能力均明显低于对照组,差异有统计学意义（均为P<0.001）;木犀草素12.50 μmol·L^-1组和木犀草素25.00 μmol·L^-1组相比,细胞迁移速率差异无统计学意义（P＞0.05）;木犀草素25.00 μmol·L^-1组和木犀草素50.00 μmol·L^-1组相比,细胞侵袭能力差异无统计学意义（P＞0.05）;其余实验组间两两相比细胞迁移速率、侵袭能力差异均有统计学意义（均为P>0.05)。显微镜下观察发现,对照组和木犀草素12.50 μmol·L^-1组C918细胞形成环状结构,且糖原PAS染色阳性,两组之间环状结构数差异无统计学意义（P＞0.05）;木犀草素25.00 μmol·L^-1组和木犀草素50.00 μmol·L^-1组仅有部分细胞形成树枝样结构,无明显环状结构形成。Western blot检测结果显示,各浓度木犀草素组p-PI3K P85、p-AKT蛋白水平均较对照组明显下调,差异均有统计学意义（均为P<0.05）。结论　木犀草素可能是通过PI3K/AKT信号通路抑制C918细胞血管生成拟态形成的。     

二十二碳六烯酸对人视网膜色素上皮细胞中血红素氧合酶-1表达的诱导作用

背景 氧化应激是年龄相关性黄斑变性发生的重要机制.研究表明,二十二碳六烯酸(DHA)在视网膜光感受细胞的发育中发挥重要作用,并可上调血红素氧合酶1(HO-1)的表达,从而发挥抗氧化效应,但DHA是否能影响人视网膜色素上皮(RPE)细胞表达HO-1尚未阐明. 目的 观察DHA对体外培养的RPE中HO-1表达的影响及其分子机制. 方法 对人RPE细胞系ARPE-19进行培养,分别用30、50、100和120 μmol/L DHA作用4～24 h,以不含DHA培养的细胞作为对照组.采用乳酸脱氢酶(LDH)法检测DHA对细胞的毒性;分别采用实时荧光定量PCR和Western blot法检测各组细胞中HO-1 mRNA及其蛋白的相对表达;采用比色法分析各组细胞中HO-1酶活性变化情况;采用荧光探针H2DCFDA检测细胞中活性氧簇(ROS)的相对比例,并采用免疫荧光技术检测各组培养细胞中核转录因子-E2相关因子2(Nrf2)的核转位情况;分别采用ROS抑制剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)干预法和Nrf2小干扰RNA(siRNA)转染法作用于培养的细胞,采用Western blot法检测细胞中Nrf2蛋白的表达,并观察其对细胞中HO-1蛋白表达量的影响. 结果 0、30、50、100和120 μmol/L DHA作用于ARPE-19细胞后24 h,培养上清液中LDH漏出率的总体比较差异有统计学意义(F=8.14,P＜0.05),其中120 μmol/L DHA作用后细胞中LDH漏出率明显高于0、30、50、100 μmol/L DHA组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).不同浓度DHA作用ARPE-19细胞后8h,HO-1mRNA及其蛋白的相对表达量以及HO-1的酶活性总体比较差异均有统计学意义(F=16.24,P＜0.05;F=11.34,P＜0.05;F=11.81,P＜0.05),其中30、50、100 μmol/L DHA组细胞中HO-1 mRNA及其蛋白的相对表达量以及HO-1的酶活性均明显高于0μmol/L DHA组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).不同浓度DHA作用ARPE-19细胞后4h细胞内ROS相对荧光强度、细胞核Nrf2阳性细胞比例的总体比较差异均有统计学意义(F=11.08,P＜0.05;F=16.42,P＜0.05),其中30、50和100μmol/L DHA组细胞中ROS相对荧光强度、细胞核Nrf2阳性细胞比例均明显高于0μmol/L DHA组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).100 μ.mol/L DHA处理条件下,NAC预处理后细胞中HO-1蛋白的相对表达量和细胞核Nrf2阳性细胞比例均明显低于单纯100μmol/L DHA组,Nrf2 siRNA转染组细胞中HO-1的相对表达量和细胞核Nrf2阳性细胞比例均明显低于空白siRNA转染组,差异均有统计学意义(均P＜0.05). 结论 低于100 μmol/L的DHA可能通过ROS/Nrf2途径诱导RPE细胞表达HO-1,从而发挥对细胞的保护作用.     

苯丙氨酸促进人胚胎干细胞向视网膜色素上皮细胞高效分化的研究

目的 观察苯丙氨酸对胚胎干细胞(ESC)向视网膜色素上皮(RPE)细胞定向分化诱导效率的影响.方法 H1人ESC(hESC)分为对照组和实验组,以mTeSR培养基常规培养.细胞克隆过度融合后对照组以撤除碱性成纤维细胞生长因子、含10％ knockout血清替代物的培养基诱导hESC自主分化至第7周.实验组从第3周开始在诱导培养基中添加0.2 mmol/L苯丙氨酸培养至第7周.观察两组细胞形态学变化;实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测人类配对盒基因6(Pax6)、小眼球相关转录因子(MITF)、RPE65、酪氨酸酶(tyrosinase)、Wnt配体(Wnt3a)、淋巴样增强因子-1(Lef1)、转录因子7(Tcf7)基因mRNA的表达;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测MITF、RPE65蛋白的表达;流式细胞技术(FCM)检测RPE65阳性细胞比例.Sprague Dawley大鼠12只,随机分为对照组和治疗组;单眼内路法视网膜下腔注射,对照组注射2 μl 1倍磷酸盐缓冲液,治疗组注射2 μl纯化的hESC-RPE.治疗后6周行视网膜电图(ERG)检查,观察暗适应3.0 a-b波振幅.结果 诱导分化第7周,实验组出现大量肉眼可见的色素团块,明显多于对照组.色素化区域内可见多边形蜂窝状排列的单层细胞,胞质充满色素颗粒.RT-PCR检测结果显示,实验组Pax6、MITF、RPE65、tyrosinase(t=39.44、26.14、31.28、77.24)、Wnt3a、Lef1、Tcf7(t=46.11、27.69、17.42)mRNA表达量高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.01).Western blot检测结果显示,实验组MITF、RPE65蛋白表达量高于对照组.FCM检测结果显示,实验组、对照组RPE65阳性比例分为(18.91±1.76)％、(0.88±0.09)％;实验组RPE65阳性比较明显高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.01).ERG检查结果显示,治疗组大鼠暗适应3.0 a-b波振幅较对照组显著提高,差异有统计学意义(t=7.543,P＜0.01).结论 苯丙氨酸显著提高hESC向RPE定向诱导效率.hESC诱导来源的RPE细胞视网膜下移植能改善视网膜变性模型动物视功能.     

姜黄素对IL-1β诱导的兔RPE细胞中核因子-κB相关炎性因子表达的抑制作用

背景 白细胞介素-1β(IL-1β)是增生性玻璃体视网膜病变(PVR)早期释放的重要炎性因子,研究证实姜黄素能抑制IL-1β诱导的兔视网膜色素上皮(RPE)细胞的增生,但其是否能够对PVR发挥抗炎作用尚不清楚. 目的 观察姜黄素对IL-1β诱导的兔RPE细胞移行的影响,探讨姜黄素对IL-1β诱导的RPE细胞中炎性因子表达的影响.方法 采用对数生长期原代培养的第4代兔RPE细胞进行实验,在无血清DMEM培养基中分别添加0、0.1、1.0和10.0 μg/L的IL-1β作用于细胞24 h,分别采用Western blot和逆转录PCR法检测细胞中环氧合酶-2(COX-2)蛋白和mRNA的表达以筛选IL-1β最佳质量浓度.将培养的RPE细胞分为IL-1β组和姜黄素+IL-1β组,分别在无血清培养基中添加1.0 μg/L IL-1β和1.0μg/L IL-1β联合10 μg/ml姜黄素作用于细胞24、48和72 h,仅用无血清培养基培养的细胞作为对照组.培养的细胞行苏木精-伊红染色,于光学显微镜下计算进入损伤区的细胞数,比较各组细胞的移行能力;分别采用Western blot法和逆转录PCR法检测各组RPE细胞中COX-2蛋白及其mRNA的相对表达量,采用Western blot法检测并比较各组细胞中核因子-κBp65(NF-κBp65)蛋白和核因子κB抑制蛋白-α(IκB-α)的相对表达量;采用免疫化学染色法检测NF-κBp65、IκB-α和COX-2在各组RPE细胞中的表达和定位. 结果 初分离的兔RPE细胞呈球形,细胞中可见大量黑色素颗粒;第4代细胞色素颗粒明显减少,接近融合的细胞形态为长梭形,呈拉网状分布.免疫细胞化学染色法结果显示,细胞角蛋白(AE1/AE3)在细胞质呈阳性表达.对照组在培养24、48和72 h移行的细胞数分别为(31.93±1.21)、(36.27±2.50)和(38.33±2.40)个,IL-1β组分别为(45.73±2.30)、(71.13±1.92)和(80.60±1.71)个,而姜黄素+IL-1β组分别为(13.13±2.20)、(14.93±1.10)和(12.60±1.51)个,各时间点IL-1β组细胞移行细胞数均明显高于对照组,而姜黄素+IL-1β组移行细胞数均明显低于对照组和IL-1β组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).IL-1β质量浓度为1.0 μg/L时,RPE细胞中COX-2蛋白及其mRNA的相对表达量达峰,以1.0 μg/L IL-1β的剂量进行后续实验.细胞培养后24、48和72 h,姜黄素+IL-1β组细胞中COX-2蛋白及其mRNA的相对表达量均明显低于IL-1β组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).IL-1β作用于细胞后48 h,细胞中NF-κBp65蛋白的相对表达量最高,与IL-1β组相比,各时间点姜黄素+IL-1β组细胞中NF-κBp65蛋白相对表达量降低,差异均有统计学意义(均P＜0.05).IL-1β组药物作用于细胞后48 h细胞中IκB-α降至最低,各时间点姜黄素+IL-1β组细胞中IκB-α值均明显高于IL-1β组,差异均有统计学意义(均P＜0.05).免疫细胞染色结果显示,IL-1β组RPE细胞的细胞核及细胞质中NF-κBp65呈强阳性表达,对照组表达较弱,姜黄素+ IL-1β组细胞中NF-κBp65的表达强度较IL-1β组明显降低;与对照组相比,IL-1β组细胞的细胞质中IκB-α表达强度明显减弱,而COX-2表达明显增强;与IL-1β组比较,姜黄素+IL-1β组细胞中IκB-α表达明显增强,而COX-2表达明显减弱.结论 姜黄素可抑制IL-1β引起的兔RPE细胞的移行,IL-1β通过激活NF-κB信号通路刺激细胞中COX-2的表达,姜黄素可通过阻断这一途径而抑制炎性因子的表达,从而发挥抗炎作用.     

白藜芦醇对人视网膜母细胞瘤细胞侵袭能力的影响及机制研究

目的研究白藜芦醇(resveratrol,Res)对人视网膜母细胞瘤SO-RB50细胞侵袭能力的影响,探讨Res抑制视网膜母细胞瘤细胞侵袭力的相关机制。方法分别用6.25μmol·L-1、12.50μmol·L-1、25.00μmol·L-1、50.00μmol·L-1、100.00μmol·L-1Res处理视网膜母细胞瘤SO-RB50细胞,对照组加等量5g·L-1二甲基亚砜,孵育48h后,细胞划痕实验测定细胞迁移抑制率;分别用上述浓度的Res处理视网膜母细胞瘤细胞16h,Transwell小室侵袭实验测定细胞侵袭抑制率;50.00μmol·L-1Res处理细胞48h,采用RT-PCR和Western blotting方法分别测定基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、基质金属蛋白酶组织抑制剂-1(TIMP-1)和基质金属蛋白酶组织抑制剂-2(TIMP-2)mRNA和蛋白表达。结果 6.25μmol·L-1、12.50μmol·L-1、25.00μmol·L-1、50.00μmol·L-1、100.00μmol·L-1Res可明显抑制视网膜母细胞瘤细胞的迁移和侵袭;与对照组比较,50.00μmol·L-1Res处理细胞48h后,Res处理组MMP-2和MMP-9mRNA[对照组和Res处理组分别为(1.16±0.31、0.98±0.26和0.49±0.09、0.59±0.08)]及蛋白[对照组和Res处理组分别为(0.97±0.24、0.78±0.18和0.46±0.07、0.29±0.06)]的表达和活性均显著下降,TIMP-1和TIMP-2mRNA[对照组和Res处理组分别为(0.35±0.06、0.37±0.07和0.79±0.11、0.93±0.25)]及蛋白表达[对照组和Res处理组分别为(0.36±0.07、0.32±0.06和0.89±0.15、0.78±0.13)]均显著上升(均为P<0.05)。结论 Res通过下调MMP-2和MMP-9及上调TIMP-1和TIMP-2的表达来发挥抑制视网膜母细胞瘤细胞侵袭的作用。     

小檗胺诱导体外培养的视网膜母细胞瘤HXO-RB44细胞凋亡的研究

[目的]观察探讨小檗胺(BBM)对体外培养的视网膜母细胞瘤(RB) HXO-RB44细胞增生和凋亡的影响及其机制.[方法]体外培养RB细胞,取对数生长期细胞分为BBM处理组和空白对照组.BBM处理组分别加入2、4、8、16、32 mg/L BBM,作用24、48、72 h后,四氮唑(MTT)比色法检测细胞增生活性;4、8、16 mg/L BBM作用24 h后,流式细胞仪检测细胞早期细胞凋亡率,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞内B细胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)、Bax蛋白的表达,比色法检测半胱氨酸蛋白酶-3 (Caspase-3)的活性.[结果]BBM以时间-剂量依赖方式显著抑制RB细胞的增生(24 h:F=70.547,48 h:F=603.438,72 h:F=577.521;P＜0.01).作用24、48、72 h,半数抑制浓度分别为25.26、10.94、6.25 mg/L.空白对照组和不同浓度BBM处理组细胞坏死率分别为(1.25±0.45)％、(4.10±2.95)％、(4.39±0.21)％、(10.54±4.38)％,与空白对照组比较,差异有统计学意义(F=6.527,P＜0.05);晚期凋亡和坏死率分别为(2.13±0.71)％、(5.45±2.31)％、(9.86±3.18)％、(11.10±1.70)％,与空白对照组比较,差异有统计学意义(F=10.845,P＜0.05):早期凋亡率分别为(0.51±0.26)％、(2.68±0.35)％、(5.97±0.50)％、(11.22±1.17)％,与空白对照组比较,差异有统计学意义(F=144.976,P＜0.01).BBM剂量依赖性地减少bc1-2的表达,增加Bax的表达,降低bcl-2/Bax比值,增强Caspase-3活性,差异均有统计学意义(bcl-2:F=835.726,Bax:F=111.963,Caspase-3:F=298.058;P＜0.01).[结论]BBM体外能抑制RB细胞增生并诱导细胞凋亡或坏死.其机制可能与下调bcl-2的表达,上调Bax的表达,并增强Cspase-3的活性有关.     

花色苷对高糖培养的视网膜Müller细胞L-谷氨酸/L-天门冬氨酸转运体表达的影响

目的 观察花色苷对体外高糖培养的视网膜Müller细胞L-谷氨酸/L-天门冬氨酸转运体(GLAST)表达的影响.方法 取出生后10 d的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠视网膜组织,体外原代培养Müller细胞.第2～4代细胞用于实验.将实验分为正常对照组(A组)、高糖对照组(B组)、高糖+30 μmol/L花色苷组(C组)、高糖+60 μmol/L花色苷组(D组)、高糖+100μmol/L花色苷组(E组)进行.采用噻唑蓝比色法(MTT)测定波长570 nm处的吸光度[A,旧称光密度(OD)]值,以各组A值计算细胞相对存活率.采用免疫蛋白印迹法(Western blot)检测各组大鼠视网膜Müller细胞上GLAST的蛋白表达.结果 MTT检测显示,A、B、C、D、E组A值分别为0.450 8±0.020 4、0.270 1±0.031 4、0.332 0±0.023 2、0.428 3±0.017 2、0.361 9±0.027 0,细胞相对存活率分别为100.0%、59.9%、73.6%、95.0%、80.3%.其中,C、D、E组A值均较B组增高,差异有统计学意义(F=32.25,P＜0.05);D组A值较C、E组显著增高,差异也有统计学意义(F=21.07,P＜0.05).Western blot检测显示,B组大鼠视网膜Müller细胞的GLAST蛋白表达较A组降低,差异有统计学意义(t=5.25,P＜0.05);A、C、D、E组间大鼠视网膜Müller细胞的GLAST蛋白表达无明显变化,差异无统计学意义(F=2.979,P＞0.05).结论 花色苷可逆转高糖引起的Müller细胞GLAST蛋白表达下降.

Abstract：

Objective To observe the effect of cyanin on the expression of L-glutamate/ L-aspartate transporter (GLAST) in high glucose cultured retina Müller cells. Methods The retinal tissue of SpragueDawley (SD) rats was collected at postnatal 10 day, and Müller cells were isolated and cultured according to literature. The Müller ceils (2nd-4th generations) were treated with five different medium as normal group (group A), high glucose control group (group B), high glucose+30 μmol/L cyanin group (group C), high glucose+60 μmol/L cyanin group (group D) and high glucose+100 μmol/L cyanin group (group E). Cell relative survival rates (A value) were measured by MTT assay at 570 nm. The GLAST protein expression in M011er cells was observed by Western blot. Results MTT assay showed that the A value of the five group were 0. 450 8±0. 020 4, 0. 270 1±0. 031 4, 0. 332 0±0. 023 2, 0. 428 3±0. 017 2, 0. 361 9±0. 027 0,the cell relative survival rate were 100. 0%, 59. 9%, 73.6%, 95%, 80.3% respectively. The A value of group C, D, E were significantly higher than that of group B (F=32.25, P<0.05), the A value of group D were significantly higher than that of group C and E (F=21.07, P<0. 05). Western blot showed that the GLAST protein expression of group B was lower than that of group A (t=5.25, P<0. 05) ; there was no obvious changes of GLAST protein expression in group A, C, D and E (F= 2. 979, P>0.05).Conclusion Cyanin can rescue high glucose-induced GLAST reduction.     

组织因子靶向肽对蓝光诱导的人视网膜色素上皮细胞损伤的保护作用

背景 视网膜光损伤可造成视网膜色素上皮(RPE)细胞损伤,是影响年龄相关性黄斑变性(AMD)发生和发展的重要因素之一.研究表明,组织因子(TF)在氧化损伤的RPE细胞中和AMD患者的脉络膜新生血管(CNV)中呈高表达,推测抑制TF可预防RPE细胞的损伤以及抑制CNV. 目的 观察TF靶向肽(TF-TP)对蓝光诱导的人RPE细胞损伤的保护作用. 方法 体外分离和培养人RPE细胞并分为空白对照组、蓝光照射组和TF-TP组.空白对照组细胞在常规条件下进行处理;蓝光照射组细胞用辐照强度为(4.0±0.5)mW/cm2的蓝光照射12h建立蓝光损伤细胞模型;TF-TP组先分别用不同浓度(10、100、150、200、300 μmol/L)TF-TP培养细胞24 h,再用蓝光照射12h.采用CCK-8法检测各组细胞的存活率;分别在普通倒置显微镜和透射电子显微镜下观察RPE细胞的形态和超微结构变化;采用Hoechst染色法检测各组细胞的凋亡情况;采用Western blot法检测各组细胞中TF蛋白和相关凋亡蛋白bax和bcl-2的表达.结果 不同浓度TF-TP组间RPE细胞存活率比较,差异无统计学意义(F=2.15,P=0.11).空白对照组、蓝光照射组和150 μmol/L TF-TP组细胞存活率分别为(100.0±0.00)％、(43.79±6.55)％和(63.45±3.57)％,150 μmol/LTF-TP组细胞存活率较蓝光照射组明显增加,差异有统计学意义(P=0.00),以150.μmol/L TF-TP为后续实验的最适浓度.光学显微镜下和透射电子显微镜下显示,蓝光照射组有较多皱缩、变形、悬浮细胞,可见细胞微绒毛数量减少,部分线粒体嵴断裂和缺失以及细胞空泡样变性,而150 μmol/L TF-TP组异常形态的细胞较少,细胞绒毛结构较完整,细胞质中空泡样结构改变和线粒体损伤改变明显减轻.空白对照组、蓝光照射组和150 μmol/L TF-TP组细胞凋亡率分别为(0.98±0.19)％、(9.98±0.82)％和(5.73±0.88)％,组间总体比较差异有统计学差异(F=206.18,P=0.00),其中150 μmol/L TF-TP组细胞凋亡率明显低于蓝光照射组,差异有统计学意义(P＜0.05).与空白对照组相比,蓝光照射组细胞中bax蛋白和TF蛋白的相对表达量明显增加,bcl-2蛋白的相对表达量显著下降,差异均有统计学意义(均P＜0.05);与蓝光照射组相比,150 μmol/L TF-TP组细胞中bax蛋白和TF蛋白的相对表达量均明显下降,而bcl-2蛋白的相对表达量明显增加,差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论 TF-TP预处理后可减少蓝光损伤的人RPE细胞的凋亡及增加细胞的存活率,从而对蓝光诱导的人RPE细胞损伤发挥保护作用,其作用机制可能与TF-TP抑制TF介导的bax/bcl-2凋亡通路有关.     

雷帕霉素对缺氧损伤视网膜神经节细胞的保护作用及其机制

背景 研究表明雷帕霉素(Rapa)可延缓人大脑细胞的衰老,改善大鼠局灶性脑缺血时脑组织代谢活动,对中枢神经细胞具有保护作用.视神经和视网膜神经节细胞(RGCs)属于中枢神经组织,但Rapa是否可对外伤后RGCs具有保护作用尚不清楚. 目的 探讨Rapa对氯化钴(CoCl2)诱导的缺氧损伤大鼠RGCs的保护作用,并探讨其可能的作用机制,为外伤性视神经病变(TON)的治疗提供新的思路.方法 用含体积分数10％胎牛血清的DMEM培养基培养大鼠RGC-5细胞,倒置相差显微镜下观察培养细胞的形态学变化.将细胞分为正常对照组及50、100、200、400和600 μmol/L CoCl2组,于细胞培养后24 h和48 h采用细胞生长分析系统检测各组细胞存活率.采用200 μmol/L CoCl2处理细胞以诱导建立RGC-5细胞缺氧损伤模型,然后将培养的细胞分为正常对照组、模型对照组和不同浓度Rapa干预组,Rapa干预组在缺氧模型细胞培养液中添加Rapa使其终浓度分别为0.1、0.4、1.6和6.4μmol/L,处理细胞24 h.采用细胞生长分析系统检测各组细胞的存活率;采用AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术检测各组细胞凋亡率;采用JC-1染色技术检测各组细胞线粒体跨膜电位(△ψm)的变化;采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞促凋亡基因bax mRNA的相对表达量. 结果 200 μmol/L CoC12作用RGC-5细胞后24 h细胞相对存活率为(70.51±5.00)％,与正常对照组的(100.00±3.29)％比较,差异有统计学意义(P＜0.01),成功构建细胞缺氧损伤模型.正常对照组、模型对照组和0.1、0.4、1.6、6.4 μmol/L Rapa干预组细胞存活率的总体比较差异有统计学意义(F=167.904,P=0.000),其中0.1μmol/L Rapa干预组细胞存活率明显高于模型对照组,差异有统计学意义(P＜0.05).正常对照组、模型对照组和0.1μmol/L Rapa干预组细胞凋亡率分别为25.4％、37.7％和25.3％,细胞线粒体膜电位分别下降了0.4％、6.3％和1.4％.正常对照组、模型对照组和0.1 μmol/L Rapa干预组细胞中baxmRNA相对表达量分别为1.01±0.21、3.52±0.30和1.66±0.20,总体比较差异有统计学意义(F=88.034,P=0.000),其中模型对照组细胞中bax mRNA相对表达量均明显高于正常对照组和0.1μmol/L Rapa干预组,差异均有统计学意义(均P＜0.05). 结论 Rapa可对CoC12诱导的缺氧RGC-5细胞发挥保护作用,其主要作用机制是下调细胞中促凋亡分子bax的表达,并提高RGC-5细胞存活率.     

全氟萘烷液在眼内应用的实验研究

目的 探讨全氟萘烷(PFDL)在眼内存留不同时期眼组织结构、电生理改变及相关损伤机制.方法 选择白兔前房及玻璃腔内填充不同数量的PFDL,分别于术后6h、24h、72h、7d、30d、60d,对角膜和视网膜进行透射电镜检查,及角膜内皮镜和电生理检查.结果 术后24h到术后7d,观察到的病理改变为细胞水肿等变性反应;术后第30d、60d出现角膜内皮细胞密度显著下降,b波的振幅显著降低,角膜上皮及实质细胞坏死,细胞内质网扩张、脱颗粒,视网膜感光细胞膜盘变性、萎缩和坏死,细胞间及神经纤维层树突水肿等严重的不可逆的病理改变,在角膜内皮细胞和视网膜感光细胞发现有髓磷体的存在.结论 PFDL在眼内存留24h以上对视网膜及角膜有一定的毒性作用,其毒性作用机制与PFDL的重力压迫作用、产生自由基和PFDL破坏组织细胞的能量代谢有关,临床上不宜作眼内长期填充物.     

川芎嗪对氧诱导视网膜病变中视网膜神经细胞凋亡的抑制作用

Objective To observe the inhibitory effect of tetramethylpyrazine(TMP)on apoptosis of retinal neurons in oxygen-induced retinopathy(OIR).Methods 48 C57BL/6 mice were randomly divided into normal control group(n=18),OIR control group(n=18)and OIR TMP group(n=12).The mice of normal control group were raised in room air.From the postnatal day 7(P7),mice of the other two groups mice of OIR TMP group received intraperitoneal injection of TMP(200 mg/kg)once a day from P12 to P16.meanwhile the mice of normal control group and OIR control group were iniected with the same volume of normal saline containing of 0.1% DMSO.At P12,P14 and P17,the morphologic changes in retinal avascular zone and the number of retinal apoptotic cell were observed by HE staining and TUNEL assay.Results At P1 2.there were a few of chromatin condensation and pycnic nuclei in the inner nuclear layer (INL)of OIR control group.At P14,a great quantity(OIR control group)or some(OID TMP treated group)chromatin condensation and pycnic nuclei in the central INL were observed.At P17,the thickness of INL,inner plexiform layer(IPL)and outer plexiform layer(OPL)in the OIR control group were reduced;the thickness of INL,IPL and OPL in the OIR TMP group weas thinner than those in the normal control group and thicker than those in the OIR control group.At P12,the TUNEL-positive cells in the OIR control group was 6 times of the normal eontrol group(F=587.217,P＜0.001).At P14,the difference of TUNEL-positive cells in three groups was significant(F=587.217,P＜0.001);the TUNEL-positive cells in the OIR control group was 28 times of the normal control group(t=49.813,P＜0.001);the TUNEL-positive cells in the OIR TMP group has reduced 50% compared with the OIR controI group(t=42.434,P＜0.00 1).At P17,there was no significant difference in TUNEL-positive cells among the three groups (F=587.217,P>0.05).Conclusions TMP can inhibit apoptosis of retinal cells in OIR significantly.     

川芎嗪对氧诱导视网膜病变中视网膜神经细胞凋亡的抑制作用

Objective To observe the inhibitory effect of tetramethylpyrazine(TMP)on apoptosis of retinal neurons in oxygen-induced retinopathy(OIR).Methods 48 C57BL/6 mice were randomly divided into normal control group(n=18),OIR control group(n=18)and OIR TMP group(n=12).The mice of normal control group were raised in room air.From the postnatal day 7(P7),mice of the other two groups mice of OIR TMP group received intraperitoneal injection of TMP(200 mg/kg)once a day from P12 to P16.meanwhile the mice of normal control group and OIR control group were iniected with the same volume of normal saline containing of 0.1% DMSO.At P12,P14 and P17,the morphologic changes in retinal avascular zone and the number of retinal apoptotic cell were observed by HE staining and TUNEL assay.Results At P1 2.there were a few of chromatin condensation and pycnic nuclei in the inner nuclear layer (INL)of OIR control group.At P14,a great quantity(OIR control group)or some(OID TMP treated group)chromatin condensation and pycnic nuclei in the central INL were observed.At P17,the thickness of INL,inner plexiform layer(IPL)and outer plexiform layer(OPL)in the OIR control group were reduced;the thickness of INL,IPL and OPL in the OIR TMP group weas thinner than those in the normal control group and thicker than those in the OIR control group.At P12,the TUNEL-positive cells in the OIR control group was 6 times of the normal eontrol group(F=587.217,P＜0.001).At P14,the difference of TUNEL-positive cells in three groups was significant(F=587.217,P＜0.001);the TUNEL-positive cells in the OIR control group was 28 times of the normal control group(t=49.813,P＜0.001);the TUNEL-positive cells in the OIR TMP group has reduced 50% compared with the OIR controI group(t=42.434,P＜0.00 1).At P17,there was no significant difference in TUNEL-positive cells among the three groups (F=587.217,P>0.05).Conclusions TMP can inhibit apoptosis of retinal cells in OIR significantly.     

全氟萘烷液在眼内应用的实验研究

目的 探讨全氟萘烷(PFDL)在眼内存留不同时期眼组织结构、电生理改变及相关损伤机制.方法 选择白兔前房及玻璃腔内填充不同数量的PFDL,分别于术后6h、24h、72h、7d、30d、60d,对角膜和视网膜进行透射电镜检查,及角膜内皮镜和电生理检查.结果 术后24h到术后7d,观察到的病理改变为细胞水肿等变性反应;术后第30d、60d出现角膜内皮细胞密度显著下降,b波的振幅显著降低,角膜上皮及实质细胞坏死,细胞内质网扩张、脱颗粒,视网膜感光细胞膜盘变性、萎缩和坏死,细胞间及神经纤维层树突水肿等严重的不可逆的病理改变,在角膜内皮细胞和视网膜感光细胞发现有髓磷体的存在.结论 PFDL在眼内存留24h以上对视网膜及角膜有一定的毒性作用,其毒性作用机制与PFDL的重力压迫作用、产生自由基和PFDL破坏组织细胞的能量代谢有关,临床上不宜作眼内长期填充物.     

正确合理使用糖皮质激素:一个眼底病治疗中仍需重视的问题

糖皮质激素是临床上治疗眼底疾病的重要手段之一,除了抑制炎症反应以外,近年来也被用来治疗各种病因引起的黄斑水肿、脉络膜新生血管等;为增加局部药物浓度,减少全身副作用,给药途径也更多地采用球周和玻璃体腔注射等.但是随着该类药物的应用范围扩大,由此而引起的临床问题也逐渐增多.正确合理使用糖皮质激素,仍然是一个眼底病治疗中值得重视的问题.临床医生在决定应用糖皮质激素治疗眼底病之前,应尽可能明确疾病诊断,充分了解糖皮质激素的药理特点,正确掌握适应证,明确并发症和禁忌症,重视球周和玻璃体腔注射等局部给药途径的局部和全身影响,从而充分发挥糖皮质激素的治疗作用,最大限度地减少其并发症的发生.     

正确合理使用糖皮质激素:一个眼底病治疗中仍需重视的问题

糖皮质激素是临床上治疗眼底疾病的重要手段之一,除了抑制炎症反应以外,近年来也被用来治疗各种病因引起的黄斑水肿、脉络膜新生血管等;为增加局部药物浓度,减少全身副作用,给药途径也更多地采用球周和玻璃体腔注射等.但是随着该类药物的应用范围扩大,由此而引起的临床问题也逐渐增多.正确合理使用糖皮质激素,仍然是一个眼底病治疗中值得重视的问题.临床医生在决定应用糖皮质激素治疗眼底病之前,应尽可能明确疾病诊断,充分了解糖皮质激素的药理特点,正确掌握适应证,明确并发症和禁忌症,重视球周和玻璃体腔注射等局部给药途径的局部和全身影响,从而充分发挥糖皮质激素的治疗作用,最大限度地减少其并发症的发生.     

白藜芦醇对糖尿病视网膜血管病变的作用

目的 观察白藜芦醇对糖尿病视网膜血管病变的作用。方法 健康Sprague-Dawley雄性大鼠45只，随机分为白藜芦醇治疗组、治疗对照组及正常对照组，每组15只大鼠。白藜芦醇治疗组、治疗对照组大鼠股静脉注射链脲佐菌素（STZ）溶液建模，正常对照组大鼠股静脉注射等量无菌生理盐水。白藜芦醇治疗组、治疗对照组大鼠给予高脂饲料喂养。白藜芦醇治疗组每天以75 mg/kg的剂量灌胃白藜芦醇2次，治疗对照组每天以等体积无菌水灌胃2次；均正常摄食、摄水。持续治疗4个月后，各组大鼠经股静脉采血2 ml,采集房水50 μl。检测空腹血糖、房水葡萄糖、血浆胆固醇及血浆甘油三酯水平。利用伊凡思蓝（EB）测定各组大鼠视网膜血管通透性。分离大鼠视网膜，观察各组大鼠视网膜血管中周细胞数量的变化；提取总蛋白，采用蛋白质免疫印迹法（Western blot）检测各组大鼠视网膜中血管内皮生长因子（VEGF）的表达。结果 持续治疗4个月后，3组大鼠空腹血糖、房水葡萄糖、血浆总胆固醇及血浆甘油三酯水平比较，治疗对照组较正常对照组明显升高；白藜芦醇治疗组与治疗对照组比较，除血浆总胆固醇无明显差异外，其余指标均明显降低；3组间各指标差异均有统计学意义（F=152.809、65.230、3.861、15.059，P＜0.05）。3组大鼠视网膜血管通透性比较，治疗对照组较正常对照组高，白藜芦醇治疗组较治疗对照组低；3组间差异有统计学意义（F=11.626，P＜0.05）。3组大鼠视网膜血管中周细胞数量比较，治疗对照组较正常对照组明显减少，白藜芦醇治疗组较治疗对照组明显增加；3组间差异有统计学意义（F=43.284，P＜0.05）。3组大鼠视网膜VEGF表达水平比较，治疗对照组较正常对照组明显升高，白藜芦醇治疗组较治疗对照组明显降低；3组间差异有统计学意义（F=14.017，P＜0.05）。结论 白藜芦醇能通过降低空腹血糖、房水葡萄糖及血浆甘油三酯水平，抑制VEGF高表达而改善糖尿病视网膜血管的结构和功能异常。     

普罗布考治疗高血脂非增生型糖尿病视网膜病变疗效观察

目的 观察普罗布考治疗高血脂非增生型糖尿病视网膜病变(DR)的临床效果.方法 临床确诊为高血脂非增生型DR的52例患者104只眼纳入研究.将患者随机分为普罗布考治疗组(治疗组)和对照组,分别为26例52只眼.给予两组患者饮食、运动指导的同时进行口服降糖药和(或)胰岛素强化治疗.治疗组在控制血糖、血压基础上给予普罗布考0.5g,2次/d;对照组在控制血糖、血压基础上口服阿托伐他汀10 mg,1次/d.总疗程12个月.治疗前及治疗后1、3、6、12个月,所有患者均行视力、检眼镜、荧光素眼底血管造影、相关血液及尿液检查.对比观察治疗前后两组患者视力、眼底、黄斑水肿、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDLC)及8-羟基脱氧鸟苷(8-0HdG)的变化情况.结果 治疗后治疗组、对照组视力预后总有效率分别为44.23％、40.38％,二者比较,差异无统计学意义(Z＝-0.335,P＞0.05).治疗组、对照组视网膜出血及微动脉瘤均较治疗前减轻,其眼底预后总有效率分别为65.38％、36.54％,二者比较,差异有统计学意义(Z=-2.973,P＜0.05).治疗组、对照组合并黄斑水肿分别为6、5只眼,均较治疗前显著减少,差异有统计学意义(x2=4.833、4.300,P＜0.05);两组合并黄斑水肿眼数比较,差异无统计学意义(x2 =0.102,P＞0.0S).治疗后12个月,治疗组(t=15.653、7.634、14.871)、对照组(t=13.275、7.415、13.632)TG、TC和LDLC均较治疗前有所降低,差异有统计学意义(P＜0.05);HDLC较治疗前无明显变化,差异无统计学意义(t=0.584、0.275,P＞0.05).治疗组、对照组之间TG、TC、LDLC、HDLC比较,差异均无统计学意义(t=1.857、0.133、1.671、0.875,P＞0.05).治疗后1、3、6、12个月,治疗组(t=7.352、15.581、27.324、28.143)及对照组(t=6.877、8.672、14.671、14.855)8-0HdG较治疗前呈逐渐降低趋势,差异有统计学意义(P＜0.05).治疗后1个月,治疗组及对照组8-0HdG比较,差异无统计学意义(t=0.513,P＞0.05);治疗后3、6、12个月,治疗组8-0HdG较对照组降低,差异有统计学意义(t=3.434、5.917、5.226,P＜0.05).结论 普罗布考治疗高血脂非增生型DR可降低血脂、稳定视功能、减轻黄斑水肿.     

中药单提成分对视网膜组织细胞药物干预作用研究

目的：筛选对视网膜组织细胞具有药物保护作用的中药成分。方法：体外细胞培养,新生儿小牛视网膜细胞县液为研究对象,SFA,苦参碱,青藤碱1紫草素为处理因素,维拉帕米和神经生长因子（NGF）为处理对照,行细胞培养24小时后MTT法检测细胞增活性。结果：SFA对视网膜组织细胞有明显的促增殖作用,且呈剂量依赖关系;苦参碱轻度促进视网膜组织细胞增殖,青藤碱,维拉帕米和NGF轻度抑制视网组织细胞增殖;而紫草素则低浓度时抑制,高浓度时促进视网膜组织细胞增殖,结论SFA,若参碱对视网膜组织细胞具有较好的药物保护作用。     

青光眼药物使用中的误区

药物治疗是青光眼治疗中的重要手段,本文针对部分医师对青光眼药物的选择、用药时机、用药后效果的评价和对待患者正确用药教育等方面的误区进行讨论,以利于提高青光眼药物治疗的水平。